miR-208a-3p反义核酸在治疗心肌缺血再灌注损伤中的应用的制作方法

mir-208a-3p反义核酸在治疗心肌缺血再灌注损伤中的应用
技术领域：
1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种mir-208a-3p反义核酸在治疗心肌缺血再灌注损伤中的应用。


背景技术：

2.心肌缺血后再灌注损伤(miri)指冠状动脉部分或完全急性阻塞后，在一定时间又重新获得再通时，缺血心肌虽然得以恢复正常灌注，但其组织损伤反而呈进行性加重的病理过程。缺血期引起的心肌超微结构、能量代谢、心功能和电生理等一系列损伤性变化，在血管再通后表现得更为突出，甚至可发生严重的心律失常而导致猝死。心内直视手术、冠状动脉搭桥术、冠状动脉腔内成形术、溶栓术后以及心肌内侧支循环血量突然增加等情况下，都可发生心肌缺血后再灌注损伤。对其发生机制认为主要与细胞内氧自由基的大量产生、钙离子超负荷、白细胞的炎症作用及高能磷酸化合物缺乏等有关。随着冠脉介入治疗的普及，心肌缺血再灌注损伤成了一个不可避免的问题。针对心肌缺血再灌注损伤，相关技术中常用钙离子拮抗剂、β-受体拮抗剂、氧自由基清除剂等药物，来预防和控制因心肌缺血再灌注损伤所诱发心律失常、心猝死和心脏顿抑所致的心功能减退等心血管减退等心血管疾病的发生，但至今未获得真正满意的结果。因此，研发能减轻心肌缺血再灌注损伤的药物具有重大意义。
3.microrna(mirnas)是一类广泛存在于真核生物和病毒中的一类非编码小rna，约由18-22个核苷酸构成。mirnas是基因表达的负性调节者，可与靶基因3，端非编码区mrna的碱基互补配对形成沉默复合体(risc)，进一步降解mrna或阻遏其翻译。由于其自身是一类非编码rna，自身不具备翻译蛋白能力。近年多项研究表明研究表明，mirnas直接参与心肌细胞死亡的调控，从而影响心肌缺血损伤的严重程度。有些mirna也具备组织特异性，即它只在特定细胞中表达而不在其他组织器官中表达。mir-208a作为一类微小rna，是特异性表达在心脏组织中，尤其是心肌细胞发挥作用，其主要是以3p段发挥作用。本设计的反义核酸可以在心肌细胞特异性结合mir-208a-3p，抑制其功能达到治疗效果，而且由于mir-208a-3p只表达在心脏中不表达在其他器官。特异性的反义核酸只能针对mir-208a-3p，不会影响其他器官的功能。解决了传统药物非特异性以及副作用大的情况。


技术实现要素：

4.(一)解决的技术问题
5.针对上述背景，本发明通过提出mir-208a-3p反义核酸在治疗心肌缺血再灌注损伤中的应用，旨在解决传统心肌缺血再灌注损伤药物治疗效果不理想的技术问题，为心肌缺血再灌注损伤的治疗开辟更广阔的前景。
6.(二)技术方案
7.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
8.mir-208a-3p反义核酸在治疗心肌缺血再灌注损伤中的应用，所述mir-208a-3p的
自身核苷酸序列为mirbase中登记号为ids:mimat0000520的序列。
9.所述mir-208a-3p反义核酸序列和所述mir-208a-3p的自身核苷酸序列形成互补序列；
10.所述mir-208a-3p反义核酸的序列为tattctgctcgtttttcgaacatt。
11.进一步地，所述mir-208a-3p反义核酸的提取方法为：
12.s1、脱保护
13.使用二氯乙酸或者三氯乙酸的二氯甲烷溶液去除寡核苷酸上的5
”‑
dmt保护基团，暴露5
”‑
oh，以供下一步偶联；
14.s2、偶联
15.待合成的亚磷酰胺单体与活化剂四唑混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体，脱保护的5
”‑
oh会与亚磷酰胺四唑活性中间体，形成新的磷氧键，并脱去四唑，在这一步核苷酸链得到延伸；
16.s3、氧化
17.偶联反应生成的亚磷酯键，易被酸、碱水解，因此将此处三价磷氧化(硫化)为五价的磷，被氧化后形成的磷酸二酯(或硫代膦酸二酯)键，磷酸二酯键(或硫膦二酯)上有一个2-氰乙基保护，使磷酸二酯键在后续的合成中更稳定；
18.s4、加帽
19.为了防止5
”‑
oh与下一个循环加入的亚磷酰胺单体发生偶联反应，产生n-1杂质，对未参与偶联的5
”‑
oh加帽：使用乙酸酐和n-甲基咪唑形成乙酰化试剂，与未参与偶联反应的5
”‑
oh形成酯键；
20.由于传统的反义核苷酸抑制mirna效果差以及稳定性差，在此基础上，对每个核苷酸的呋喃糖2
‘
碳加上甲基，两端用磷硫酰修饰，并在3’处加入tt序列以稳定反义核酸；
21.设计序列为tattctgctcgtttttcgaacatt，形成粉末后-20℃保存，使用时用生理盐水0.2ml溶解。
22.进一步地，所述mir-208a-3p反义核酸的应用方法为：无需和其他药物配比，将保存在-20℃中的反义核酸取出，2000g瞬时离心后以无菌生理盐水溶解并以50mg/kg使用量鼠尾注射进入手术后小鼠体内，小鼠注射中溶液总体积不超过0.2ml，防止小鼠由于注射溶液过多诱发心衰。
23.(三)有益效果
24.本发明产生的有益效果是：本发明通过提出mir-208a-3p反义核酸在治疗心肌缺血再灌注损伤中的应用，并公开mir-208a-3p反义核酸的提取方法，明确mir-208a-3p反义核酸在心肌缺血再灌注损伤中起的治疗作用，解决传统心肌缺血再灌注损伤药物治疗效果不理想的问题，为心肌缺血再灌注损伤的治疗开辟更广阔的前景。
附图说明：
25.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
26.图1是本发明实施例中实验小鼠的超声心动对比图，包括短轴缩短率(lvfs)和射血分数(lvef)对比；
27.图2是本发明实施例中实验小鼠的心肌缺血/梗死面积照片对比图；
28.图3是本发明实施例中实验小鼠的心肌缺血/梗死面积分析结果对比图；
29.图4是本发明实施例中mir-208a-3p反义核酸表达检测图；
具体实施方式：
30.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
31.一、手术模型的建立
32.取体重相近(22g-23g)的c57bl/6小鼠进行实验。
33.1％戊巴比妥钠麻醉(剂量：0.2ml/只)，仰卧位固定于鼠板上，标准ii导联心电图监测。胸前区备皮，经口气管插管，并接呼吸机(设置呼吸机频率为110次/分，潮气量2.2ml，吸呼比1:3)。沿胸骨左缘向腋窝处剪开约1.5cm长的切口，用弯镊钝性分别分离皮肤层、胸大肌及胸小肌层以便暴露出肋间隙。在小鼠3,4肋间用弯镊扎破胸壁，撑开器扩展手术视野，小棉球推开肺脏以便更清楚的显露出心脏。随后将小鼠移至体视显微镜下，找到左心耳及左心室，调整显微镜焦距以便看清动脉，镜下可见有一条颜色呈淡粉红色的左冠状动脉前降支(left anterior descending,lad)自左心耳中部走形于左心室前壁至心尖部，用显微持针器夹持8-0带针缝合线，在左心耳下缘约2mm处进针，以活结结扎lad，于线结内垫pe-10塑料软管，结扎宽度约2mm,，以暂时阻断血流。结扎后，可观察到结扎线以下心肌颜色变白，同时心电图示st段弓背上抬，提示结扎成功。缺血30min后，松开线结取下软管，恢复血流。再灌注成功可肉眼观察到缺血区心肌颜色恢复，心电图呈缺血性改变。取下撑开器，恢复心脏解剖位置后关胸，然后挤出胸腔气体，待呼吸平稳后拔管。假手术组经历上述手术过程，但是结扎线仅从左前降支下穿过，不结扎。
34.鼠尾静脉注射：手术后用小鼠固定器固定老鼠，用75％酒精消毒小鼠尾巴，实验组用胰岛素针抽取溶于生理盐水的antagomir，给药剂量为50mg/kg(溶于0.2ml生理盐水)，对照组给与等量的antagomir control。
35.二、实验检测超声心动图
36.24小时后，小鼠用七氟醚麻醉后固定在操作台上，超声探头寻找心脏面，检测实验组和对照组的短轴缩短率(lvfs)、射血分数(lvef)。实验结果见图1所示。
37.三、缺血/梗死面积检测
38.用1％的evans blue灌注小鼠心脏后，将小鼠心脏以横切面切成0.2mm大小。加入1％的ttc染料中，37℃避光孵育30分钟后取出拍照。白色和暗红色为缺血/梗死区域，红色为正常组织。用image j 1.8.0软件分析缺血/梗死面积。实验结果如图2和图3所示。
39.四、mir-208a-3p表达检测
40.将上述正常区域的心脏组织取出，加入1mltrizol后用组织研磨器4
°
研磨。
41.加入0.2ml氯仿混匀后静止10min,离心12000g 15min；
42.取0.2-0.4ml上清加入同等体积的异丙醇，混匀后-20
°
静止30-60min，4℃环境下离心12000g 15min后弃上清；
43.加入1ml无水乙醇，4℃环境下离心12000g 15min后弃上清；
44.加入1ml75％酒精，4℃环境下离心12000g 15min后弃上清；干燥后用15-20μl的无
酶水溶解，测量浓度。
45.逆转录体系
[0046][0047]
混匀后离心，42℃，15min 85
°
，5s即可获得cdna。
[0048]
real-time pcr
[0049]
反应体系
[0050][0051]
反应条件
[0052]
95℃ 30s；95℃ 5s；60℃ 30s反应40个循环；熔解曲线分析，温度60℃-95℃。检测结果如图4所示。
[0053]
五、实验结果
[0054]
经反义核酸治疗下的小鼠，通过检测正常心脏组织中的mir-208a-3p表达，发现和对照组相比，减少至原来的1/8。同时分析超声心动图发现，给与antagomir的小鼠中射血分数相对于对照组有明显改善，改善约有10％。心脏切片染色证实，治疗下的缺血面积明显减小。
[0055]
综上所述，本发明通过提出mir-208a-3p反义核酸在治疗心肌缺血再灌注损伤中的应用，旨在解决传统心肌缺血再灌注损伤药物治疗效果不理想的技术问题，为心肌缺血再灌注损伤的治疗开辟更广阔的前景。
[0056]
最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的保护范围。另外，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改或变型，所有的这些等价形式同样属于本技术所要求限定的保护范围之内。