一种人外周血单个核细胞膜表面转运体的检测方法及应用与流程

1.本发明涉及细胞膜蛋白质检测技术领域，特别是涉及一种检测人外周血单个核细胞膜表面转运体的检测方法及应用。


背景技术：

2.器官移植术后需要使用免疫抑制剂预防器官排异反应的发生，用于器官移植的免疫抑制剂主要包括糖皮质激素、钙调酶抑制剂、抗增殖和抗代谢类抑制剂以及抗体类生物制剂。免疫抑制剂通过进入淋巴细胞，与淋巴细胞中的他克莫司结合蛋白(fkbp12)、mtor等蛋白结合发挥药理作用，形成的tac-fkbp12、sirolimus-fkbp-mtor等复合物抑制参与t-细胞激活的钙调磷酸酶，抑制t-细胞激活从而发挥免疫抑制作用。淋巴细胞中免疫抑制剂的浓度才能够真正反映其发挥药效的浓度。
3.免疫抑制剂在体内代谢过程中通过转运体转运进出细胞，外排型转运体(abcs)、摄取型转运体(slcs)均会参与免疫抑制剂的转运过程。已有研究报道他克莫司是abcb1、abca5的底物，环孢素、依维莫司、甲强龙是abcb1的底物，霉酚酸酯是abcb1、abcc2、abcg2、slco1b1、slco1b3的底物，硫唑嘌呤是abcb1、slc29a2、slc28a3、slc43a3的底物，来氟米特是abcg2的底物。abcb1、abcc2、abcc8、slc30a8、slco1b1/3、slc28a1、slc22a11、slc28a3等转运体的基因多态性与他克莫司代谢的差异性及毒性反应的发生也相关。
4.淋巴细胞膜表面也存在药物转运体，不同转运体的基因多态性和转运体蛋白表达量影响转运体转运免疫抑制剂的能力。每个个体的基因多态性是保持不变的，而转运体蛋白表达量会随着生理、病理及药物暴露量的变化而发生改变。因此，监测淋巴细胞膜表面的转运体表达量将有助于临床设计免疫抑制剂用药剂量，为免疫抑制剂的个体化精准用药提供帮助。外周血单个核细胞(pbmc)的主要组成是淋巴细胞，常用于淋巴细胞的相关研究，可以通过监测pbmc膜表面的转运体蛋白表达量反应淋巴细胞膜表面转运体的表达情况。
5.传统检测膜蛋白的方法有elisa、western blotting、流式细胞术等技术，传统方法均基于抗原抗体结合原理进行检测，容易受到基质中相似成分的干扰。


技术实现要素：

6.本发明目的在于提供一种人外周血单个核细胞膜表面转运体的检测方法及应用。本方法采用纳升液相串联高分辨质谱检测技术，相比传统检测方法，本方法选择性和通量均较高，不易受到基质中相似蛋白质的干扰，并且能够同时检测多种转运体的蛋白表达情况。
7.具体而言，本技术提供了如下技术方案：
8.一种人外周血单个核细胞膜表面转运体的检测方法，包括以下步骤：
9.(1)分离人外周血单个核细胞(pbmc)
10.1.1)取pbmc分离液ficoll 1.077试剂于离心管中，缓慢加入健康人全血，缓慢放入离心机离心获得离心产物后，吸取中间白膜层细胞转移至新的离心管中，加入pbmc清洗
液轻柔混匀；
11.1.2)再放入离心机中离心获得离心产物，加入pbmc清洗液轻柔混匀；
12.1.3)再放入离心机中离心获得离心产物，加入红细胞裂解液，室温静置，裂解未完全分离的红细胞，转移至新离心管中；
13.1.4)放入离心机中离心获得离心产物后，再加入pbmc清洗液轻柔混匀，放入离心机中离心获得离心产物；
14.(2)提取外周血单个核细胞膜蛋白
15.2.1)向获得的离心产物中加入transmembrane protein extraction kit中的extraction buffer 1和protease inhibitor cocktail重悬细胞，4℃孵育，4℃离心，将上清转移至新离心管中，置于冰上保存，或者分装后-80℃保存；
16.2.2)获得的沉淀中加入transmembrane protein extraction kit中的extraction buffer 2b和protease inhibitor cocktail重悬沉淀，室温孵育，4℃离心，将上清转移至新离心管中，置于冰上保存，或者分装后-80℃保存；取膜蛋白进行bca蛋白浓度检测获得总膜蛋白浓度；
17.(3)膜蛋白前处理
18.细胞膜蛋白中加入bsa溶液、dtt和nh4hco3溶液，95℃孵育，放置冷却至室温；加入碘乙酰胺，室温避光孵育；加入冰甲醇、氯仿、水浓缩样本，涡旋，4℃离心，室温放置晾干；冰甲醇清洗沉淀，涡旋，4℃离心，室温放置晾干；重悬溶液溶解沉淀；加入胰酶于37℃下孵育；加入三氟乙酸-20％乙腈水溶液终止反应，涡旋，4℃离心，取上清溶液放入c18 spin columns进行脱盐，完成脱盐后用甲酸-50％乙腈水溶液洗脱，洗脱后加入溶液内标工作液混匀；
19.(4)纳升液相串联高分辨质谱检测，计算pbmc膜表面转运体表达量。
20.其中，所述步骤1.1)具体为，取pbmc分离液ficoll 1.077试剂2.8-3.2ml于15ml离心管中，缓慢加入1-3ml健康人全血，缓慢放入离心机380-420g离心30-35分钟，获得离心产物后，吸取中间白膜层细胞转移至新15ml离心管中，加入pbmc清洗液0.9％氯化钠溶液5.8-6.2ml，移液枪或一次性滴管吹吸10次轻柔混匀；
21.其中，所述步骤1.2)具体为，放入离心机中380-420g离心8-10分钟，获得离心产物后，再次加入pbmc清洗液0.9％氯化钠溶液5.8-6.2ml，移液枪或一次性滴管吹吸10次轻柔混匀；
22.其中，所述步骤1.3)具体为，放入离心机中380-420g离心8-10分钟，获得离心产物后，加入红细胞裂解液0.8-1ml，室温静置8-10分钟，裂解未完全分离的红细胞，转移至新离心管中；
23.其中，所述步骤1.4)具体为，放入离心机中380-420g离心8-10分钟，获得离心产物后，再次加入pbmc清洗液0.9％氯化钠溶液5.8-6.2ml，轻柔混匀，再次放入离心机中380-420g离心8-10分钟。获得离心产物。
24.其中，所述步骤2.1)具体为，获得的离心产物中加入merck millipore公司生产的transmembrane protein extraction kit中的extraction buffer 1 0.5ml和protease inhibitor cocktail 2.5μl重悬细胞，4℃孵育8-10min(垂直混悬仪轻柔混匀)。4℃1000g离心5min，将上清(胞质蛋白)转移至新离心管中，置于冰上保存，或者分
装后-80℃保存；
25.其中，所述步骤2.2)具体为，获得的沉淀中加入merck millipore公司生产的transmembrane protein extraction kit中的extraction buffer 2b(0.1ml extraction buffer 2、0.1ml tm-pek reagent b)0.2ml和protease inhibitor cocktail重悬沉淀5μl，室温孵育45-120min(垂直混悬仪轻柔混匀)，4℃16000g离心15min，将上清(膜蛋白)转移至新离心管中，置于冰上保存，或者分装后-80℃保存。取膜蛋白25μl进行bca蛋白浓度检测获得总膜蛋白浓度。
26.其中，所述步骤(3)具体为，取80-100μl细胞膜蛋白(2mg/ml)中加入1μl bsa溶液(10μg/ml)、20μl dtt(100mm)和50μl nh4hco3溶液(50mm，ph7.8)，95℃孵育5min，放置10-15min冷却至室温。加入20μl碘乙酰胺(200mm)，室温避光孵育18-22min。加入500μl冰甲醇、200μl氯仿、200μl水浓缩样本，涡旋3-5min，4℃16000g离心5-10min，室温放置10-15分钟晾干。500μl冰甲醇清洗沉淀，涡旋3-5min，4℃16000g离心5-10min，室温放置30min晾干。40μl重悬溶液(3％脱氧胆酸钠-50mmnh4hco3溶液1:1)溶解沉淀。加入1μl胰酶(trypsin:protein＝1:25,w/w)于37℃下孵育24h。加入10μl 2.5％三氟乙酸-25％乙腈水溶液终止反应，涡旋3min，4℃12000rpm离心5min，取上清溶液放入c18 spin columns进行脱盐，完成脱盐后用40μl 0.1％甲酸-50％乙腈水溶液洗脱，洗脱后加入20μl溶液内标工作液混匀，然后进行纳升液相串联高分辨质谱检测，进样量5μl。
27.其中，所述步骤(4)，纳升液相色谱条件为：采用thermo fisher easy nlc 1200纳升液相系统；流动相a由20ml超纯水中加入20μl甲酸，混匀后超声20分钟配制而成；流动相b由16ml乙腈中加入4ml超纯水和20μl甲酸，混匀后超声20分钟配制而成；捕获色谱柱为acclaim pepmap 100 c18色谱柱；分离色谱柱为acclaim pepmap rslc c18色谱柱；柱温为20-22℃；样品池温度为8℃；进样体积为5μl；
28.按照如下梯度进行梯度洗脱：
29.0-5min，由97％流动相a和3％流动相b逐渐转变为92％流动相a和8％流动相b洗脱，流速为300nl/分钟；
30.5-85min，由92％流动相a和8％流动相b逐渐转变为72％流动相a和28％流动相b洗脱，流速为300nl/分钟；
31.85-102min，由72％流动相a和28％流动相b逐渐转变为62％流动相a和38％流动相b洗脱，流速为300nl/分钟；
32.102-110min，由62％流动相a和38％流动相b逐渐转变为100％流动相b洗脱，流速为300nl/分钟；
33.110-120min，为100％流动相b洗脱，流速为300nl/分钟；
34.高分辨质谱条件为：扫描模式为full scan结合prm模式，正离子模式，full scan模式分辨率为70000，agc target为3
×
e6，最大注射时间为200ms，扫描范围为350-1500m/z；prm模式分辨率为70000，agc target为1
×
e5，最大注射时间为100ms，isolation window为1.0m/z；
35.特征多肽序列包括转运体的特征序列及bsa蛋白的特征序列。
36.以p-gp转运体为例：
37.特征多肽序列(如seq id no:1-2所示)、nce、母离子质核比及子离子质核比见下
表(本检测方法也适用于pbmc膜表面其它转运体的检测，将表中特征序列替换为其它转运体的特征序列，nce、母离子质核比及子离子质核比做相应改变)。
[0038][0039]
pbmc膜表面转运体表达量的计算方法为：
[0040]
分别提取转运体特征多肽、bsa特征多肽四个子离子的二级色谱图，对四个子离子的峰面积求和得到总峰面积；分别提取转运体特征多肽同位素内标、bsa特征多肽同位素内标四个子离子的二级色谱图，对四个子离子的峰面积求和得到总峰面积；以特征多肽总峰面积与特征多肽同位素内标总峰面积比值为纵坐标、特征多肽标准曲线浓度为横坐标拟合得到标准曲线，计算得到质控和待测样品的浓度以ng/ml表示；再分别除以转运体特征多肽和bsa特征多肽的分子量，得到转运体特征多肽和bsa特征多肽的摩尔浓度，即为转运体、bsa蛋白的摩尔浓度，单位为fmol/ml；
[0041]
利用bsa计算样品前处理的回收率，利用回收率计算得到处理前的样品中转运体蛋白的浓度；将回收率校正后的浓度除以待测样品的总膜蛋白浓度，计算出含1μg总膜蛋白pbmc中转运体特征多肽的含量，单位为fmol/μg。
[0042]
此外，还包括标准品配制、标准曲线样品及质控样品配制、标准曲线样品及质控样品前处理等步骤。
[0043]
其中，所述标准品配制包括转运体特征多肽储备液配制、转运体特征多肽工作液配制、转运体特征多肽同位素内标储备液配制及转运体特征多肽同位素内标工作液配制；还包括bsa特征多肽储备液配制、bsa特征多肽工作液配制、bsa特征多肽同位素内标储备液配制及bsa特征多肽同位素内标工作液配制。
[0044]
其中所述标准曲线样品及质控样品配制包括转运体cal1-cal10标准曲线样品和l、m、h质控样品的配制，还包括bsa cal1-cal10标准曲线样品和l、m、h质控样品的配制。
[0045]
其中所述标准曲线样品及质控样品前处理为，分别取40μl标准曲线样品和质控样品，分别加入20μl内标工作液混匀。
[0046]
本发明的人外周血单个核细胞膜表面转运体的检测方法不仅能够用于检测器官移植患者pbmc膜表面转运体，也可以用于检测免疫疾病患者pbmc膜表面转运体。
[0047]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0048]
本技术检测人外周血单个核细胞膜表面转运体的方法，仅需约1-3ml的全血样品就能够检测pbmc膜表面转运体，能够同时检测多种转运体，通量较高，为制定个体化给药方案提供参考依据。
[0049]
下面结合附图对本发明的人外周血单个核细胞膜表面转运体的检测方法及应用作进一步说明。
附图说明
[0050]
图1为检测样本中bsa特征多肽提取离子流图；
[0051]
图2为检测样本中bsa特征多肽内标提取离子流图；
[0052]
图3为检测样本中p-gp特征多肽提取离子流图；
[0053]
图4为检测样本中p-gp特征多肽内标提取离子流图；
[0054]
图5为bsa特征多肽标准曲线；
[0055]
图6为p-gp特征多肽标准曲线。
具体实施方式
[0056]
以下以人外周血单个核细胞膜表面p-gp转运体表达量检测为例，对本发明的检测方法进行举例说明。
[0057]
1、标准品配制
[0058]
精密称取p-gp特征多肽标准品1mg用甲醇充分溶解，并完全转移于10ml容量瓶中，甲醇定容，配制浓度为0.1mg/ml p-gp特征多肽储备液。取p-gp特征多肽储备液1ml于10ml容量瓶中，甲醇定容，配制浓度为10μg/ml p-gp特征多肽工作液。精密称取p-gp特征多肽同位素内标标准品1mg用甲醇充分溶解，并完全转移于10ml容量瓶中，甲醇定容，配制浓度为0.1mg/ml p-gp特征多肽同位素内标储备液。取p-gp特征多肽同位素内标储备液15μl于50ml容量瓶中，0.1％甲酸-50％乙腈-水溶液定容，配制浓度为30ng/ml p-gp特征多肽同位素内标工作液。bsa特征多肽、bsa特征多肽同位素内标储备液及工作液配制方法与p-gp特征多肽、p-gp特征多肽同位素内标储备液及工作液配制方法相同。
[0059]
2、标准曲线样品和质控样品配制
[0060]
p-gp特征多肽标准曲线和质控样品包括cal1-cal10标准曲线样品和l、m、h质控样品。取p-gp特征多肽工作液9.6μl，加入0.1％甲酸-50％乙腈-水溶液990.4μl，配制成浓度为96ng/ml的cal10溶液，用0.1％甲酸-50％乙腈-水溶液稀释cal10溶液，分别得到64ng/ml cal9溶液、48ng/ml cal8溶液、32ng/ml cal7溶液、16ng/ml cal6溶液、8ng/mlcal5溶液、4ng/ml cal4溶液、2ng/ml cal3溶液、1ng/ml cal2溶液、0.25ng/ml cal1溶液。取cal10溶液20μl，加入0.1％甲酸-50％乙腈-水溶液60μl，配制成浓度为24ng/ml h溶液，用0.1％甲酸-50％乙腈-水溶液稀释h溶液，分别得到6ng/ml m溶液、1.5ng/ml l溶液。bsa特征多肽标准曲线和质控样品包括cal1-cal10标准曲线样品和l、m、h质控样品，配制方法与p-gp特征多肽标准曲线和质控样品方法相同。
[0061]
其中，当换用其他转运体时，标准品配制、标准曲线样品和质控样品配制仅需根据相应转运体的实际浓度做相应调整即可。
[0062]
3、标曲和质控样品前处理
[0063]
分别取40μl标曲和质控样品，分别加入20μl内标工作液混匀，然后进行纳升液相串联高分辨质谱检测，进样量5μl。
[0064]
4、待测患者样品前处理
[0065]
4.1提取外周血单个核细胞
[0066]
取pbmc分离液ficoll 1.077试剂3ml于15ml离心管中，缓慢加入1-3ml健康人全血，缓慢放入离心机400g离心35分钟，获得离心产物后，吸取中间白膜层细胞转移至新15ml离心管中，加入pbmc清洗液0.9％氯化钠溶液6ml，移液枪或一次性滴管吹吸10次轻柔混匀，再次放入离心机中400g离心10分钟。获得离心产物后，再次加入pbmc清洗液0.9％氯化钠溶
液6ml，移液枪或一次性滴管吹吸10次轻柔混匀，再次放入离心机中400g离心10分钟。获得离心产物后，加入红细胞裂解液1ml，室温静置10分钟，裂解未完全分离的红细胞，转移至新离心管中，再次放入离心机中400g离心10分钟。获得离心产物后，再次加入pbmc清洗液0.9％氯化钠溶液6ml，轻柔混匀，再次放入离心机中400g离心10分钟。获得离心产物。
[0067]
4.2提取外周血单个核细胞膜蛋白
[0068]
获得的离心产物中加入merck millipore公司生产的transmembrane protein extraction kit中的extraction buffer 1 0.5ml和protease inhibitor cocktail 2.5μl重悬细胞，4℃孵育8-10min(垂直混悬仪轻柔混匀)。4℃1000g离心5min，将上清(胞质蛋白)转移至新离心管中，置于冰上保存，或者分装后-80℃保存。获得的沉淀中加入merckmillipore公司生产的transmembrane protein extraction kit中的extraction buffer 2b(0.1ml extraction buffer 2、0.1ml tm-pekreagentb)0.2ml和protease inhibitor cocktail重悬沉淀5μl，室温孵育45-120min(垂直混悬仪轻柔混匀)，4℃16000g离心15min，将上清(膜蛋白)转移至新离心管中，置于冰上保存，或者分装后-80℃保存。取膜蛋白25μl进行bca蛋白浓度检测获得总膜蛋白浓度。
[0069]
4.3待测样品膜蛋白前处理
[0070]
取80-100μl细胞膜蛋白(2mg/ml)中加入1μl bsa溶液(10μg/ml)、20μl dtt(100mm)和50μl nh4hco3溶液(50mm，ph7.8)，95℃孵育5min，放置10-15min冷却至室温。加入20μl碘乙酰胺(200mm)，室温避光孵育18-22min。加入500μl冰甲醇、200μl氯仿、200μl水浓缩样本，涡旋3-5min，4℃ 16000g离心5-10min，室温放置10-15分钟晾干。500μl冰甲醇清洗沉淀，涡旋3-5min，4℃ 16000g离心5-10min，室温放置30min晾干。40μl重悬溶液(3％脱氧胆酸钠-50mm nh4hco3溶液1:1)溶解沉淀。加入1μl胰酶(trypsin:protein＝1:25,w/w)于37℃下孵育24h。加入10μl 2.5％三氟乙酸-25％乙腈水溶液终止反应，涡旋3min，4℃12000rpm离心5min，取上清溶液放入c18 spin columns进行脱盐，完成脱盐后用40μl 0.1％甲酸-50％乙腈水溶液洗脱，洗脱后加入20μl溶液内标工作液混匀，然后进行纳升液相串联高分辨质谱检测，进样量5μl。
[0071]
5、纳升液相串联高分辨质谱检测条件
[0072]
纳升液相色谱条件：
[0073]
采用纳升液相色谱：thermo fisher easy nlc 1200纳升液相系统
[0074]
配制流动相a：20ml超纯水中加入20μl甲酸，混匀后超声20分钟
[0075]
配制流动相b：16ml乙腈中加入4ml超纯水和20μl甲酸，混匀后超声20分钟
[0076]
捕获色谱柱：acclaim pepmap 100 c18 5μm(100μm
×
2cm)
[0077]
分离色谱柱：acclaim pepmap rslc c18 2μm(50μm
×
15cm)
[0078]
柱温：室温(20-22℃)
[0079]
样品池温度：8℃
[0080]
进样体积：5μl
[0081]
洗脱梯度如表1所示：
[0082]
表1
[0083][0084]
高分辨质谱条件：
[0085]
高分辨质谱参数设置为：扫描模式为full scan结合prm模式，正离子模式，full scan模式分辨率为70000，agc target为3
×
e6，最大注射时间为200ms，扫描范围为350-1500m/z。prm模式分辨率为70000，agc target为1
×
e5，最大注射时间为100ms，isolation window为1.0m/z。特征多肽序列(如seq id no:1-2所示)、nce、母离子质核比及子离子质核比见表2。
[0086]
表2
[0087][0088]
6、pbmc膜表面转运体表达量计算
[0089]
分别提取p-gp特征多肽、bsa特征多肽四个子离子(表2)的二级色谱图，对四个子离子的峰面积求和得到总峰面积。分别提取p-gp特征多肽同位素内标、bsa特征多肽同位素内标四个子离子(表2)的二级色谱图，对四个子离子的峰面积求和得到总峰面积。以特征多肽总峰面积与特征多肽同位素内标总峰面积比值为纵坐标、特征多肽标准曲线浓度为横坐标拟合得到标准曲线，计算得到质控和待测样品的浓度以ng/ml表示。再分别除以p-gp特征多肽和bsa特征多肽的分子量，得到p-gp特征多肽和bsa特征多肽的摩尔浓度，即为p-gp、bsa蛋白的摩尔浓度，单位为fmol/ml。
[0090]
利用bsa计算样品前处理的回收率：
[0091]
回收率＝(c
bsa后
×vtotal后
)/(c
bsa前
×vbsa前
)
×
100％
[0092]
注：c
bsa前
为样本中加入bsa溶液的摩尔浓度，v
bsa前
为样本中加入bsa溶液体积，c
bsa后
为处理后标曲计算得到bsa摩尔浓度，v
total后
为处理后溶液总体积。
[0093]
利用回收率计算得到处理前的样品中p-gp蛋白的浓度：
[0094]cp-gp前
＝(c
p-gp后
×vtotal后
)/(回收率
×vp-gp前
)
[0095]
注：c
p-gp前
为样品中p-gp蛋白的摩尔浓度，v
p-gp前
为加入样本的体积，c
p-gp后
为处理后标曲计算得到p-gp摩尔浓度，v
total后
为处理后溶液总体积。
[0096]
将回收率校正后的浓度除以待测样品的总膜蛋白浓度，计算出含1μg总膜蛋白pbmc中p-gp特征多肽和bsa特征多肽的含量，单位为fmol/μg。
[0097]
为了验证本发明方法的可行性，现采用本发明方法检测移植患者pbmc膜表面p-gp的浓度，结果如下：
[0098]
应用例1：北京某医院病患，孙某，肺移植患者，最终测得pbmc膜表面p-gp的浓度是
6.93fmol/μg总蛋白。
[0099]
应用例2：北京某医院病患，郭某，肺移植患者，最终测得pbmc膜表面p-gp的浓度是3.54fmol/μg总蛋白。
[0100]
应用例3：北京某医院病患，胡某，肾移植患者，最终测得pbmc膜表面p-gp的浓度是7.78fmol/μg总蛋白。
[0101]
应用例4：北京某医院病患，戴某，肺移植患者，最终测得pbmc膜表面p-gp的浓度是1.65fmol/μg总蛋白。elisa检测结果为37.58ng/ml，利用总膜蛋白浓度校正后的浓度为1.52fmol/μg总蛋白，与本发明的检测结果基本相符。
[0102]
结果如图1-6所示，图1-2为应用例1的检测样本中bsa特征多肽及其内标的提取离子流图，图3-4为应用例1检测样本中p-gp特征多肽及其内标的提取离子流图，图5为bsa特征多肽标准曲线，图6为p-gp特征多肽标准曲线。结果显示，本发明方法能够有效检测出移植患者pbmc膜表面的p-gp浓度。
[0103]
经过反复实验发现，如果将本实施例中的p-gp转运体更换为其他转运体，本检测方法也同样适用、有效。在换用其他转运体时，只需要将特征序列、nce、母离子质核比及子离子质核比做出相应改变，标准曲线及质控品配制根据转运体实际浓度做出相应调整，其余实验步骤基本相同，在此不一一赘述。
[0104]
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。