烟酰胺单核苷酸(NMN)及烟酰胺核苷(NR)的新用途的制作方法

烟酰胺单核苷酸(nmn)及烟酰胺核苷(nr)的新用途
技术领域
1.本发明涉及烟酰胺单核苷酸(nmn)及烟酰胺核苷(nr)的新用途。作为1个例子，涉及用于治疗或预防与hsd3b6或其同源物的活性关联的疾病、障碍或症状的包含nmn或nr的组合物、或者使用了该组合物的方法。尤其是，本发明涉及用于改善睑板腺的功能的包含nmn或nr的组合物、或者使用了该组合物的方法。


背景技术：

2.对于作为烟酰胺磷酸核糖基转移酶(nampt)的酶反应产物的烟酰胺单核苷酸(nmn)、烟酰胺核苷(nr)等氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad

)中间代谢产物，已有暗示发挥寿命延长效果的可能性，正在推进其作为补充剂的开发。但是，对于nmn及nr的活性的作用机制，目前还不能完全理解。


技术实现要素：

3.用于解决课题的方案
4.在本发明中，可提供烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)的用于改善hsd3b6或其同源物的活性的用途、或者包含烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)的组合物。通过hsd3b6或其同源物的活性的改善，可提供与hsd3b6或其同源物的活性关联的疾病、障碍或症状的治疗或预防。
5.在本发明中，尤其可提供烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)的用于改善睑板腺的功能的用途、或者包含烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)的组合物。组合物可具有施用于对象的眼的特征。作为睑板腺的功能的改善，可列举例如使睑板腺的腺泡细胞数增加、或者使来自睑板腺的脂质分泌增加等。在一个实施方式中，可提供用于治疗或预防伴有睑板腺的功能不全的疾病的组合物。另外，在其他实施方式中，本发明的组合物显示睑板腺组织萎缩的改善效果，可以使对从睑板腺分泌的脂质有影响的类固醇的合成酶活性亢进。另外，本发明的组合物可以使从睑板腺分泌的脂质组成正常化，因此理解为可以将睑板腺中的脂质正常化。而且，本发明的组合物可以促进睾酮产生，已知睾酮产生会促进睑板腺的脂质产生。睾酮等性激素对睑板腺的脂质产生有影响，因此理解为本发明的组合物可以将睑板腺组织中的脂质成分组成正常化。
6.例如，在本发明的优选的实施方式中，可提供以下方案。
7.(方案a1)一种用于改善hsd3b6或其同源物的活性的组合物，其包含烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)。
8.(方案a1-2)一种用于治疗或预防与hsd3b6或其同源物的活性关联的疾病、障碍或症状的组合物，其包含烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)。
9.(方案a1-3)根据上述方案中任一项所述的组合物，其中，所述与hsd3b6或其同源物的活性关联的疾病选自睑板腺功能不全、由类固醇激素(例如睾酮及雌激素等)降低所致的疾病、更年期障碍、骨质疏松症、生活习惯病、迟发性性腺功能减退症及心肌梗塞。
10.(方案a2)根据上述方案中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物施用于对象的眼。
11.(方案a3)一种用于改善睑板腺的功能的组合物，其包含烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)。
12.(方案a4)根据上述方案中任一项所述的组合物，其用于使睑板腺的腺泡细胞数增加。
13.(方案a5)根据上述方案中任一项所述的组合物，其用于使来自睑板腺的脂质分泌增加。
14.(方案a6)根据上述方案中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防伴有睑板腺的功能不全的疾病。
15.(方案a6-1)一种用于治疗或预防睑板腺功能不全的组合物，其包含烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)。
16.(方案a6-2)根据上述方案中任一项所述的组合物，其中，所述睑板腺功能不全伴有睑板腺脂分泌减少。
17.(方案a6-3)根据上述方案中任一项所述的组合物，其中，所述睑板腺功能不全伴有炎症性疾病。
18.(方案a6-4)根据上述方案中任一项所述的组合物，其中，所述炎症性疾病包含选自睑板腺炎、(点状)表层角膜炎、眼睑炎中的至少1种。
19.(方案a6-5)根据上述方案中任一项所述的组合物，其中，所述睑板腺功能不全伴有导管内脂质过剩蓄积。
20.(方案a6-6)根据上述方案中任一项所述的组合物，其中，所述睑板腺功能不全伴有眼不适感、异物感、和/或压迫感。
21.(方案a7)根据上述方案中任一项所述的组合物，其中，所述伴有睑板腺的功能不全的疾病选自睑板腺炎、后眼睑炎、角膜炎、结膜炎、睑板腺炎角结膜上皮症、眼类天疱疮、干燥综合征、stevens-johnson综合征、移植物抗宿主病(gvhd)及视功能障碍。
22.(方案b1)一种方法，其改善受试体的hsd3b6或其同源物的活性，或者治疗或预防与hsd3b6或其同源物的活性关联的疾病、障碍或症状。
23.(方案b2)根据方案b1所述的方法，其中，包括对所述受试体施用烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)的工序。
24.(方案b3)根据方案b1或b2所述的方法，其中，还包括对所述受试体的hsd3b6或其同源物的活性进行测定的工序。
25.(方案b4)根据方案b1～b3中任一项所述的方法，其中，包括下述工序：测定所述受试体的hsd3b6或其同源物的活性，在该活性降低的情况下，施用nmn和/或nr。
26.(方案c1)一种方法，其用于改善受试体的睑板腺的功能，或者治疗或预防伴有睑板腺的功能不全的疾病、障碍或症状。
27.(方案c2)根据方案c1所述的方法，其中，包括对所述受试体施用烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)的工序。
28.(方案c3)根据方案c1或c2所述的方法，其中，还包括对所述受试体的睑板腺功能进行确认的工序。
29.(方案c4)根据方案c1～c3中任一项所述的方法，其中，包括下述工序：确认所述受试体的睑板腺功能，在该功能降低的情况下，施用nmn和/或nr。
30.(方案c5)根据方案c4所述的方法，其中，所述睑板腺功能通过裂隙灯检查、睑板腺成像(meibography)、共聚焦显微镜(confocal microscopy)、dr-1、marx线(meiboline)、睑板腺测定(meibometry)、脂类化学(lipid chemistry)、蒸发量、泪膜破裂时间(but)、或自觉症状调查表来确认。
31.(方案c6)根据方案c1～c5中任一项所述的方法，其中，所述伴有睑板腺的功能不全的疾病、障碍或症状选自睑板腺炎、后眼睑炎、角膜炎、结膜炎、睑板腺炎角结膜上皮症、眼类天疱疮、干燥综合征、stevens-johnson综合征、移植物抗宿主病(gvhd)及视功能障碍。
32.(方案c7)根据方案c1～c6中任一项所述的方法，其用于使睑板腺的腺泡细胞数增加。
33.(方案c8)根据方案c1～c6中任一项所述的方法，其用于使来自睑板腺的脂质分泌增加。
34.(方案c9)根据方案c1～c6中任一项所述的方法，其用于增强睑板腺中的睾酮生成。
35.(方案d1)烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)的用于制造改善睑板腺的功能的组合物的用途。
36.(方案d2)根据方案d1所述的用途，其中，所述组合物是用于使睑板腺的腺泡细胞数增加的组合物。
37.(方案d3)根据方案d1所述的用途，其中，所述组合物是用于使来自睑板腺的脂质分泌增加的组合物。
38.(方案d4)根据方案d1～d3中任一项所述的用途，其中，所述组合物是用于治疗或预防伴有睑板腺的功能不全的疾病的组合物。
39.(方案d5)根据方案d4所述的用途，其中，所述伴有睑板腺的功能不全的疾病选自睑板腺炎、后眼睑炎、角膜炎、结膜炎、睑板腺炎角结膜上皮症、眼类天疱疮、干燥综合征、stevens-johnson综合征、移植物抗宿主病(gvhd)及视功能障碍。
40.(方案d6)根据方案d1～d5中任一项所述的用途，其中，所述组合物是用于增强睑板腺中的睾酮生成的组合物。
41.(方案e1)烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)的用于制造治疗或预防睑板腺功能不全的组合物的用途。
42.(方案e2)根据方案e1所述的用途，其中，所述睑板腺功能不全伴有睑板腺脂分泌减少。
43.(方案e3)根据方案e1所述的用途，其中，所述睑板腺功能不全伴有炎症性疾病。
44.(方案e4)根据方案e3所述的用途，其中，所述炎症性疾病包含选自睑板腺炎、(点状)表层角膜炎、眼睑炎中的至少1种。
45.(方案e5)根据方案e1所述的用途，其中，所述睑板腺功能不全伴有导管内脂质过剩蓄积。
46.(方案e6)根据方案e1所述的用途，其中，所述睑板腺功能不全伴有眼不适感、异物感、和/或压迫感。
47.(方案f1)一种烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)，其用于改善受试体的hsd3b6或其同源物的活性，或者用于治疗或预防与hsd3b6或其同源物的活性关联的疾病、障碍或症状。
48.(方案g1)一种烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)，其用于改善睑板腺的功能，或者用于治疗或预防伴有睑板腺的功能不全的疾病、障碍或症状。
49.(方案g2)根据方案g1所述的烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)，其中，所述伴有睑板腺的功能不全的疾病、障碍或症状选自睑板腺炎、后眼睑炎、角膜炎、结膜炎、睑板腺炎角结膜上皮症、眼类天疱疮、干燥综合征、stevens-johnson综合征、移植物抗宿主病(gvhd)及视功能障碍。
50.(方案h1)一种用于增强睑板腺中的睾酮生成的组合物，其包含烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)。
51.(方案h2)根据方案h1所述的组合物，其特征在于，所述组合物施用于对象的眼。
52.(方案i1)一种方法，其用于增强受试体的睑板腺中的睾酮生成。
53.(方案i2)根据方案i1所述的方法，其中，包括对所述受试体施用烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)的工序。
54.(方案j1)一种烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)，其用于增强睑板腺中的睾酮生成。
55.(方案j2)根据方案j1所述的烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)，其特征在于，其施用于对象的眼。
56.(方案k1)烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)在制造用于增强睑板腺中的睾酮生成的药物中的应用。
57.(方案k2)根据方案k1所述的用途，其特征在于，施用于对象的眼。
58.在本发明中，其意图在于：除了所指定的组合以外，还可以将上述1个或多个特征进一步组合来提供。本领域技术人员在根据需要阅读和理解以下的详细说明时将认识到本发明的其他的实施方式和优点。
59.发明的效果
60.通过本发明，可提供：用于改善hsd3b6或其同源物的活性、或用于治疗或预防与hsd3b6或其同源物的活性关联的疾病、障碍或症状的组合物；或者用于改善hsd3b6或其同源物的活性、或用于治疗或预防与hsd3b6或其同源物的活性关联的疾病、障碍或症状的方法。尤其，在本发明中，可提供用于改善睑板腺的功能的组合物、或者用于改善睑板腺的功能的方法。
附图说明
61.图1为表示与老化相伴的睑板腺组织的萎缩的图。左及中分别为6月龄和24月龄小鼠的眼睑的染色照片，右为对6月龄小鼠及24月龄小鼠的染色面积的平均进行比较的条形图。
62.图2为表示敲除(ko)hsd3b6后的2月龄小鼠的睑板腺组织的变化(睑板腺的大小及分泌导管的数量)的图。上行表示在雄小鼠中的结果，下行表示在雌小鼠中的结果。
63.图3为表示由对1.5年龄野生型小鼠滴眼2周nmn或nr引起的睑板腺中的hsd3b6酶
活性的变化及睑板腺基底细胞的细胞增殖活性的图。
64.图4为表示由对1.75年龄野生型小鼠滴眼3个月nmn或nr引起的对睑板腺组织的影响的图。其是左眼(未处理)及右眼(滴眼)的眼睑的代表性的染色照片、和表示各个体中的染色面积(右眼/左眼)的图表。
65.图5是表示野生型(wt)及hsd3b6敲除(ko)的2月龄的雄小鼠的性腺摘除后及假手术后的睑板腺组织中的睾酮含量的图。
具体实施方式
66.以下，对本发明进行说明。在整个说明书中，只要没有特别说明，单数形式的表达应理解为也包括其复数形式的概念。因此，只要没有特别说明，单数形式的冠词(例如，在英语的情况下为"a"、"an"、"the"等)应理解为也包括其复数形式的概念。另外，只要没有特别说明，本说明书中所使用的术语应理解为以该领域中通常所用的含义使用。因此，只要没有其他定义，本说明书中所使用的所有专业术语和科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
67.(定义)
68.在本说明书中，只要没有特别说明，“约”是指后续数值的
±
10％。
69.在本说明书中，所谓“受试体”是指本发明的用于治疗及预防的药物或方法的施用(移植)对象，作为受试体，可列举哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、猫、狗、牛、马、羊、候等)，但优选灵长类，特别优选人。
70.在本说明书中，“或”被使用在可以采用本文中所列举的事项的“至少1项以上”时。“或者”也同样。在本说明书中明确记载为“两个值”的“范围内”的情况下，其范围也包括两个值本身。
71.在本说明书中，“治疗”是指疾病或症状的治愈、或者症状的抑制。“预防”(prophylaxis)是指将疾病或症状的表现防患于未然，该概念也包括使疾病或症状的表现延迟、将疾病或症状的表现最小化。
72.在本说明书中，“衍生物”是指下述化合物：其核心结构与母体化合物的核心结构相同或非常相似，但具有不同的官能团或附加官能团等的化学或物理修饰。衍生物具有与母体化合物相同或类似的生物学活性。
73.在本说明书中，“在药学上可接受的盐”是指相对无毒性的、本发明化合物的无机或有机的酸加成盐。这些盐可以通过在化合物的最终的分离及纯化的期间暂时地制备、或者通过将以其游离碱型纯化得到的化合物分别与适合的有机或无机酸反应、并且将这样形成的盐分离来制备。
74.作为本发明的化合物的药学上可接受的碱性盐，可列举例如：钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土金属盐；铵盐；三甲基胺盐、三乙基胺盐、二环己基胺盐、乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、普鲁卡因盐、葡甲胺盐、二乙醇胺盐或乙二胺盐等脂肪族胺盐；n,n-二苄基乙二胺、苯乙苄胺盐等芳烷基胺盐；吡啶盐、甲基吡啶盐、喹啉盐、异喹啉盐等杂环芳香族胺盐；四甲基铵盐、四乙基铵盐、苄基三甲基铵盐、苄基三乙基铵盐、苄基三丁基铵盐、甲基三辛基铵盐、四丁基铵盐等季铵盐；精氨酸盐、赖氨酸盐等碱性氨基酸盐等。
75.作为本发明的化合物的药学上可接受的酸性盐，可列举例如：盐酸盐、硫酸盐、硝
酸盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、高氯酸盐等无机酸盐；乙酸盐、丙酸盐、乳酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐等有机酸盐；甲磺酸盐、羟基乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等磺酸盐；天冬氨酸盐、谷氨酸盐等酸性氨基酸盐等。
76.在本说明书中，“溶剂合物”是指本发明的化合物或其药学上可接受的盐的溶剂合物，包括例如与有机溶剂的溶剂合物(例如醇(乙醇等)合物)、水合物等。在形成水合物时，可以与任意数量的水分子配位。作为水合物，可列举一水合物、二水合物等。
77.在本说明书中，“同源物”是指具有源自共同祖先的氨基酸序列或碱序列的蛋白或基因。在某些同源物是由种分化产生的情况下，它们称作直系同源物。另外，在某些生物种中通过基因复制而新生成的同源物称作旁系同源物。
78.(有效成分)
79.烟酰胺单核苷酸(nmn)为具有以下结构的化合物，其是源自核糖和烟酰胺的核苷酸。已知其为nad (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的生化前体。
80.[化1]
[0081][0082]
烟酰胺核苷(nr)为具有以下结构的化合物，其是核糖与烟酰胺的结合体。也可以说是在nmn中核苷酸被置换为核糖的物质。
[0083]
[化2]
[0084][0085]
在本发明中，可提供包含nmn和/或nr的组合物、或者包括使用(例如施用)nmn和/或nr的步骤的方法。nmn和/或nr可以以它们的衍生物、和/或它们的药学上可接受的盐的形式来使用。在本说明书的实施例中显示nmn及nr可改善hsd3b6酶活性(或其同源物例如hsd3b1的酶活性)。另外，在本说明书的实施例中显示nmn及nr可使睑板腺组织恢复。在一个实施方式中，组合物可包含nmn。在一个实施方式中，组合物可包含nr。
[0086]
nmn和/或nr可以与其他的有效成分组合使用。作为其他的有效成分，可列举抗炎症剂、抗菌药、营养剂、抗氧化剂等，但是并不限定于此。
[0087]
(疾病)
[0088]
在本发明中，可提供用于基于nmn及nr改善hsd3b6或其同源物的活性的组合物或方法。hsd3b6可通过昼夜节律钟来直接控制，该基因的产物是醛甾酮生产路径的重要要素。此外，还可提供用于治疗或预防与hsd3b6或其同源物的活性关联的疾病、障碍或症状的组合物或方法。作为与hsd3b6或其同源物的活性关联的疾病，可列举睑板腺功能不全、由类固醇激素(例如睾酮及雌激素等)降低所致的疾病、更年期障碍、骨质疏松症、生活习惯病、迟发性性腺功能减退症及心肌梗塞等，但是并不限定于此。
[0089]
尤其，在本发明中，可提供用于基于nmn及nr改善睑板腺功能的组合物或方法。睑板腺(meibomian gland)为处于眼睑缘的皮脂腺之一，其分泌具有下述作用的油性物质(皮脂)：防止眼的泪液膜的蒸发，防止眼泪流落至脸颊，使闭合的眼睑内气密。睑板腺也称作tarsal gland。睑板腺功能不全(mgd)被定义为在其功能发生弥漫性异常的状态下伴有慢性的眼不适感，其原因被认为是睑板脂质的变性、淤积
·
慢性感染、炎症导管上皮的过角化。在本发明的实施例中证实了nmn及nr可使睑板腺中的hsd3b6活性恢复、并且可使睑板腺的大小增大。作为睑板腺的功能的改善，可列举例如使睑板腺的腺泡细胞数增加、使来自睑板腺的脂质分泌增加、或者治疗或预防伴有睑板腺的功能不全的疾病。
[0090]
在本发明的一个实施方式中，可提供用于基于nmn及nr治疗或预防伴有睑板腺的功能不全的疾病的组合物或方法。例如，可提供包含烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)的、用于治疗或预防睑板腺功能不全的组合物。睑板腺功能不全可能伴有睑板腺脂分泌减少。睑板腺功能不全可能伴有炎症性疾病。作为炎症性疾病，可列举例如睑板腺炎、(点状)表层角膜炎、眼睑炎中的至少1种。睑板腺功能不全可能伴有导管内脂质过剩蓄积。睑板腺功能不全可能伴有眼不适感、异物感、和/或压迫感。作为伴有睑板腺的功能不全的疾病，可列举例如选自睑板腺炎、后眼睑炎、角膜炎、结膜炎、睑板腺炎角结膜上皮症、视功能障碍、雄激素缺乏症、特应性皮炎、前列腺肥大症、眼类天疱疮、盘状红斑狼疮(erythematodes)、外胚层发育不良(ectodermaldysplasia)综合征(无汗性外胚叶形成不全)、骨髓移植、高血压、闭经、帕金森病、寻常性干癣、酒渣鼻(rosacea)、干燥综合征、stevens-johnson综合征、中毒性表皮坏死症、tuner综合征、移植物抗宿主病(gvhd)、以及由药物治疗(类维生素a、抗雄激素、抗抑郁药、抗组胺药、闭经后的雌激素治疗)引起的副作用中的疾病，但是并不限定于此。本发明的组合物可改善睑板腺的功能本身，因此可理解为对上述疾病均可有效地使用。
[0091]
在本发明的其他实施方式中，可提供用于使从睑板腺分泌的脂质组成正常化、使睑板腺中的脂质正常化的组合物或方法。本发明的组合物能够显示睑板腺组织萎缩的改善效果，能够使对从睑板腺分泌的脂质有影响的类固醇的合成酶活性亢进，因此可理解为有助于睑板腺中的脂质的正常化。睑板腺中的脂质成分的测定方法并无特别限定，只要可评价睑板腺中的脂质成分，则可采用本领域中公知的各种方法。
[0092]
在本发明的一个实施方式中，本发明的组合物使hsd3b6酶活性上升，因此能够促进睾酮产生，已知睾酮产生会促进睑板腺的脂质产生。睾酮等性激素对睑板腺中的脂质产生有影响，因此本发明的组合物经由hsd3b6酶活性的亢进而促进包含睾酮的性激素的产生，由此可理解为有助于睑板腺组织中的脂质成分组成的正常化。
[0093]
(制剂)
[0094]
本发明的组合物可制成适当的剂型。例如，在本发明中的组合物为眼科用组合物的情况下，可以以眼注射液、眼软膏、滴眼剂或眼灌流液的形式来提供。组合物可以制成气溶胶、液剂、浸膏剂、酏剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、软膏、散剂、片剂、溶液、悬浮液、乳液等任意的剂型。组合物可以包含在本技术领域中公知的任意药学上可接受的添加物和/或赋形剂。作为添加剂，可列举张度调整剂、缓冲剂、防腐剂、共溶剂及增稠剂，但是并不限定于此。例如，眼科用组合物可以以使有效成分溶解于水性溶剂(例如水)的液剂的形态来提供。
[0095]
本发明的组合物可以通过本领域技术人员所决定的任意的适当路径来施用，并无
限定，可以按照适合于采用选自眼注射、局部适用(包括对眼的适用)、滴眼、静脉注射、点滴、经口、非经口、经皮等中的施用路径进行施用的方式制成制剂。
[0096]
作为等渗剂，可列举葡萄糖、海藻糖、乳糖、果糖、甘露糖醇、木糖醇、山梨醇等糖类、甘油、聚乙二醇、丙二醇等多元醇类、氯化钠、氯化钾、氯化钙等无机盐类等，其配合量相对于组合物总量优选为0～5重量％。
[0097]
作为螯合剂，可列举乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钠钙、乙二胺四乙酸三钠、乙二胺四乙酸四钠、乙二胺四乙酸钙等乙二胺四乙酸盐类、乙二胺四乙酸盐、次氮基三乙酸或其盐、六偏磷酸钠、柠檬酸等，其配合量相对于组合物总量优选为0～0.2重量％。
[0098]
作为稳定化剂，可列举亚硫酸氢钠等，其配合量相对于组合物总量优选为0～1重量％。
[0099]
作为ph调节剂，可列举盐酸、碳酸、乙酸、柠檬酸等酸，还可列举氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物、碳酸钠等碱金属碳酸盐或碳酸氢盐、乙酸钠等碱金属乙酸盐、柠檬酸钠等碱金属柠檬酸盐、氨丁三醇等碱等，其配合量相对于组合物总量优选为0～20重量％。
[0100]
作为防腐剂，可列举山梨酸、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等对羟基苯甲酸酯、葡萄糖酸氯己定、苯扎氯铵、苄索氯铵、氯化十六烷基吡啶鎓等季铵盐、烷基聚氨基乙基甘氨酸、氯丁醇、polyquad、聚六亚甲基双胍、氯己定等，其配合量相对于组合物总量优选为0～0.2重量％。
[0101]
作为抗氧化剂，可列举亚硫酸氢钠、干燥亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、浓缩混合生育酚等，其配合量相对于组合物总量优选为0～0.4重量％。
[0102]
作为溶解辅助剂，可列举苯甲酸钠、甘油、d-山梨醇、葡萄糖、丙二醇、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、d-甘露糖醇等，其配合量相对于组合物总量优选为0～3重量％。
[0103]
作为粘稠剂，可列举聚乙二醇、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、黄原胶、硫酸软骨素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇等，其配合量相对于组合物总量优选为0～70重量％。
[0104]
在制备滴眼剂的情况下，例如可以通过以下方式来进行：使所期望的上述成分溶解或悬浮于灭菌纯化水、生理食盐水、缓冲液(例如硼酸缓冲液、磷酸缓冲液等。)等水性溶剂、或棉籽油、大豆油、芝麻油、花生油等植物油等非水性溶剂，调整成规定的渗透压，实施过滤灭菌等灭菌处理。
[0105]
需要说明的是，在制备眼软膏剂的情况下，除上述各种成分以外，还可以包含软膏基质。作为上述软膏基质，并无特别限定，可列举：凡士林、液体石蜡、聚乙烯等油性基质；利用表面活性剂等使油相与水相乳化而得的乳剂性基质；羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、包含聚乙二醇等的水溶性基质等。
[0106]
本发明的组合物或治疗剂或预防剂可以以试剂盒的形式来提供。在特定的实施方式中，本发明提供包含1个以上容器的药剂袋或试剂盒，所述容器填充有本发明的组合物或药物中的1种以上的成分。根据情况，也可以随附于这样的容器、以由控制药物或生物学制品的制造、使用或贩卖的政府机关规定的形式示出如下信息，该信息表示由政府机关授予用于人施用用途的制造、使用或贩卖的许可。
[0107]
在本说明书中，“试剂盒”是指通常分成两个以上的分区来提供所应提供的部分
(例如治疗药、预防药、它们各自的成分、说明书等)的单元(unit)。目的在于提供为了稳定性等不应混合来提供而优选在即将使用前混合来使用的组合物时，优选该试剂盒的形态。这样的试剂盒优选具备下述指示书或说明书较为有利，所述指示书或说明书记载有如何使用所提供的部分(例如治疗药、预防药)、或者应该如何处理试剂。在本说明书中，在试剂盒用作试药试剂盒的情况下，在试剂盒中通常包含记载有治疗药、预防药等的使用方法等的指示书等。
[0108]
在本说明书中，“指示书”记载有针对医生或其他使用者的使用本发明的方法的说明。该指示书记载有指示本发明的检测方法、诊断药的使用方法、或施用药物等的文字。另外，在指示书中也可以记载指示对作为施用部位的眼的施用(例如采用滴眼、眼软膏或注入等)的文字。该指示书根据实施本发明的国家的监督机关(例如日本的厚生劳动省，美国的食品药品管理局(fda)等)规定的样式制作，并明确记载了得到该监督机关的批准。指示书是所谓的添附文书(package insert)，通常以纸介质来提供，但并不限定于此，例如也可以以电子介质(例如由网络提供的主页、电子邮件)之类的形态来提供。
[0109]
在一个实施方式中，可提供一种滴眼剂，其是包含烟酰胺单核苷酸(nmn)的滴眼剂，所述滴眼剂以0.001μg/ml以上、0.01μg/ml以上、0.1μg/ml以上、1μg/ml以上、10μg/ml以上、100μg/ml以上、200μg/ml以上、500μg/ml以上、1mg/ml以上、2mg/ml以上、5mg/ml以上、10mg/ml以上或50mg/ml以上的浓度包含烟酰胺单核苷酸(nmn)。
[0110]
在一个实施方式中，可提供一种滴眼剂，其是包含烟酰胺核苷(nr)的滴眼剂，所述滴眼剂以0.001μg/ml以上、0.01μg/ml以上、0.1μg/ml以上、1μg/ml以上、10μg/ml以上、100μg/ml以上、200μg/ml以上、500μg/ml以上、1mg/ml以上、2mg/ml以上、5mg/ml以上、10mg/ml以上或50mg/ml以上的浓度包含烟酰胺核苷(nr)。
[0111]
在一个实施方式中，可提供一种眼软膏，其是包含烟酰胺单核苷酸(nmn)的眼软膏，所述眼软膏以0.001μg/ml以上、0.01μg/ml以上、0.1μg/ml以上、1μg/ml以上、2μg/ml以上、5μg/ml以上、10μg/ml以上、50μg/ml以上、100μg/ml以上、200μg/ml以上或500μg/ml以上的浓度包含烟酰胺单核苷酸(nmn)。
[0112]
在一个实施方式中，可提供一种眼软膏，其是包含烟酰胺核苷(nr)的眼软膏，所述眼软膏以0.001μg/ml以上、0.01μg/ml以上、0.1μg/ml以上、1μg/ml以上、2μg/ml以上、5μg/ml以上、10μg/ml以上、50μg/ml以上、100μg/ml以上、200μg/ml以上或500μg/ml以上的浓度包含烟酰胺核苷(nr)。
[0113]
使用根据剂型而具有规定量以上浓度的制剂，对于送达至不是眼球上而是存在于眼睑里的睑板腺有利。
[0114]
(用量)
[0115]
在一个实施方式中，作为本发明的利用法，可列举例如滴眼剂，但是并不限定于此，还可列举眼软膏、向前房内的注射、向缓释剂中的浸渗、结膜下注射、全身施用(内服、静脈注射)等施用形态(施用方法及剂型)。
[0116]
本发明中所使用的nmn或nr的浓度通常为约0.001～1000μm(μmol/l)，优选为约0.01～300μm，更优选为约0.03～100μm，进一步优选为约0.1～约30μm，作为其他的浓度范围，例如，通常为0.01nm～100μm、约0.1nm～100μm、约0.001～100μm、约0.01～75μm、约0.05～50μm、约1～10μm、约0.01～10μm、约0.05～10μm、约0.075～10μm、约0.1～10μm、约0.5～
10μm、约0.75～10μm、约1.0～10μm、约1.25～10μm、约1.5～10μm、约1.75～10μm、约2.0～10μm、约2.5～10μm、约3.0～10μm、约4.0～10μm、约5.0～10μm、约6.0～10μm、约7.0～10μm、约8.0～10μm、约9.0～10μm、约0.01～50μm、约0.05～5.0μm、约0.075～5.0μm、约0.1～5.0μm、约0.5～5.0μm、约0.75～5.0μm、约1.0～5.0μm、约1.25～5.0μm、约1.5～5.0μm、约1.75～5.0μm、约2.0～5.0μm、约2.5～5.0μm、约3.0～5.0μm、约4.0～5.0μm、约0.01～3.0μm、约0.05～3.0μm、约0.075～3.0μm、约0.1～3.0μm、约0.5～3.0μm、约0.75～3.0μm、约1.0～3.0μm、约1.25～3.0μm、约1.5～3.0μm、约1.75～3.0μm、约2.0～3.0μm、约0.01～1.0μm、约0.05～1.0μm、约0.075～1.0μm、约0.1～1.0μm、约0.5～1.0μm、约0.75～1.0μm、约0.09～35μm或约0.09～3.2μm，可更优选列举约0.01～10μm、约0.1～3μm或约0.1～1.0μm，但是并不限定于此。
[0117]
在作为滴眼剂使用的情况下，在还要考虑被泪液等的稀释、还要注意到毒性的同时，可以以上述有效浓度的约1～10000倍、优选约100～10000倍、例如约1000倍作为基准来决定制剂浓度，也可设定为超出它们的浓度。例如为约0.01μm(μmol/l)～1000mm(mmol/l)、0.03μm～1000mm、约0.1μm～300mm、约0.3μm～300mm、约1μm～100mm、约3μm～100mm、约10μm～100mm、约30μm～100mm、约0.1μm～30mm、约0.3μm～30mm、约1μm～30mm、约3μm～30mm、约1μm～10mm、约3μm～10mm、约10μm～1mm、约30μm～1mm、约10μm～10mm、约30μm～10mm、约100μm～10mm、约300μm～10mm、约10μm～100mm、约30μm～300mm、约100μm～300mm、约300μm～300mm，可以为约1mm～10mm、约1mm～100mm，它们的上限和下限可以适当组合来设定。
[0118]
对特定的疾病、障碍或状态的治疗有效的本发明的药物的有效量可根据障碍或状态的性质而发生变动，但是，本领域技术人员能够基于本说明书的记载通过标准的临床技术来确定。进而，还可根据需要使用体外(in vitro)测定来辅助鉴定最佳投药量范围。想要使用于配合物的正确的用量还可根据施用路径、以及疾病或障碍的重大性而发生变动，因此应该根据主管医生的判断及各患者的状况来确定。但是，施用量并无特别限定，例如可以是每1次0.001、1、5、10、15、100、或1000mg/kg体重，也可以是它们中任意2个值的范围内。施用间隔并无特别限定，例如可以是每1、7、14、21或28天施用1、2或4次，也可以是每个它们中的任意2个值的范围施用1、2或4次。施用量、施用次数、施用间隔、施用期间、施用方法可以根据患者的年龄、体重、症状、施用形态、对象脏器等来适当选择。例如，本发明的组合物可以作为滴眼剂来使用。另外，治疗药优选包含治疗有效量或发挥所期望作用的有效量的有效成分。有效用量可以根据从体外或动物模型试验体系得到的用量-反应曲线进行推定。
[0119]
使用规定量以上的有效成分，可以对送达至不是眼球上而是存在于眼睑里的睑板腺有利。
[0120]
(治疗方法及预防方法)
[0121]
在本发明中，可提供下述方法，所述方法改善hsd3b6或其同源物的活性、或者治疗或预防与hsd3b6或其同源物的活性关联的疾病、障碍或症状。方法可以包括对受试体施用烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)的步骤。
[0122]
方法可以根据需要包括测定受试体的hsd3b6或其同源物的活性的步骤。在一个实施方式中，可提供如下方法，即，测定受试体的hsd3b6或其同源物的活性，在该活性降低的情况下施用nmn和/或nr。
[0123]
在本发明中，可提供下述方法，所述方法用于改善睑板腺的功能、或者治疗或预防
伴有睑板腺功能不全的疾病、障碍或症状。方法可包括对受试体施用烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)的步骤。
[0124]
在本发明中，可提供增强在睑板腺中的睾酮生成的方法。方法可包括对受试体施用烟酰胺单核苷酸(nmn)和/或烟酰胺核苷(nr)的步骤。
[0125]
方法根据需要可以包括确认受试体的睑板腺功能的步骤。在一个实施方式中，可提供如下方法，即，确认受试体的睑板腺功能，在该功能降低的情况下施用nmn和/或nr。睑板腺功能可以通过例如裂隙灯检查、睑板腺成像(meibography)、共聚焦显微镜(confocal microscopy)、dr-1、marx线(meiboline)、睑板腺测定(meibometry)、脂类化学(lipid chemistry)、蒸发量、泪膜破裂时间(but)、或自觉症状调查表等进行确认。
[0126]
(一般技术)
[0127]
在本说明书中所使用的分子生物学的方法、生化学的方法、微生物学的方法为该领域中公知且惯用的方法，记载于例如sambrook j.et al.(1989).molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor及
そ
的3rd ed.(2001)；ausubel,f.m.(1987).current protocols in molecular biology,greene pub.associates and wiley-interscience；ausubel,f.m.(1989).short protocols in molecular biology:a compendium of methods from current protocols in molecular biology,greene pub.associates and wiley-interscience；innis,m.a.(1990).pcr protocols:a guide to methods and applications,academic press；ausubel,f.m.(1992).short protocols in molecular biology:a compendium of methods from current protocols in molecular biology,greene pub.associates；ausubel,f.m.(1995).short protocols in molecular biology:a compendium of methods from current protocols in molecular biology,greene pub.associates；innis,m.a.et al.(1995).pcr strategies,academic press；ausubel,f.m.(1999).short protocols in molecular biology:a compendium of methods from current protocols in molecular biology,wiley,and annual updates；sninsky,j.j.et al.(1999).pcr applications:protocols for functional genomics,academic press、gait,m.j.(1985).oligonucleotide synthesis:a practical approach,irl press；gait,m.j.(1990).oligonucleotide synthesis:a practical approach,irl press；eckstein,f.(1991).oligonucleotides and analogues:a practical approach,irl press；adams,r.l.et al.(1992).the biochemistry of the nucleic acids,chapman&hall；shabarova,z.et al.(1994).advanced organic chemistry of nucleic acids,weinheim；blackburn,g.m.et al.(1996).nucleic acids in chemistry and biology,oxford university press；hermanson,g.t.(i996).bioconjugate techniques,academic press、增刊实验医学“基因导入&表达解析实验法”羊土社、1997等中。在本说明书中关联的部分(可以为全部)援用这些方法作为参考。
[0128]
在本说明书中所引用的科学文献、专利、专利申请等参考文献其全部内容作为参考以与各自具体记载的情况相同的程度援用于本说明书中。
[0129]
以上，为了便于理解而示出优选的实施方式来说明本发明。以下，基于实施例来说明本发明，但是，上述的说明及以下的实施例仅以例示的目的来提供，并不以限定本发明的目的来提供。因此，本发明的范围并不限定于本说明书中具体记载的实施方式和实施例，而
仅受到权利要求书的限定。
[0130]
实施例
[0131]
以下，记载本发明的例子。符合的情况下生物试样等的处理遵守厚生劳动省、文部科学省等中规定的基准，符合的情况下基于赫尔辛基宣言(declaration of helsinki)或根据该宣言制作的伦理规定来进行。
[0132]
(实施例1：与老化相伴的睑板腺组织的萎缩
·
hsd3b6 ko中的睑板腺组织)
[0133]
[概要]
[0134]
在本实施例中，针对老化相伴的睑板腺组织的萎缩及hsd3b6 ko小鼠中的睑板腺组织的变化进行证明。
[0135]
[材料及方法]
[0136]
(1)整体睑板腺赫克斯海默染色实验方法(whole mount meibomian glands herxheimer’s staining protocol)
[0137]
小鼠中的睑板腺组织的染色按照以下的实验方法来进行。
[0138]
作为每100ml染色液的调制法，如下所述：将使苏丹iv溶解于100％乙醇并使之饱和而得的母液(stock solution)的瓶预先静置，尽可能地将其上清的部分70ml、10％naoh 20ml、超纯水10ml混合，转动5分钟，进行离心，使粉沉淀。将其上清用0.45μm的过滤器进行过滤，作为染色液来使用。
[0139]
将小鼠颈椎脱臼，对包含睑板腺的头部的皮肤进行了取样。用压销将其以平坦的方式在4％的多聚甲醛中浸渍，在4℃下用旋转器进行了24小时固定。对睑板腺的周围进行修剪，将其在室温下使用旋转器在50％乙醇中浸渍10分钟，之后，在70％乙醇中浸渍20分钟，在falcon管中在室温下使用旋转器在染色液中浸渍24小时。之后，在70％乙醇中浸渍10分钟，重复数次清洗操作，确认到睑板腺完全染色。在将80％氨基醇3.75ml和甘油8.25ml混合而得的氨基醇的甘油溶液中浸渍24小时。将其放置于载玻片，用甘油胶(glycerin jelly)封入。甘油胶是由明胶10g、超纯水60ml、甘油70ml制作而成，首先，将明胶和超纯水预先混合，使明胶膨胀，经过约1小时后，边加热边加入甘油并使其混合，从而制成甘油胶。
[0140]
(2)睑板腺苏丹iv染色的区域解析
[0141]
使用photoshop和imagej，一边与染色像进行对比一边确定颜色强度的阈值，基于规定的阈值以上的部分的面积，进行染色后的区域分析。
[0142]
(3)小鼠
[0143]
将小鼠的包含hsd3b6基因的起始密码子的外显子2区域用loxp夹持，制作floxed小鼠，将其与cag-cre转基因小鼠交配，由此制作不能表达hsd3b6的hsd3b6 ko小鼠。
[0144]
在湿度40～60％、室温25℃、12小时明12小时暗循环的自由摄食
·
摄水环境的正常状态(normal condition)(通常湿度条件)下，将2月龄的小鼠饲养10日后，进行了试验。
[0145]
24月龄的小鼠是将c57bl/6j小鼠78周龄(18月龄)的雄性小鼠(购自株式会社orientalbioservice)在正常状态(通常湿度条件)下饲养6月而成的。6月龄的c57bl/6j小鼠是购入6周龄的小鼠并将其在正常状态(通常湿度条件)下饲养至6月龄而成的。
[0146]
[结果]
[0147]
在6月龄的小鼠和24月龄的小鼠中，按照上述的实验方法对睑板腺组织进行染色，并对所染色的面积进行比较。结果示于图1中。可确认到因老化而睑板腺组织萎缩、睑板腺
功能不全(mgd)加剧(n＝7)。
[0148]
2月龄的hsd3b6 ko小鼠和野生型小鼠的睑板腺组织的大小及分泌导管的数量示于图2中。与老龄小鼠同样，可确认到hsd3b6 ko小鼠也显示睑板腺萎缩。分泌导管的数量不会因基因型不同而存在差异，因此可确认到睑板腺萎缩不是导管的产生过程的异常。
[0149]
(实施例2：对1.5年龄野生型小鼠滴眼2周nmn或nr的滴眼实验)
[0150]
[概要]
[0151]
在本实施例中，针对通过对1.5年龄野生型小鼠滴眼2周nmn或nr而导致的睑板腺中的hsd3b6酶活性及睑板腺腺胞基底细胞中的细胞增殖活性的变化进行证明。
[0152]
[材料及方法]
[0153]
(1)滴眼实验的概要如以下所示。
[0154]
[表1]
[0155][0156]
(2)睑板腺hsd3b6酶活性测定
[0157]
小鼠的睑板腺hsd3b6酶活性测定按照以下的实验方法来进行。
[0158]
〇事前准备
[0159]
将hanks平衡盐溶液(hbss)用95％co2/5％o2鼓泡1小时以上。向2ml管中各分注200μl，在充满95％co2/5％o2的状态下盖上盖。预先在37℃的水浴中对hbss加温，将反应用培养器加温至37℃，在其中设置微量管混合器(micro tube mixer)。
[0160]
〇测定设备的起动
[0161]
接通流动液体闪烁计数器(perkin elmer,radiomatic 625tr)的主电源，并且接通hplc(waters,2795separations module)的主电源而进行了设置(setup)。将流动相a置换为水，将流动相b置换为乙腈。安装色谱柱(关东化学，lichrocart250-4，lichrospher 100rp-18，粒径5μm，4mm i.d.
×
250mm)后，以0.7ml/min流入40％乙腈(acn)(a为60％、b为40％)，此时，将柱温箱的温度设定为40℃。
[0162]
○3h-孕烯醇酮的纯化
[0163]
向装入2ml管的40％acn 1ml中添加3h-dhea并轻敲。将微量离心管放置于hplc的支架，选择了单次给药。经过22分钟而出现的杂质的峰不回收，杂质的峰在23分钟的位置下降，接着，出现3h-dhea的峰，因此在达到峰值的1/3位置的c.p.m.的时刻开始回收至玻璃spitz管中，通过4分钟的回收，回收了合计2.5ml左右。利用涡旋(voltex)来搅拌玻璃spitz
管内的液体，取25μl至液体闪烁计数器，取25μl加入至透明溶胶3ml中。确认到从喷出口喷出微量n2，在taitec的培养器中将玻璃spitz管内的液体于75℃进行氮气干燥固化。
[0164]
○
基质的制备
[0165]
将经氮气干燥固化的3h-dhea冷却至室温后，加入1μl/4,000c.p.m.(将25μl用液体闪烁计数器测定得到的值)的丙二醇，进行5分钟涡旋，溶解了3h-dhea。
[0166]
加入4μl/4,000c.p.m.的pbs，进行涡旋，取10μl至液体闪烁计数器，确认到超过40万c.p.m.。用pbs：丙二醇＝4：1进行稀释，制备成40万c.p.m./10μl的热溶液(1)、含有87μm dhea的10％etoh/90％d-pbs(2)、含有1mm度他雄胺(dutasteride)的50％dmso/50％dw(3)、含有1mm法倔唑(fadrozole)的50％dmso/50％dw(4)，按照(1)：(2)：(3)：(4)＝5:5:1:1的比例混合，将得到的溶液作为基质的溶液。在使用前于37℃的水浴中进行加温。
[0167]
○
酶反应&提取
[0168]
切割单眼上眼睑的睑板腺，将睑板腺露出的一侧朝上，放置于药包纸，用组织切片机(tissue chopper)细切至200μm厚度。将经细切的睑板腺移入hbss中，将基质溶液轻轻涡旋后，将24μl加入到hbss中，进行冲吸。
[0169]
用设置于37℃的培养器内的微量管混合器边摇动边培养30分钟，经30分钟后，在室温下以700g离心1分钟，使睑板腺组织沉淀。取全部量的hbss，移入预先分注有2ml乙酸乙酯的试管中。进行10秒涡旋，停止反应后，立即转移至冰上。
[0170]
向残留有睑板腺的2ml管中加入200μl加温至37℃的hbss，将基质溶液轻轻涡旋后，将24μl加入至hbss中，进行冲吸。加入含有100mm nad

的d-pbs溶液2μl，用设置于37℃的培养器内的微量管混合器边摇动边培养30分钟。在室温下以700g离心1分钟，使睑板腺组织沉淀，取全部量的hbss，移入预先分注有2ml乙酸乙酯的试管。进行10秒涡旋，停止反应后，立即转移至冰上。
[0171]
○
类固醇提取
[0172]
在室温下以1,500rpm离心10分钟，回收处于上层的乙酸乙酯的层1.6ml，在75℃下进行氮气干燥固化。液体蒸发完后，加入500μl的40％can，进行3分钟涡旋。将液体移至安装于2ml管的millipore ultra free-mc，在室温下以12,000g离心2分钟。将玻璃spitz管用500μl的40％can冲洗，进行2分钟涡旋。通过相同柱的过滤器，在室温下以12,000g离心4分钟。通过轻敲将流出物(elute)混合，将10μl加入至透明溶胶3ml中，再置于液体闪烁计数器中(回收率的测定)。
[0173]
○
测定
[0174]
将柱在初始条件下平衡化(直至基线和压力稳定)。制作所测定的样品数的样品组。第1根由于分析不稳定，因此流出40％can作为样品。打开所测定的2ml管的盖，覆盖薄薄拉伸得到的封口膜(parafilm)，设置于hplc。开始连续分析。
[0175]
hplc的条件(3h-dhea)
[0176]
流速：0.7ml/min柱温：40℃
[0177]
梯度
[0178]
0～30min：40～50％acn(0.3％/min)
[0179]
30～35min：70％acn
[0180]
35～40min：100％acn
[0181]
40～50min：100～40％acn(6％/min)
[0182]
50～60min：40％acn
[0183]
○
解析
[0184]
用profsa打开色谱图，使sda(平滑功能)level为8，进行平滑化。在find peaks和locate peaks显示峰，复制report preview并粘贴在word上，取出数据，用以下的式子导出酶活性。
[0185]
[数式1]
[0186][0187]
(3)基于brdu掺入染色的细胞增殖测定
[0188]
在从小鼠采集眼睑组织的30分钟前，将brdu(100mg/kg体重、sigma-aldrich)注射至腹腔内。将包含睑板腺的眼睑用4％pfa固定，并用石蜡进行了包埋。将5μm厚度的切片在10mm柠檬酸钠缓冲液(ph6.0)中加压处理2.5分钟，由此激活了抗原。使用抗brdu抗体(1:1,000稀释；rocklandinc.)将切片在4℃下培养24小时后，使用dako公司的2次抗体envision system-hrp labelled polymeranti-rabbit，利用3,3'-二氨基联苯胺(dab)使免疫反应可视化。在各组织切片中，对睑板腺的基底细胞层的brdu阳性细胞在用20倍的倍率拍摄得到的数字显微照片上进行了计数。用imagej软件对睑板腺腺胞的外周长进行测量，将brdu阳性细胞的总数以其外周长进行标准化。需要说明的是，对每个个体使用16个切片进行了brdu阳性细胞数的计数。
[0189]
[结果]
[0190]
由nmn、nr及其溶剂液(赋形剂(vehicle)，磷酸缓冲生理食盐水)滴眼引起的睑板腺中的hsd3b6酶活性的变化及睑板腺基底细胞中的brdu阳性细胞数的变化示于图3中。通过nmn滴眼，hsd3b6酶活性和brdu阳性细胞数显著地上升。对于nr滴眼组，也观察到同样的hsd3b6酶活性的上升，并且brdu阳性细胞数显著地上升。即，可知：通过nmn、nr的滴眼，在睑板腺局部的hsd3b6酶活性上升，并且睑板腺基底细胞的细胞增殖活性增加。
[0191]
(实施例3：对1.75年龄野生型小鼠滴眼3个月nmn或nr的滴眼实验)
[0192]
[概要]
[0193]
在本实施例中，针对由对1.75年龄野生型小鼠进行3个月nmn或nr滴眼引起的对睑板腺腺组织容量的影响进行证明。
[0194]
[材料及方法]
[0195]
(1)滴眼实验的概要如以下所示。
[0196]
[表2]
[0197][0198]
(2)对于小鼠的睑板腺组织的染色，与实施例1的方法同样地利用整体睑板腺赫克斯海默染色实验方法来进行。
[0199]
[结果]
[0200]
由nmn、nr及其溶剂液(赋形剂(vehicle)，磷酸缓冲生理食盐水)滴眼引起的睑板腺腺容量的变化如图4所示。在nmn滴眼组、nr滴眼组的任一者中均确认到睑板腺腺容量的显著增大。
[0201]
(实施例4：对1.75年龄野生型小鼠滴眼3个月nmn或nr的滴眼实验)
[0202]
[概要]
[0203]
在本实施例中，针对由对1.75年龄野生型小鼠进行3个月nmn或nr滴眼引起的对睑板腺中的脂质成分的影响进行证明。
[0204]
[材料及方法]
[0205]
(1)滴眼实验与实施例3同样地进行。
[0206]
(2)来自小鼠睑板腺的脂质采集及脂质解析
[0207]
从已安乐死的小鼠的眼睑采集睑板腺。将从各动物的单眼采集的2个睑板腺分别放入包含脂质提取用的1ml的氯仿：甲醇＝2：1(v/v)溶剂混合物的玻璃小瓶(glass vial)中，进行脂质的提取。将提取液调换至新的小瓶中。提取液可以在氮气下使溶液蒸发并在-20℃以下保存数月。之后，溶解于适当的溶剂中，利用apci法对脂质组成进行分析。
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[结果]
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nmn或nr滴眼组与作为对照的赋形剂(磷酸缓冲生理食盐水)滴眼组相比，睑板腺中的脂质成分正常化。
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(实施例5：睑板腺中的睾酮的定量)
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[材料及方法]
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用甲醇/水(75：25、v/v)将从眼睑切除的睑板腺匀浆化(homogenize)后，使用isolutesle 小柱(cartridge)(biotage公司)将匀浆液(homogenate)中所含的类固醇提取至二氯甲烷中，在氮气下使其蒸发后，得到残渣。将该残渣溶解于包含10mg/ml浓度的amplifex keto试剂(sciex公司)的甲醇/5％乙酸溶液50μl中，在室温下培养1小时后，通过使用了液相色谱-电喷雾电离质谱联用装置(qtrap 4500lc-ms/ms system；sciex社)的质谱分析，求出睾酮浓度(衍生物srm跃迁：403
→
164)，基于所摘出的睑板腺的湿重量进行标准化。
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[结果]
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野生型及hsd3b6缺失小鼠的睑板腺组织中的睾酮量示于图5中。与野生型小鼠相比，缺失hsd3b6的小鼠的睑板腺局部所含的睾酮减少约50％。此外，摘除了性腺(睾丸)的
hsd3b6敲除小鼠的在睑板腺局部检出的睾酮减少至10％以下。由此可知：在睑板腺组织中，不仅有从睾丸供给的循环睾酮，而且还有与其同程度的睑板腺局部的睾酮产生的贡献。
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可认为：通过滴眼nmn或nr，从而使hsd3b6酶活性上升，因此促进睾酮产生(已知睾酮产生会促进睑板腺的脂质产生)，可将睑板腺组织中的脂质成分组成正常化。
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(注释)
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综上所述，使用本发明的优选实施方式来例示了本发明，但是可理解为本发明应当仅通过权利要求书来解释其范围。在本说明书中引用的专利、专利申请及其他文献可理解为与其内容本身具体记载于本说明书的情况同样地援引该内容作为针对本说明书的参考。本技术对在2019年6月25日向日本专利局申请的日本特愿2019-117642主张优先权，其全部内容如同构成本技术的内容的情况同样地作为参考援引于本文中。
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产业上的可利用性
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本发明可利用于医疗、药品、保健、生物学、生化学等领域中。