生产透明质酸的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及生产透明质酸的方法。


背景技术：

2.透明质酸(hyaluronic acid或hyaluronan,ha)是由葡萄醛酸和氨基葡糖的双糖重复单位所组成的多糖，广泛分布于软骨组织、关节液和皮肤组织的真皮以及表皮中，并在其中起到保湿、营养、修复和预防损伤等生理作用。透明质酸的生产方法有动物组织提取法和发酵法，由于动物组织提取法的制备成本高，分离纯化复杂，逐渐被发酵法所取代。
3.发酵产量是发酵法生产透明质酸成本控制的关键。微生物发酵法生产透明质酸过程中， ph是细胞生长和产物合成的重要环境参数，是代谢活动的综合指标。目前专利文献报道的透明质酸发酵工艺的ph调控大多是恒控ph，如cn101649337a公布的一种透明质酸的制备方法，整个发酵过程为恒控ph7.0。然而，透明质酸菌体生长的最适ph往往并不是产物合成的最佳ph值，恒定ph不利于菌体生长或产物积累。目前也有专利报道ph变动调控的技术方案，如专利cn 1978658 a公开的一种间歇高ph协迫策略提高发酵生产透明质酸产量的方法，透明质酸产量可以由5.0g/l提升至6.7g/l，然而该技术方案工艺控制繁琐不利于生产化放大，且该技术方案长时间维持较高ph会影响菌体活力，较大程度会影响菌体生长，不利于透明质酸合成。
4.因此，找到提升产物合成但又不影响菌体活力的ph调控是透明质酸发酵工艺控制的关键。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
6.为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种生产透明质酸的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将兽疫链球菌进行发酵处理，以便获得透明质酸，其中，所述发酵处理是在如下条件下进行的：在发酵处理开始后的0～6h内，所述发酵处理在ph为6.7～7.2 的条件下进行的；在发酵处理开始后的6～12h内，所述发酵处理在ph为7.4～7.6的条件下进行的；在发酵处理开始后的12h以后，所述发酵处理在ph为6.5～9.0的条件下进行的。
7.根据本发明实施例的生产透明质酸的方法在发酵前期，根据菌体生长特性和透明质酸分泌特性的情况合理进行ph调控，能够确保菌体最佳生长活力。发酵初期(0～6h)，根据兽疫链球菌菌体生长特性，选择适合于菌体生长的最佳ph，有利于菌体适应环境，快速生长；发酵中期(6～12h)，根据菌体生长和产物分泌特性，控制ph为7.4～7.6有助于发酵液实际ph不至于过低而影响菌体生长；在发酵中后期控制发酵在ph为6.5～9.0的条件下进行，可以在保证菌体细胞活性不受影响情况下，有利于减少副产物产生，促进菌体细胞分泌透明质酸。根据本发明实施例的方法，相比于现有技术，透明质酸的产量显著提高。
8.根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
9.根据本发明的实施例，在发酵处理开始后的6～12h内，首先每隔1h将ph提高0.1～
0.2，待ph升至7.4～7.6后，控制所述发酵处理在ph为7.4～7.6的条件下进行。发明人发现，发酵中期(6～12h)，透明质酸出现缓慢积累，发酵液粘度逐渐增大，发酵罐的ph电极检测会出现检测值反馈滞后的现象，通过缓慢提高ph，每隔1h将ph提高0.1～0.2，一方面有助于发酵液实际ph不至于过低影响菌体生长，另一方面，避免快速提升ph影响菌体活力。
10.根据本发明的实施例，在发酵处理开始后的12～30h内，ph维持上下持续波动状态，所述波动的ph下限为6.5～7.0，ph上限为8.0～9.0。发明人发现，在发酵中后期12～30h内，采用ph波动性调控策略，能够兼顾菌体生长和产物合成，发挥发酵合成透明质酸的最佳状态。ph波动性控制为根据菌体活力进行的自动反馈调节，由于发酵过程不同时期的菌体活力有差异，ph波动的周期可进行相应的改变，如发酵中期的菌体活力最高时，ph波动周期最短，之后菌体活力减弱，相应的ph波动周期变长。根据菌体活力情况自动调节，在保证菌体细胞活性不受影响情况下，有利于减少副产物产生，促进菌体细胞分泌透明质酸。
11.根据本发明的实施例，在发酵处理开始后的0～6h内，首先使得发酵培养基ph自然下降至6.7～7.2后，控制所述发酵处理在ph为6.7～7.2的条件下进行。
12.根据本发明的实施例，通过加碱控制所述发酵处理在ph为6.7～7.2的条件下进行。发明人发现，菌体生长、合成代谢的过程持续分泌有机酸，如乙酸、乳酸和丙酮酸，会导致发酵液ph下降，因此，通过加碱控制发酵液的ph，使得ph稳定在6.7～7.2。
13.根据本发明的实施例，所加入的碱为氨水、20～30％浓度的naoh或koh溶液。
14.根据本发明的实施例，所述发酵处理是在通气量为0.5～1vvm，转速为100～600rpm， 37℃的条件下进行29～31h。
15.根据本发明的实施例，所述发酵处理的发酵培养基包括77g/l的葡萄糖，40g/l的蛋白胨，1.3g/l的kh2po4，0.4g/l的mgso4以及4g/l味精。
16.根据本发明的实施例，所述兽疫链球菌的分类命名为streptococcus equisubsp.zooepidemicus hec-se01，马链球菌兽疫亚种hec-se01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m2020231，保藏日期为2020年06月22日，保藏地址为：中国湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学。进而根据本发明实施例方法的透明质酸的产量进一步提高。
17.在本发明的第二方面，本发明提出了一种生产透明质酸的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将兽疫链球菌菌种按照1％体积比接种至种子培养基中，36.5℃200～220rpm 的条件下培养17.5-18h，培养结束前，进行革兰氏染色镜检，无异常后接种至发酵培养基，在15l发酵罐，通气量0.5～1vvm，搅拌转速为100～600rpm，37℃的条件下发酵培养30h，其中，所述种子培养基包括10g/l的葡萄糖，15g/l的蛋白胨，5g/l的酵母浸粉，1.5g/l的 k2hpo4，0.35g/l mgso4，ph 6.5；发酵过程中，发酵罐采用如下ph控制方式：发酵前期 0～6h内：接种后，发酵液ph自然下降至6.7～7.2后，20～30％浓度naoh碱控维持发酵液ph至6.7～7.2；发酵中期6～12h内：6h开始每隔1h将ph提高0.1～0.2，待ph升至7.4～7.6，恒控ph至7.4～7.6；发酵中后期12～30h内：通过改变碱控自控程序参数、蠕动泵恒定速率及电磁阀打开时间使ph维持上下持续波动状态，ph波动下限为6.5～7.0，上限为8.0～9.0，直到发酵结束。根据本发明实施例的方法，相比于现有技术，透明质酸的产量显著提高。
18.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
19.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
20.图1是根据本发明实施例2的ph控制曲线；
21.图2是根据本发明对比实施例1的ph控制曲线；以及
22.图3是根据本发明对比实施例3的ph控制曲线。
具体实施方式
23.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
24.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
25.根据本发明的实施例，本发明所提出的生产透明质酸的方法中ph调控方式具体如下所述：
26.1)发酵前期(0～6h)：接种后，发酵液ph自然下降至6.7～7.2后，碱控维持发酵液ph至6.7～7.2；
27.2)发酵中期(6～12h)，6h开始每隔1h将ph提高0.1～0.2，待ph升至7.4～7.6，恒控ph至7.4～7.6；
28.3)发酵中后期(12～30h)，通过改变碱控自控程序参数、蠕动泵恒定速率及电磁阀打开时间使发酵过程的ph维持上下持续波动状态，设定波动下限为6.5～7.0，上限为8.0～9.0，直到发酵结束。
29.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
30.以下实施例或对比例所用的菌种为兽疫链球菌，保藏编号为cctcc no:m2020231，保藏日期为2020年06月22日，在本技术实施例中称为streptococcus equisubsp.zooepidemicus hec-se01。但绝不限于此兽疫链球菌。
31.种子培养基(g/l)：葡萄糖10，蛋白胨15，酵母浸粉5，k2hpo
4 1.5，mgso
4 0.35， ph 6.5；
32.发酵培养基(g/l)：葡萄糖77，蛋白胨40，kh2po
4 1.3，mgso
4 0.4，味精4。
33.实施例1
34.从超低温冰箱取出甘油管菌种，37℃水浴或者手心溶化，按照1％体积比接种至种子培养基中，36.5℃200～220rpm培养17.5-18h，培养结束前，进行革兰氏染色镜检，无异常后进行接种15l发酵罐，通气量0.5～1vvm，搅拌100～600rpm，37℃发酵培养30h。
35.发酵罐采用如下ph控制策略：
36.发酵前期(0～6h)：接种后，发酵液ph自然下降至6.7后，20～30％浓度naoh碱控维持发酵液ph至6.7。发酵中期(6～12h)，6h开始每隔1h将ph提高0.1，待ph升至 7.4，恒控ph至7.4。发酵中后期(12～30h)，通过改变碱控自控程序参数、蠕动泵恒定速率及电磁阀打开
时间使发酵过程的ph维持上下持续波动状态(具体操作如下：
①
碱控程序中有两个参数，一个是“周期”，指从碱控系统打开蠕动泵或开电磁阀开始计时到下一次打开的时间间隔(前提为每个周期末，ph实际检测值要低于自控值)；另一个是“最大时间”，指在一个周期内，根据每次新周期开始时，程序通过实际检测ph值和设定ph的差值大小来控制蠕动泵或电磁阀打开的最大时间(不会超过周期时间)，最大时间设置值越大，每次加碱时间相应增加。两个参数共同作用能使控制过程出现较大上下波动。
②
改变naoh的流速，即加大蠕动泵速率和装料管(无菌软管或者不锈钢管)粗细。)设定波动下限为6.5，上限为8.0，直到发酵结束。结果显示，12h中间样的菌体浓度(od660)为5.16，放罐透明质酸产量为9.20g/l。
37.实施例2
38.发酵罐采用如下ph控制策略：
39.发酵前期(0～6h)：接种后，发酵液ph自然下降至7.2后，碱控维持发酵液ph至7.2。发酵中期(6～12h)，6h开始每隔1h将ph提高0.2，待ph升至7.6，恒控ph至7.6。发酵中后期(12～30h)，通过改变碱控自控程序参数、蠕动泵恒定速率及电磁阀打开时间使发酵过程的ph维持上下持续波动状态，设定波动下限为7.0，上限为9.0，直到发酵结束。 ph控制曲线如图1所示。结果显示，12h中间样的菌体浓度(od660)为5.42，放罐透明质酸产量为8.52g/l。
40.对比实施例1采用恒控ph
41.发酵罐采用如下ph控制策略：
42.整个发酵过程恒定ph 7.0进行控制，ph控制曲线如图2所示，其他操作同实施例1。结果显示，12h中间样菌体浓度(od660)为4.42，放罐ha产量为6.54g/l。
43.对比实施例2采用反复间隔高ph协迫控制
44.发酵罐采用如下ph控制策略：
45.0～12h，ph调控同实施例1，12h开始采用反复间隔高ph协迫控制，即12h先将ph 调高到8.5，保持1h，再降到7.0，保持1h，再将ph调到8.5，保持1h，
……
，如此反复，直到发酵结束。结果显示，12h中间样的菌体浓度为5.25，放罐ha产量为7.82g/l。
46.对比实施例3前期采用恒控ph，中后期反复间隔高ph协迫控制
47.发酵罐采用如下ph控制策略：
48.0～12h，ph恒控ph 7.0，12h开始采用反复间隔高ph协迫控制，即12h先将ph调高到8.5，保持1h，再降到7.0，保持1h，......，如此反复，直到发酵结束，ph控制曲线如图3所示。结果显示，12h中间样的菌体浓度为4.14，放罐ha产量为7.23g/l。
49.以上实施例和对比例下发酵后菌的浓度以及乳酸副产物和ha的含量如下表1所示。
50.表1：
[0051][0052]
由表1可以看出，在本技术的ph调控策略下，相同时间内菌的浓度更高、乳酸副产物更低、ha的产量更高。
[0053]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0054]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。