一种人工诱导多倍体泥鳅的方法与流程

1.本发明公开了一种人工诱导多倍体泥鳅的方法，属于分子生物学领域。


背景技术：

2.人工诱导产生的鱼类多倍体具有生长速度快、抗逆性强、个体大等显著性特征，可大大提高其经济价值。因而，鱼类人工多倍体研制长期以来是水产界研究的热点。目前在多倍体诱导中常用的方法有三种：生物学方法，通过利用诱导产生的四倍体与普通二倍体杂交产生三倍体的方法；物理学方法，利用温度休克法和静水压法抑制第二极体的排出或抑制第一次有丝分裂而产生三倍体或四倍体的方法；化学方法，利用细胞松弛素b、秋水仙素等化学药物处理抑制第二极体排出或第一次有丝分裂而产生三倍体或四倍体的方法。尽管目前诱导多倍体的方法较多，但其一直存在三倍体诱导率、孵化率和鱼苗存活率普遍较低，四倍体诱导后成鱼难获得等问题，严重制约了鱼类人工多倍体的生产与应用。
3.现有的研究资料表明，鱼类人工多倍体研制与细胞周期密切相关，而细胞周期蛋白依赖性激酶1基因(cyclin dependent kinase 1,cdk1)是调控细胞周期最重要的基因之一，cdk1是成熟促进因子(maturation-promoting factor,mpf)的催化亚基，而mpf是诱导卵母细胞减数分裂成熟的中心因素，在配子形成和性腺发育中起重要作用。泥鳅(misgurnus anguillicaudatus)隶属于鲤形目、鳅科、泥鳅属，其肉质细嫩、营养丰富，有“水中人参”之称，是我国重要的淡水特种经济鱼类。泥鳅天然存在着多种倍性个体。在迄今为止所发现的两性生殖多倍体鱼类中，绝大多数都没有同种的二倍体存在。因此，自然拥有多种基因组倍性共存特性的泥鳅成为了研究鱼类多倍体形成和研制鱼类人工多倍体的一把重要钥匙。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种人工诱导多倍体泥鳅的方法，为多倍体泥鳅的生产应用提供坚实的理论和技术支持。
5.为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
6.一种人工诱导多倍体泥鳅的方法，包括以下步骤：
7.1)利用crispr/cas9系统敲除核苷酸序列如seq id no.1所示的泥鳅cdk1基因，得到二倍体泥鳅的cdk1基因突变体；
8.2)利用二倍体泥鳅的cdk1基因突变体自交获得cdk1基因敲除的二倍体泥鳅纯合子；
9.3)选择雄性性腺发育良好的cdk1基因敲除的二倍体泥鳅纯合子分别与雌性性腺发育良好的野生型二倍体和四倍体泥鳅进行繁殖，获得其繁殖子代。
10.优选地，所述cdk1基因的敲除方法包括以下步骤：
11.1)按照crispr/cas9敲除原理，在泥鳅cdk1基因orf序列上设计敲除靶位点；
12.2)在泥鳅cdk1基因序列上设计含有敲除靶位点序列的上游引物及下游引物，以泥
鳅cdna为模版进行pcr扩增，进行体外转录、纯化后得到grna；
13.3)以线性化cas9质粒为模版，体外转录、纯化后得到cas9mrna；
14.4)对二倍体泥鳅受精卵显微注射grna和cas9mrna，之后将受精卵进行孵化培育；得到二倍体泥鳅的cdk1基因突变体。
15.进一步优选地，所述敲除靶位点序列如seq id no：2所示。
16.进一步优选地，所述上游引物序列如seq id no：3所示，所述下游引物序列如seq id no：4所示。
17.进一步优选地，所述grna的注射浓度为40ng/μl，所述cas9mrna的注射浓度为550ng/μl，注射剂量均为2.5nl，注射部位为动物极。
18.优选地，所述二倍体泥鳅纯合子的获得方法是：利用f0代二倍体泥鳅的cdk1基因突变体与野生型二倍体泥鳅进行繁殖获得f1代，挑选出同一突变类型的f1代进行自交获得f2代，再将f2代的纯合突变体进行自交便可获得cdk1基因敲除的二倍体泥鳅纯合子。
19.更为具体的技术方案如下：
20.(1)选择体质健壮发育良好的二倍体泥鳅作为亲本进行繁殖，利用crispr/cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/cas9)技术，制备获得cdk1基因敲除纯合子泥鳅(即cdk1-/-泥鳅)，并利用自制的泥鳅cdk1抗体，采用western blot(wb)方法对该敲除纯合子进行验证。
21.(2)利用上述获得的cdk1-/-性腺发育良好的雄性泥鳅分别与野生型二倍体和四倍体雌性性腺发育良好的泥鳅(即cdk1-/-×
2n wt
♀
，cdk1-/-×
4n wt
♀
)进行人工繁殖，获得其繁殖子代。
22.(3)通过倍性分析仪对两种繁殖类型子代的倍性进行检测，统计其三倍体和四倍体的比例。经统计，cdk1-/-×
2n wt
♀
的子代中有5.3％的三倍体鱼，cdk1-/-×
4n wt
♀
子代中存在14.7％的四倍体鱼。
23.(4)鉴于以上发现，发明人通过制备泥鳅精母细胞减数分裂染色体标本观察并统计了cdk1-/-泥鳅精母细胞减数分裂期未减数配子的比例。经统计，我们在cdk1-/-泥鳅精母细胞减数分裂染色体标本中发现了有22.2％的精母细胞形成了50个二价体。
附图说明
24.图1为cdk1基因敲除成功二倍体泥鳅的验证结果。
25.图2为泥鳅cdk1-/-×
2n wt
♀
产生三倍体的倍性检测峰图和比例(a)以及该三倍体与正常二倍体生长对比图(b)。
26.图3为泥鳅cdk1-/-×
4n wt
♀
产生四倍体的倍性检测峰图和比例。
27.图4为泥鳅cdk1-/-精母细胞减数分裂染色体标本产生50个二价体的比例。
具体实施方式
28.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
29.实施例1泥鳅cdk1基因的获得
30.1、泥鳅卵巢总rna的提取
31.使用takara公司rnaiso plus试剂进行泥鳅总rna的提取，具体步骤如下：
32.1)提取rna所用器皿：剪刀、镊子均要用depc处理过夜；所用到的水为takara公司购买的rnase-free water；离心ep管，各型号枪头为提rna专用的进口枪头。注意：提取总rna过程中要及时佩戴口罩，手套。实验前将取样器械置于冰上预冷；
33.2)取雌性泥鳅实施安乐死，快速取出卵巢组织，并取30mg-50mg组织样品于2ml离心管中，离心管置于冰浴，事先加入1.5ml rnaiso plus试剂，3颗经depc水浸泡过夜并高压灭菌处理的氧化锆珠。加好后使用组织破碎仪破碎至呈无颗粒透明状即可；
34.3)向上述匀浆裂解液中加入氯仿，用量为rnaiso plus试剂体积的1/5，盖上离心盖，用手剧烈震荡15s，待充分乳化后，再室温静置5min；
35.4)将离心管移至低温高速离心机，12000r/min、4℃离心15min；
36.5)由离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，无色上清液，中间白色蛋白质层及带有鲜红颜色的下层有机层，吸取上清液到另一新离心管中；
37.6)向上清液中加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温条件下静置10min；
38.7)于低温离心机中，12000r/min离心批评，试管底部会出现沉淀；
39.8)rna沉淀的清洗：小心弃去上清液，缓慢地沿管壁加入75％乙醇溶液1ml，轻轻颠倒混匀洗涤管壁，12000r/min、4℃离心5min后小心弃去乙醇；
40.9)于超净工作台中室温干燥沉淀2-5min，加入10-20μl rnase-free water溶解沉淀；
41.10)将充分溶解的rna样品取1-2μl，用1-2％琼脂糖凝胶电泳检测rna的提取结果；
42.11)将充分溶解的rna样品取1-2μl，用紫外分光光度计检测rna浓度与纯度。
43.2、cdna第一链的合成
44.1)泥鳅卵巢cdna第一链的合成使用逆转录试剂盒1st strand cdna synthesis kit(takara，日本)；记录由紫外分光光度计测定的rna样品浓度。
45.2)在提取rna专用离心管中配制10μl如下反应体系：
[0046][0047]
3)将该反应体系置于pcr仪上42℃2min后，冰上急冷。
[0048]
4)另取提取rna专用离心管中配制10μl如下反应体系：
[0049][0050]
5)混合均匀，置于pcr仪运行程序：37℃15min；85℃5s；4℃停止。
[0051]
3、cdna基因核心区序列引物设计
[0052]
由ncbi数据库中获取斑马鱼等鱼类cdk1基因全长cdna序列，后进行多重比对，读取这些鱼类氨基酸序列的保守区域设计合成1对简并引物：
[0053]
f：acttyaccakcccktactsggactggc
[0054]
r：atgtcttcmgtgyaggggbccgccaacg
[0055]
预期pcr产物片段大小为500bp左右。经合成的引物12000r充分离心，后用去离子双蒸水(ddh2o)将引物溶解至浓度为20μmol/l,置于-20℃条件下保存备用。
[0056]
4、泥鳅cdk1核心片段的pcr扩增
[0057]
1)配制如下60μl pcr反应体系：
[0058][0059]
2)将反应体系混匀，离心后置于pcr仪上，进行pcr反应。泥鳅cdk1基因核心片段pcr扩增条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸10min。注意：配制反应体系时必须在冰上进行。
[0060]
3)pcr纯化产物与pmd-19t载体的连接，小型离心管中10μl反应体系如下：
[0061]
纯化pcr产物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
4μl
[0062]
pmd19-t载体
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μl
[0063]
solution
ⅰꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5μl
[0064]
4)将该10μl体系混合均匀，置于pcr仪上，设置程序16℃30min反应，取全部反应产物转化入dh5α(100μl)感受态细胞中，涂布于lb/amp平板上，37℃倒置培养过夜；挑取单菌落置于5ml lb/amp液体培养基中，37℃/180rpm振荡培养10-12h至菌液浑浊；取500μl菌液测序送往武汉擎科生物有限公司，使用abi prismtm全自动荧光测序仪完成序列测定，测序要求为双向测序，并进行校对与拼接，得到泥鳅cdk1基因核心序列。
[0065]
5、泥鳅cdk1基因5’、3
’‑
race cdna的合成
[0066]
1)5
’‑
race引物的设计
[0067]
根据步骤4中克隆得到的泥鳅cdk1基因cdna核心序列，使用smart race cdna amplification kit(clontech,usa)试剂盒，按照试剂盒说明设计5
’‑
race上游引物如下：
[0068]5’
端的扩增：
[0069]
outer1：cattgcttgccgtgctgaaatcctc
[0070]
iner1：ccgagagtggcaaaacagaatcccc
[0071]
下游引物upm(通用混合引物universal primer mix)、nup(upm的嵌套引物nested universal primer)由试剂盒提供。
[0072]
2)泥鳅cdk1基因cdna 5’末端
[0073]
使用smart race cdna amplification kit(clontech,usa)试剂盒，进行5
’‑
race pcr扩增(使用巢式引物扩增)，1st pcr反应体系(10μl体系)如下:
[0074][0075]
pcr扩增反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。
[0076]
嵌套pcr反应(60μl)体系：
[0077][0078]
pcr扩增反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。
[0079]
3)5
’‑
race pcr产物的pmd-19t载体克隆
[0080]
将5
’‑
race pcr产物按照步骤4中的操作步骤进行pmd-19t载体克隆，最后将阳性克隆送往武汉擎科生物有限公司进行测序，得到泥鳅cdk1基因cdna 5’末端序列信息。
[0081]
4)再按照上述得到泥鳅cdk1基因cdna3’末端序列信息。其中，3
’‑
race上游引物如下：
[0082]3’
端的扩增：
[0083]
outer2：acgaaacacacaaggcaaccgcg
[0084]
iner2：gtacgcctgctggatgttctgatgc
[0085]
1st pcr反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。嵌套pcr94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。
[0086]
6、泥鳅cdk1基因序列信息的确定
[0087]
将步骤4和步骤5中得到的序列拼接，得到泥鳅cdk1基因全长序列信息。该基因全
长序列如seq id no：1所示。
[0088]
实施例2基因的敲除及多倍体泥鳅的育种
[0089]
1、crispr/cas9靶位点设计及确认
[0090]
根据靶位点通式：5
’‑
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-ngg-3’(n为任意碱基)及靶位点基本设计原则，在泥鳅cdk1基因的orf序列上，设计cdk1基因靶位点。设计靶位点序列信息如seq id no：2所示。同时在靶位点周围设计如下正反引物进行pcr扩增，f：gaaggtaagtcgtttgtcataag
[0091]
r：ggagtccaggtattttttcag
[0092]
体系如下：
[0093][0094]
pcr扩增反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。
[0095]
得到扩增产物序列信息，然后和靶位点序列比较，发现结果相同，说明靶位点可用，可以进行下一步。
[0096]
2、grna的制备
[0097]
首先，设计含有cdk1基因靶位点序列的grna上游引物及与其匹配的下游引物：
[0098]
f：ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt
[0099]
r：ctaatacgactcactatagggc
[0100]
在灭菌pcr管中配制如下反应体系：
[0101][0102]
pcr扩增反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。
[0103]
再利用axygen公司的axyprep pcr清洁试剂盒对产物进行清洗回收，主要步骤如
下：
[0104]
1)在pcr产物中加150μl的buffer pcr-a；
[0105]
2)混匀后，转移到制备管中，将制备管置于2ml离心管(试剂盒内提供)中，12,000
×
g离心1min，弃滤液；
[0106]
3)将制备管置回2ml离心管，加700μl buffer w2，12,000
×
g离心1min，弃滤液；
[0107]
4)将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加25μleluent，室温静置1min。12,000
×
g离心1min洗脱回收dna。
[0108]
然后利用ambion公司的t7kit试剂盒对洗脱回收dna进行体外转录，主要步骤如下：
[0109][0110]
1)将上述试剂加入灭菌ep管中，37℃水浴1h，然后加入1μl turbo dnase，37℃水浴15min以去除dna模板，最后用ambion公司的mirvana
tm
mirna isolation kit进行回收，步骤如下：
[0111]
用rnase-free water将grna转录体系稀释到300μl，加入330μl无水乙醇；
[0112]
2)将溶液加到回收柱中，10000g离心15s；
[0113]
3)加入700μl的mirna wash solution i，离心10s；
[0114]
4)加入500μl的wash solution ii，离心10s；重复一次；
[0115]
5)弃去收集管中的液体，离心1min，去除残余的液体；
[0116]
6)加入适量95℃预热的rnase-free water，最大转速离心30s，收集得到grna溶液，测得浓度为1210ng/μl，零下80℃保存。
[0117]
3、cas9mrna的制备
[0118]
通过xbai单酶切线性化psp6-2snls-spcas9载体(37℃水浴，4h以上)，取少量电泳确认线性化完全后，直接回收线性化产物。以纯化后的线性化cas9质粒为模版，进行体外转录得到cas9mrna，将其纯化后于-80℃保存。保存浓度为900ng/μl。纯化回收和体外转录同步骤2。
[0119]
4、体外显微注射
[0120]
注射前一晚，选择体质健壮发育良好的二倍体泥鳅作为亲本进行人工催产，人工催产药物的剂量为雌鱼lrh-a
2 40ug/kg、dom 4mg/kg，雄鱼减半。然后将亲本置于28℃的曝气水中静养。第二天早上待雌鱼可以顺利挤出卵时即可进行人工授精。获得受精卵后用吸管吸到显微注射板上，通过显微注射仪对1细胞期的受精卵进行显微注射，cas9mrna的终浓度为550ng/μl，grna的终浓度为40ng/μl，每次注射的量为2.5nl，注射部位为动物极。注射完毕后将受精卵置于28℃恒温微曝气培养箱进行孵化培育。
[0121]
5、cdk1基因突变体的筛选
[0122]
受精卵孵化出膜后，随机选取5尾仔鱼，分别提取基因组dna进行pcr扩增后送至武汉擎科生物有限公司测序，根据测序结果在靶位点上出现双峰即为敲除成功的f0个体(图1)。然后利用敲除成功的f0代cdk1基因突变体与野生型二倍体泥鳅进行繁殖获得f1代，经测序挑选出同一突变类型的f1代进行自交获得f2代。再将f2代的纯合突变个体进行自交便可获得cdk1基因敲除纯合子泥鳅(即cdk1-/-泥鳅)，并利用自制的泥鳅cdk1抗体，采用western blot(wb)方法对该纯合子进行敲除验证。
[0123]
6、利用上述获得的cdk1-/-性腺发育成熟的雄性泥鳅分别与野生型二倍体和四倍体雌性性腺发育成熟的泥鳅(即cdk1-/-×
2n wt
♀
，cdk1-/-×
4n wt
♀
)进行人工繁殖(人工繁殖的方法同上所述)，获得其繁殖子代。
[0124]
7、待上述两种繁殖类型子代长至4-5cm时，利用倍性分析仪对其进行倍性检测，具体流程如下：
[0125]
1)将待检测倍性的泥鳅利用ms222麻醉剂进行麻醉，然后使用抗凝剂浸润过的1ml注射器进行尾静脉取血，取血后将针头取下后将血液转入1.5ml离心管中，向其中加入500μl的pbs缓冲液(nacl 137mmol/l,kcl 2.7mmol/l,na2hpo
4 4.3mmol/l,kh2po41.4mmol/l)于冰上备用；
[0126]
2)利用血细胞dna相对含量法进行倍性鉴定。倍性鉴定前利用大鳞副泥鳅(2n)血液进行倍性标定。待测样品血液检测上样体系为300μl稀释抗凝待测血液 100μldapi染料，避光染色3～5min，流式细胞仪进行上样检测，比较待测样本血细胞峰值确定倍性。经统计，cdk1-/-×
2n wt
♀
的子代中有5.3％的三倍体鱼(图2)，cdk1-/-×
4nwt
♀
子代中存在14.7％的四倍体鱼(图3)。
[0127]
8、鉴于以上发现，我们对cdk1-/-成鱼采用体内注射秋水仙素法制作精巢染色体标本，其具体步骤如下：
[0128]
1)腹腔注射秋水仙素溶液，剂量为6μg/g鱼体质量，效应时间为3～4h；
[0129]
2)随后将鱼用ms-222麻醉剂进行麻醉，剪尾柄放血5～10min，后解剖取乳白色精巢放入生理盐水中漂洗几次，并移入0.075mol/l kcl低渗溶液中常温低渗20min，期间更换一次低渗液；
[0130]
3)精巢低渗后，吸出低渗液加入新鲜的卡诺氏固定液(甲醇：冰醋酸＝3：1)固定15min；
[0131]
4)吸出卡诺氏固定液再加入新鲜的卡诺氏固定液，重复固定2次，更换新配制的卡诺固定液并放入冰箱-20℃冷冻过夜；
[0132]
5)次日取固定好的精巢组织放入小烧杯中，并加入1～2滴50％冰醋酸溶液解离精巢组织，用手术剪刀将精巢组织剪碎并加入适量新配制的卡诺固定液(甲醇：冰乙酸＝3：1)，于300目的筛网上过滤，将制成的悬液滴于预热过的载玻片上，火焰干燥；
[0133]
6)瑞氏-姬姆萨染色，显微镜下观察拍照。
[0134]
经统计，我们在cdk1-/-泥鳅精母细胞减数分裂染色体标本中发现了有22.2％的精母细胞形成了50个二价体(图4)。
[0135]
综上所述，本发明是利用crispr-cas9技术系统敲除鱼类cdk1基因诱导鱼类多倍体的方法，从而实现水产动物的快速生长育种。本发明在二倍体泥鳅中敲除cdk1基因通过后裔检测发现了一定比例的多倍体，然后通过精巢染色体制备，同样发现了一定比例50个
二价体的存在。鱼类人工多倍体研制长期以来是水产界追踪研究的热点和难点，该发明通过基因突变诱导鱼类多倍体势必是未来研究鱼类多倍体的一个重要方向。与传统的多倍体诱导方法相比，本专利方法具有准确性高、稳定性强的特点，与转基因育种相比，由于基因敲除是使鱼本身的基因功能缺失，不会引入外来基因，因此不存在转基因安全问题。