一种人工诱导多倍体泥鳅的方法与流程

技术特征：
1.核苷酸序列如seq id no.1所示的泥鳅cdk1基因在人工诱导多倍体泥鳅中的应用。2.一种人工诱导多倍体泥鳅的方法，其特征在于包括以下步骤：1)利用crispr/cas9系统敲除核苷酸序列如seq id no.1所示的泥鳅cdk1基因，得到二倍体泥鳅的cdk1基因突变体；2)利用二倍体泥鳅的cdk1基因突变体自交获得cdk1基因敲除的二倍体泥鳅纯合子；3)选择雄性性腺发育良好的cdk1基因敲除的二倍体泥鳅纯合子分别与雌性性腺发育良好的野生型二倍体和四倍体泥鳅进行繁殖，获得其繁殖子代。3.如权利要求2所述人工诱导多倍体泥鳅的方法，其特征在于，所述cdk1基因的敲除方法包括以下步骤：1)按照crispr/cas9敲除原理，在泥鳅cdk1基因orf序列上设计敲除靶位点；2)在泥鳅cdk1基因序列上设计含有敲除靶位点序列的上游引物及下游引物，以泥鳅cdna为模版进行pcr扩增，进行体外转录、纯化后得到grna；3)以线性化cas9质粒为模版，体外转录、纯化后得到cas9mrna；4)对二倍体泥鳅受精卵显微注射grna和cas9mrna，之后将受精卵进行孵化培育；得到二倍体泥鳅的cdk1基因突变体。4.如权利要求3所述人工诱导多倍体泥鳅的方法，其特征在于：所述敲除靶位点序列如seq id no：2所示。5.如权利要求3所述人工诱导多倍体泥鳅的方法，其特征在于：所述上游引物序列如seq id no：3所示，所述下游引物序列如seq id no：4所示。6.如权利要求3所述人工诱导多倍体泥鳅的方法，其特征在于：所述grna的注射浓度为40ng/μl，所述cas9mrna的注射浓度为550ng/μl，注射剂量均为2.5nl，注射部位为动物极。7.如权利要求2所述人工诱导多倍体泥鳅的方法，其特征在于，所述二倍体泥鳅纯合子的获得方法是：利用f0代二倍体泥鳅的cdk1基因突变体与野生型二倍体泥鳅进行繁殖获得f1代，挑选出同一突变类型的f1代进行自交获得f2代，再将f2代的纯合突变体进行自交便可获得cdk1基因敲除的二倍体泥鳅纯合子。

技术总结
本发明公开了一种人工诱导多倍体泥鳅的方法。通过CRISPR/Cas9技术构建cdk1基因敲除纯合子二倍体泥鳅(即cdk1-/-泥鳅)，然后利用cdk1-/-雄性泥鳅分别与天然二倍体(2N)和四倍体(4N)雌性泥鳅(即cdk1-/-×


技术研发人员：曹小娟 张运邦 高坚
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2021.11.18
技术公布日：2022/1/28