与肿瘤相关的微卫星不稳定的位点组合及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及与肿瘤相关的微卫星不稳定的位点组合及其应用。


背景技术：

2.微卫星（microsatellite, ms），又称短串联重复序列，是单位长度在1-6个碱基之间的短重复核苷酸序列，广泛存在于真核生物基因组中。微卫星不稳定性（microsatellite instability, msi）表示微卫星基因座中核苷酸的插入或缺失。微卫星区域的改变通常发生在dna复制过程中。dna错配修复（mmr）蛋白，如mlh1、msh2、msh6、pms2负责msi的修复。mmr基因的胚系或体细胞失活反过来可能导致msi。msi在很多癌症类型中都有发现，其中结肠癌和子宫内膜癌的发病率最高。mmr蛋白的胚系突变与林奇综合征的发病机制相关，该综合征约占mmr缺陷结直肠癌的20%。对于散发性结直肠癌，10%-15%的病例中发现微卫星位点的体细胞突变。msi状态与pd-l1及肿瘤突变负荷一起成为免疫治疗的重要生物标志物。临床试验表明，msi患者对pd-1/pdl1药物的治疗有改善反应，准确高效地确定msi状态有助于指导临床医生选择免疫治疗方案。
3.常规的msi检测方法包括msi-pcr或间接通过免疫组化(ihc)染色检测mmr蛋白表达。msi-pcr是通过在肿瘤和配对正常组织中扩增5个或更多的微卫星位点，通过比对配对样本的重复次数来确定msi状态。msi-pcr对肿瘤纯度要求较高（20%），且dna降解严重可能影响msi-pcr检测。mmr ihc是一种评估四种临床相关mmr蛋白（mlh1、msh2、msh6、pms2）表达水平的检测。但临床ihc染色中包含的mmr相关标志物并没有覆盖所有mmr相关基因，可能导致ihc与msi-pcr相关性较低。且ihc结果的判定需要医生解读，因此医生的专业性及主观性对结果的影响很大。
4.随着二代测序（next generation sequencing, ngs）技术成为肿瘤学领域的主流技术，基于ngs的msi检测方法正在兴起。使用ngs技术，同时评估患者msi状态及突变情况，可以避免使用msi-pcr或msi ihc方法评估msi状态并使用ngs技术检测患者的突变情况下，两次取样的弊端，且能降低检测成本。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供与肿瘤相关的微卫星不稳定的位点组合及其应用。
6.目前msi检测最常用的方法是对肿瘤组织样本进行msi-pcr或ihc分析。肿瘤纯度低和dna降解严重会影响msi-pcr检测结果，且操作过程复杂，花费较高，在结果判定过程中会遇到诸如荧光过强或过少、非特异性峰、不显著的峰大小改变等。使用ihc评估mmr蛋白水平存在使用抗体不一致，病理医生阅片标准不一致的问题。若使用以上两种方法评估msi状态，一般需额外再对患者取样使用ngs方法检测突变情况，评估用药靶点的突变情况及肿瘤突变负荷水平。鉴于此，本发明提供基于ngs技术使用较少微卫星位点评估msi状态的组合位点及其评估方法。
7.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一套与肿瘤相关的微卫星不稳定的位点组合，包括ms1~ms9共9个微卫星位点，ms1~ms9分别位于人1号染色体161309336-161309346bp，人2号染色体39240585-39240595bp，人3号染色体52696311-52696321bp，人3号染色体169992976-169992993bp，人6号染色体32166161-32166173bp，人11号染色体118353038-118353053bp，人19号染色体50911948-50911959bp，人22号染色体41545025-41545038bp，人x染色体44949952-44949962bp。
8.上述物理位置基于人类基因组版本号hg19。
9.ms1~ms9的核苷酸序列分别如seq id no:1~9所示。
10.第二方面，本发明提供用于扩增所述位点组合的引物以及含有所述引物的检测试剂或试剂盒。
11.第三方面，本发明提供所述位点组合的以下任一应用：1）用于制备辅助诊断肿瘤患者的检测试剂；2）用于辅助诊断肿瘤患者；3）用于制备指导肿瘤患者辅助化疗、免疫治疗用药及预测免疫治疗获益的检测试剂；4）用于指导肿瘤患者辅助化疗、免疫治疗的用药及预测免疫治疗获益。
12.所述肿瘤包括但不限于结直肠癌、林奇综合征、胃癌、子宫内膜癌、小肠腺癌、胰腺癌、前列腺癌、食管癌、胃食管交界肿瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝胆肿瘤、乳腺癌。
13.所述免疫治疗包括但不限于pd-1/pd-l1免疫抑制剂治疗。
14.用于化疗的药物包括但不限于5-fu、伊立替康。
15.具体地，根据待测样本的9个微卫星位点的稳定状态计算msi-score，将该样本的9个微卫星位点中不稳定的位点个数记为m，以0.4为判断阈值：若m/9》0.4，则判定该样本为微卫星不稳定msi-h，若0≤m/9≤0.4，则判定该样本为微卫星稳定mss。
16.进一步地，待测样本（患者肿瘤组织并提取dna）来自于测序数据，优选ngs测序数据。
17.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：本发明仅需一次取样即可同时评估ms状态及获得样本可用药靶点的突变情况，有效避免人工判断的主观因素影响结果。并可以减低检测成本，使用的检测位点越少则成本越低，本发明的ms位点组合相对较少。
18.针对msi检测，目前行业内通用方法有msi-pcr及免疫组化（ihc）。使用ihc检测msi相对较简单，成本较低，但存在一些问题，如使用抗体的不一致、病理医生阅片标准不一致等。msi-pcr检测技术是检测msi的“金标准”，但操作过程复杂，花费较高，且在结果判定时存在以下问题，如荧光过强或过少、非特异性峰、不显著的峰大小改变等。使用ngs方法检测msi可以有效避免以上两种方法在检测msi过程中存在的问题。对于多数实体瘤患者，单独进行msi检测的成本-效益比过低，而基于ngs的msi检测可同时捕获多短基因序列，高效利用样本，获得肿瘤突变负荷，胚系突变、体系突变、可用药靶点信息等，提高检测的成本-效益比。使用的检测位点越少，则使用ngs方法进行检测的成本越低，本发明的ms位点组合为现有的最少的位点组合。
附图说明
19.图1为本发明较佳实施例中不同ms分组对应msi-score的箱式图，横轴为经msi-pcr检测方法判定的样本的ms状态分组，纵轴为使用mantis软件计算的msi-score，一个点代表一个样本，箱子的上须线和下须线分别代表最大值和最小值，上顶线和下顶线分别代表上四分位和下四分位，箱体内线代表中位数。
20.图2为本发明较佳实施例中基于363个ms位点的检测情况。
具体实施方式
21.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册（sambrook j & russell dw, molecular cloning: a laboratory manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
22.实施例1 与肿瘤相关的微卫星不稳定的位点组合的获得包括以下步骤：1、扫描人类参考基因组上可用的重复单位为1-5碱基重复长度在10-100碱基的ms位点2952815个。
23.2、因使用单碱基重复ms位点比使用多碱基重复ms位点具有更高的敏感性，因此筛选出步骤1中的单碱基重复ms位点2263个。
24.3、选出检测癌症驱动突变、用药靶点突变的panel所覆盖的ms位点363个。
25.4、在28例原发性结直肠癌（微卫星高度不稳定（msi-h）7例，微卫星稳定（mss）21例）训练集样本中，使用mantis软件计算步骤3中363个ms位点的msi打分msi-score；msi-score计算方法为判定每个样本中363个位点的稳定性，计算不稳定位点占所有363个位点的比例，即为msi-score。
26.5、以0.4为判断阈值，msi-score大于0.4判定为msi-h，msi-score介于0~0.4之间（含端点值）判定为mss。
27.使用决策树分类器，以100%的敏感性筛选出能显著区分训练集样本中的msi-h和mss样本的ms位点9个。
28.最终获得一套与肿瘤相关的微卫星不稳定的位点组合，包括ms1~ms9共9个微卫星位点，ms1~ms9的位点信息如表1所示：表1
实施例2 与肿瘤相关的微卫星不稳定的位点组合的应用以msi-pcr结果为金标准，评估使用表1中的9个位点判定ms状态的性能。
29.1、取用36例原发性结直肠癌患者（7例msi，29例mss）的肿瘤组织及癌旁组织并提取dna：1）取绿豆大小的新鲜组织，用一次性刀片切成碎末加到离心管中；2）分别向管中加入蛋白酶k和裂解液，56℃孵育过夜直至样本完全裂解；3）加入缓冲液及无水乙醇充分混匀，转移到吸附柱中，加入漂洗液，离心、弃废液，洗脱盐分；4）将吸附柱转移到新的收集管中，加入洗脱液，收集dna。
30.2、使用包含9个ms位点及肿瘤驱动基因、遗传性癌症相关基因、靶向用药位点等大小为2.2m的panel进行靶向捕获测序：1）取50-100ng打断后的基因组dna，使用mgieasy通用dna文库试剂盒进行杂交前文库（预文库）构建；2）构建好的预文库，使用xgen hybridization and wash试剂盒进行杂交洗脱；3）杂交后的文库，通过pcr扩增富集目的片段，pcr产物分别使用labchip gx touch nucleic acid analyzer和qubit fuorometer测定文库质量和浓度；4）在mgiseq-2000平台上进行100bp的双端测序。
31.3、测序数据处理：1）数据质控：去除测序接头、低质量测序序列（长度《35bp，低质量碱基（碱基质量《25）含量超过60%的序列）；2）数据比对：测序数据使用bwa软件比对到人类参考基因组hg19，并使用picard软件去除重复序列。
32.4、计算msi-score：使用mantis软件判断样本在9位点的ms稳定状态并计算msi-score。
33.5、性能评估：图1结果显示，使用9个位点的判定结果与金标准msi-pcr的结果一致，敏感性及特异性达100%。
34.基于363个ms位点的检测情况：使用363个ms位点对28例原发性直结肠癌患者（7例msi-h，21例mss）计算msi-score，评估ms状态，并与msi-pcr判定结果进行比较，结果见图2。结果显示，一例msi-h样本的msi-score为0.3416，低于判定阈值0.4，使用363位点的结果会将此样本错判为mss，说明这363位点中存在敏感性较低的位点。
35.采用ngs方法已经成为检测msi的新工具，不仅能用来检测msi，而且可以同时获得基因突变等对诊疗及用药有用的重要信息。结果表明，本发明可以达到100%的敏感性及特异性，可以替代msi-pcr，ihc等检测方法。本发明用来分析的9个ms位点，是现有应用ngs检测msi中使用位点数相对较少的组合，可以进一步使用ngs方法降低检测msi的成本。
36.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。