一种用于治疗肝纤维化的药物递送载体组合物及其制备方法与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于治疗肝纤维化的药物递送载体组合物及其制备方法。


背景技术：

2.肝纤维化是由毒素、病原体、代谢性疾病或自身免疫性疾病引起的慢性肝损伤，易于导致重复的组织堆积，并可能进一步发展为肝硬化、肝衰竭，甚至肝癌。任何原因的慢性肝损伤都会导致肝纤维化，干扰正常的组织功能。
3.肝星状细胞(hsc)的活化是肝纤维化的关键因素。在正常肝脏中，hsc处于静止状态。在纤维原性刺激之后，hsc被激活，然后转化为表达平滑肌肌动蛋白(α-sma)的肌成纤维样细胞，导致肝组织收缩并产生大量细胞外基质(ecm)和基质金属蛋白酶抑制剂(timp)。肝脏中ecm的合成和降解失衡，异常胶原纤维沉积增加，促进肝纤维化的发展。因此，活化的hsc是肝纤维化药物干预治疗的重要靶点。
4.大量研究表明，在纤维化肝脏中，许多受体在活化的hsc表面过度表达，因此目前常用的一个靶向手段是在纳米颗粒表面修饰能与hsc表面受体相结合的特异性配体，利用配体-受体结合介导的靶向作用，进而将纳米颗粒精确递送到hsc中。
5.而目前治疗肝纤维化的药物种类很多，主要是通过作用于肝纤维化发生的不同环节达到抗肝纤维化的目的，包括针对肝星状细胞的药物、针对细胞因子的药物、影响胶原合成及代谢的药物、保护和阻止肝损伤的药物等。但部分药物单独使用具有一定的毒性，且特异性较差，生物利用度较低，半衰期较短。
6.纳米药物递送系统是目前新兴的一种药物制剂，通过合理的设计，纳米载体能够准确地将药物递送到靶部位及靶细胞，延长药物的体循环时间，提高治疗效果，减少不良反应，为肝纤维化治疗提供了新方法及新思路。
7.其中，纳米材料作为一种多功能材料，在材料、生物以及医学等领域都有巨大的发展前景。另外，作为当今医学界研究的热点，纳米材料已被广泛应用于药物传输系统的构建。经自组装得到的复合纳米材料是指同时含有亲水性和疏水性链段并能在水相中自组装成的核壳结构纳米颗粒。亲水性的外壳用于避免被网状内皮系统识别，延长体循环时间，疏水性的内核可包载疏水性药物并提高其溶解性和稳定性。纳米载体表面还可进行多种修饰或连接改性的特异性靶向分子，从而实现药物对病变部位的特异性靶向。
8.例如，中国专利cn 102961360 b公开一种氧化苦参碱肝靶向纳米给药系统及制备方法，此系统是以聚乙二醇-聚己内酯嵌段聚合物为载体，通过薄膜分散法、逆向蒸发法或有机溶剂注入法制备聚合物纳米粒，并将氧化苦参碱包载于所述聚合物纳米粒中，然后在该纳米粒表面修饰配体新糖蛋白或环八肽作为配基，构建针对肝星状细胞的抗肝纤维化纳米靶向给药系统，该系统可增加纳米粒通过血液循环进入肝脏的机会，有利于药物在肝脏病灶部位靶向分布，有利于载药纳米粒在肝脏病变部位吸收及肝星状细胞的摄取以提高肝纤维化治疗效果。但是该给药系统在进入细胞后，无法对目标序列进行高效切割，如利用游
离的探针和酶碰撞靶标底物，碰撞概率又比较低，极易出现脱靶的情况。
9.基因编辑，是一种新兴的比较精确的能对生物体特定基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术或过程。迄今为止，已经报道了许多基因编辑系统，如锌指核糖核酸酶(zfn)系统、转录激活样效应因子核酸酶(talen)系统和成簇规律间隔短回文重复系统(crispr-cas)系统等。crispr相关系统已经应用于细胞、动物和植物的基因组和表观遗传修饰，呈现出巨大潜力。然而，目前几乎所有的crispr相关系统都需要pam(protospacer adjacent motif)序列来定位靶标，这限制了人类基因组中的靶标空间。另一方面，crispr相关系统的关键cas9和cas12蛋白由于体积较大，因而不便于在体内进行包装和运输。另外，文献报道cas9蛋白可以切割dna序列，cas13蛋白可以切割rna序列，但尚没有一种cas蛋白可以很好地同时切割dna和rna，这可能会限制其应用。
10.目前已有文献报道了一种新的基因编辑系统，指定为hpsgn系统，一种对任意核酸实施靶向切割的组合物，包括两个主要组分：组分a：寡核苷酸探针：寡核苷酸探针由两部分组成，一部分与靶标底物互补，另一部分具有茎-环核酸二级结构；组分b：核酸内切酶分子：该核酸内切酶分子既可以识别组分a中的寡核苷酸探针的核酸二级结构从而与探针结合，还可以切割dna或者rna底物。这种系统具有无靶基因序列限制、体积小巧、反应效率高和特异性更好的优势。
11.当前，对肝纤维化疾病发展的潜在机制的研究已经相当成熟，纤维化的发展涉及多条信号通路，导致单药物、单靶点的抗纤维化治疗效果往往有限。因此联合用药治疗肝纤维化的策略被广泛研究，两种或两种以上具有不同作用机制或作用靶点的治疗方法联合使用有望显示协同抗纤维化作用。


技术实现要素：

12.本发明的目的在于提供一种用于治疗肝纤维化的药物递送载体组合物及其制备方法，所述药物载体组合物包括经自组装得到的复合纳米材料、靶向肝星状细胞的靶向肽、对目标核酸实施靶向切割的组合物(hpsgn系统)和治疗肝纤维化的化学药物，多通路相互配合、协同作用以达到共同提高肝纤维化的治疗效果的目的。
13.本发明的具体技术方案为：一种用于治疗肝纤维化的药物递送载体组合物，包括经自组装得到的复合纳米材料、靶向肝星状细胞的靶向肽、对目标核酸实施靶向切割的组合物以及治疗肝纤维化的化学药物，治疗肝纤维化的化学药物负载在复合纳米材料内部，靶向肝星状细胞的靶向肽以及对目标核酸实施靶向切割的组合物均连接在复合纳米材料的表面。
14.进一步地，所述经自组装得到的复合纳米材料为硅源与两亲聚合物自组装得到，粒径大小为1-200nm。
15.进一步地，所述靶向肝星状细胞的靶向肽为维生素a、环状rgd肽、甘露糖-6-磷酸(m6p)、pdgfβ-受体识别肽(ppb)、ctce9908中的一种。
16.作为优选，所述靶向肝星状细胞的靶向肽的受体包括视黄醇结合蛋白(retinol-binding protein，rbp)受体、ⅵ型胶原蛋白受体(collagen typeⅵreceptor，cvir)、甘露糖-6-磷酸/胰岛素样(mannose-6-phosphate/insulin like growth factorⅱ，m6p/igfⅱ)受体、血小板衍生生长因子受体(platelet derived growth factor receptors，
pdgfr)和趋化因子受体4(cxc chemokine receptor 4，cxcr4)中的一种。
17.进一步地，所述对目标核酸实施靶向切割的组合物包括核酸内切酶分子和寡核苷酸探针；
18.作为优选，核酸内切酶分子为afufen、pfufen、mjafen、mthfen、homosapiensfen中的任意一种的部分功能域或全酶片段；
19.作为优选，寡核苷酸探针由两部分组成：一部分与靶标核酸底物互补，另一部分具有茎-环核酸二级结构；茎-环核酸二级结构是指核酸分子中存在的反向重复序列，由于互补碱基间的氢键配对，长链区段可以回折形成的一种二级结构，如图2所示，寡核苷酸探针数量为1条或2条。
20.进一步地，所述治疗肝纤维化的化学药物为水飞蓟宾、甘草酸、胡黄连苷、黄芩素、姜黄素、阿魏酸钠、氧化苦参碱、槲皮黄酮、岑酮、汉防己甲素、丹参酮iiv、秋水仙素、罗格列酮、匹格列酮、尼洛替尼、金雀异黄酮、甲磺酸伊马替尼、达沙替尼、索拉非尼、维莫德吉、熊去氧胆酸类、奥贝胆酸、吡非尼酮、氯沙坦、多不饱和磷脂酰胆碱中的任意一种或至少两种的组合。
21.上述用于治疗肝纤维化的药物递送载体组合物的制备方法如下：首先利用硅源与两亲聚合物合成经自组装得到的复合纳米材料；接着通过点击反应将靶向肝星状细胞的靶向肽和复合纳米材料进行连接得到靶向肝星状细胞的复合纳米材料；再利用超声负载法将治疗肝纤维化的药物负载入复合纳米材料中；并通过点击反应将对目标核酸实施靶向切割的组合物与复合纳米材料连接，得到所述用于治疗肝纤维化的药物递送载体组合物。
22.进一步地，所述点击反应包括叠氮-炔的反应和/或巯基-双键的反应。
23.相比于现有技术，本发明具有如下优点：
24.1.本发明提供的药物递送载体组合物将化学药物与基因疗法联合以综合提高肝纤维化的治疗效果，复合纳米材料上连接的靶向肽能够特异性靶向肝脏中活化的肝星状细胞表面受体，进而在受损的肝脏中大量积聚，表现出更长的滞留时间，继而复合纳米材料表面连接的对目标核酸实施靶向切割的组合物中的探针与目标序列进行配对，相应的核酸内切酶精准剪切目标序列，与此同时，被精确递送到肝星状细胞并在纤维化肝脏富集的复合纳米材料的疏水核心内负载的化学药物缓慢释放，实现了载药高效进肝并能在肝脏内长效释放的效果；
25.2.本发明中用于切割靶标核酸底物的蛋白分子比cas9、cas12、cas13等cas蛋白家族的分子量小得多，有利于组合物制备和体内递送；
26.3.本发明涉及的被切割靶标核酸底物没有序列或者类型限制；
27.4.本发明公开的组合物中，连接在复合纳米材料表面的对目标核酸实施靶向切割的组合物在针对不同的目标核酸底物进行切割时，只需要更换对应的探针，不需要更换酶，就可以实现对不同核酸的切割，从而实现对不同疾病的治疗，具有较好的通用性；
28.5.本发明中公开的组合物在作用于人体时，当复合纳米材料被精确递送到肝星状细胞并在纤维化肝脏富集后，其疏水核心内负载的药物可以缓慢释放，延长药物的体循环时间，提高治疗效果，减少不良反应，实现了载药高效进肝并在肝脏内长效释放药物的过程，治疗效果更佳；
29.6.本发明中公开的组合物中复合纳米材料表面连接hpsgn系统，在复合纳米材料
表面同时修饰核酸内切酶fen1和hpdna探针，缩短了两者间的距离，将fen1和hpdna连接到复合纳米材料碰撞靶标底物的概率将大于fen1和hpdna两个独立扩散的分子同时碰撞靶标底物的概率，进而可有效提高基因编辑效率。
附图说明
30.图1为一种用于治疗肝纤维化的药物递送载体组合物的制备流程图；
31.图2为中a-d四张小图分别对应实施例1中制备的sclms、mal-sclm、ctsclms和fen1-hpdna-ctsclms的粒径图；
32.图3为实施例2得出的fen1-hpdna-sclms和游离fen1-hpdna的切割效率比较图谱；
33.图4为实施例3得出的fen1-hpdna-sclms和feni-hpdna-ctsclms在四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠中的生物分布结果图；
34.图5为实施例4中各治疗方法对ccl4诱导的肝纤维化小鼠中timp1 mrna表达水平的影响结果统计图；
35.图6为实施例5中各治疗方法对ccl4诱导的肝纤维化小鼠中alt、ast、hyp水平的影响结果统计图；
36.图7为实施例5中各治疗方法对ccl4诱导的肝纤维化小鼠的病理检测结果，包括肝脏he和masson染色结果。
具体实施方式
37.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
38.下列实施例中所说的室温是指25-28℃；所用原料及试剂均为市售品。
39.所有统计学分析采用spss 22.0进行两独立样本t检验。
40.实施例1
41.《相关复合纳米材料的合成》
42.氧化硅与两亲聚合物自组装得到的复合纳米材料(sclms)的合成
43.取(后简写为f108,f108是环氧乙烷-环氧丙烷-环氧乙烷peo-ppo-peo的三嵌段共聚物,peo亲水,ppo疏水,mw,14.6kda,0.25g)在室温下溶解于hcl(7.5ml,2.0m)溶液中，搅拌15min，使其充分溶解。加入240μl环己烷，超声2min，使其充分混合直至溶液呈现乳白色，继续在室温下搅拌0.5h，使其充分溶解。加入268μl硅酸四乙酯，于室温下搅拌4h，加入40μl二甲基二乙氧基硅烷dedms。反应24h后，收集溶液并使用分子量为20000d的透析膜在去离子水中透析过夜以去除杂质。
44.将所得复合纳米材料置于旋转蒸发仪中于50℃、150mbar条件下悬转蒸发30min除去环己烷。旋蒸结束后，以5000rpm/min的速度离心10min，取上清获得sclms，组装完成后，ppo成为疏水核心。
45.mal-f108-mal的合成
46.将四氢呋喃thf(20ml)，三苯基膦pph3(392mg)，n-羟基马来酰亚胺(112.5mg)和f108(mw,14.6kda,7.4g)依次添加到100ml烧瓶中并冷却至0℃。将偶氮二甲酸二异丙酯
diad(73.6μl)溶解在thf(2ml)中，再将其滴加到烧瓶中，并在0℃下继续反应30min。随后，将该混合物加热至室温并搅拌过夜。之后，通过减压蒸发除去溶剂，并将沉淀物重新悬浮在正己烷和乙酸乙酯的混合溶液中(正己烷：乙酸乙酯，50:50)。过滤粗产物，并用正己烷和乙酸乙酯的混合液(正己烷：乙酸乙酯，50:50)洗涤3次，最后干燥，得到产物mal-f108-mal。
47.连接ctce9908肽的sclms(ctsclms)的合成
48.将f108(0.215g)和mal-f108-mal(0.035g)在hcl(7.5ml,2m)溶液中混合，室温下搅拌15min，接下来的步骤与上述制备sclms的合成方法相同，将所合成的纳米材料用mal-sclms(即负载有马来酰亚胺的复合材料，便于后续与靶向肽中的巯基或对目标核酸实施靶向切割的组合物中的巯基通过点击反应进行连接)表示。随后将ctce9908(1.8mg)加入到mal-sclms中，室温搅拌2h后，收集溶液并在与上述相同的透析条件下透析过夜。透析结束后，收集袋中的溶液在5000rpm的转速下离心10min，取上清获得ctsclms。
49.ctce9908肽的序列：lys-gly-val-ser-leu-ser-tyr-arg-cys-arg-tyr-ser-leu-ser-val-gly-lys
50.连接hpsgn(fen1 hpdna)的复合纳米材料的合成
51.将fen1(一种核酸内切酶，核苷酸序列如seq id no.1所示，编码的氨基酸序列如seq id no.2所示)溶解在非胺缓冲溶液(ph＝8.0)中，在缓冲溶液中加入0.1-5mm乙二胺四乙酸edta，螯合溶液中的二价金属，防止巯基氧化。根据fen1的大小和浓度以及所需的硫醇化水平，向溶液中加入2-20倍摩尔过量的2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐，室温下敷育1小时，得到fen1-sh。
52.在hpdna探针的5’端修饰巯基，得到hpdna-sh。
53.将fen1-sh(400pmol)，hpdna-sh(3600pmol)加入sclms(0.78mg)中，室温下反应2h，得到溶液即为fen1-hpdna-sclms。连接hpsgn系统(fen1 hpdna)的ctsclms的方法和上述一致，表示为fen1-hpdna-ctsclms。连接对照序列nthpdna(即具有茎-环二级结构序列而没有与靶标核酸底物互补功能序列的阴性对照组)的方法和上述一致，表示为fen1-nthpdna-ctsclms。
54.采用动态光散射仪(dls)对本实施例中制备的sclms，mal-sclms，ctsclms，fen1-hpdna-ctsclms进行表征。由图2中a-d四张小图可知，sclms，mal-sclms，ctsclms，fen1-hpdna-ctsclms的粒径均在80nm左右，分布较为均匀，表明马来酰亚胺的引入，ctce9908和hpsgn系统(fen1 hpdna)的修饰没有引起粒径的显著变化。
55.实施例2
56.《连接在sclms上的hpsgn(fen1 hpdna)的切割效率高于游离的hpsgn(fen1 hpdna)》
57.按实施例1中方法合成fen1-hpdna-sclms，用荧光cy2标记目标底物s2的5端，底物匹配具有茎-环结构的hpdna探针hp-2-sh。
58.跑胶探针的全序列如下(接巯基5'-3'，其中打下划线的该部分序列固定不变)
59.hp-2-sh:
60.aaaaaaaaaaccgaagggcatgagctgctagagtcggccttttggccgactctc；
61.跑胶底物(5'-3')
62.s2:
63.cy2-cgugcagcucaucaugcagcagcucaugcccuucgg
64.由hpdna，单链rna(ssrna)底物(10pmol)，3-(n-吗啡啉)丙磺酸mops(10mm)，0.05％吐温20tween-20，0.01％乙基苯基聚乙二醇nonidet p-40，mgcl2(7.5mm)和适量fen1配成10μl反应混合物，37℃反应2小时。底物ssrna 5’端用荧光fam标记。在变性条件下，用聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)对上述反应得到的产物进行分析。上样缓冲液含有90％甲酰胺、0.5％edta、0.1％二甲苯氰和0.1％溴苯酚蓝。在上样前，在10μl反应混合物中加入10μl上样缓冲液，将20μl样品在沸水中反应5分钟，然后放在冰上冷却。然后在室温下将样品加载到20％的page凝胶上，并在含尿素(8.7m)和三硼酸盐(89mm)的缓冲液中进行电泳。电泳速度为9.6v/cm，持续2小时。使用amersham imager 600(ge healthcare)对凝胶进行成像。fen1-hpdna-sclms的跑胶方法与上述游离fen1-hpdna的方法一致。如图3所示，在相同稀释比例下，对切割后剩余rna底物进行统计，结果从图3中c小图可知，fen1-hpdna-sclms切割效率显著高于游离fen1-hpdna。
65.实施例3
66.《fen1-hpdna-sclms和feni-hpdna-ctsclms在四氯化碳(ccl4)诱导的肝纤维化小鼠中的生物分布》
67.修饰cy5.5的fen1-hpdna-sclms和fen1-hpdna-ctsclms的合成：
68.cy5.5是一种近红外荧光染料，其最大激发光和发射光分别为675nm和694nm。称取cy5.5(2mg)溶于1ml无水二甲基甲酰胺(dmf)，于-20℃避光保存。将2μl氨丙基三乙氧基硅烷(apes)加入18μl dmf中，混合均匀，取上述混合溶液2μl加入50μl cy5.5(2mg
·
ml-1)溶液中，在室温避光条件下反应24h。在避光条件下，将100μl三乙醇胺溶液(三乙醇胺：去离子水质量比1:1)加入5ml fen1-hpdna-sclms(20mg
·
ml-1)溶液中，随后加入预处理后的cy5.5溶液，在室温下避光搅拌24h。反应结束后，取出溶液转移至分子量为20000d的透析袋中，并置于去离子水中避光透析过夜，收集袋内溶液即得到负载cy5.5的fen1-hpdna-sclms。
69.负载cy5.5的fen1-hpdna-ctsclms的获取方法和上述一致。
70.取6-8周龄的icr小鼠腹腔注射10％ccl
4-玉米油溶液(10ml
·
kg-1
)，每周两次，持续4周，建立小鼠纤维化模型。在造模结束后，模型组小鼠被随机分成两组，分别尾静脉注射cy5.5标记的fen1-hpdna-sclms和feni-hpdna-ctsclms(4mg
·
ml-1,0.2ml)。2h、12h、24h、48h、96h后，处死小鼠，收集每组小鼠的心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏组织，利用小动物活体成像系统采集图像。
71.如图4所示，从器官分布来看，通过尾静脉注射的cy5.5标记的fen1-hpdna-sclms和feni-hpdna-ctsclms都主要分布在肝脏，且fen1-hpdna-ctsclms在肝脏的荧光强度显著高于fen1-hpdna-sclms。该结果表明fen1-hpdna-ctsclms在受损的肝脏中有着明显的靶向作用。在注射96h后，仍可以检测到cy5.5标记的fen1-hpdna-ctsclms的荧光，说明其经静脉注射后体内循环时间长。上述结果提示，fen1-hpdna-ctsclms作为药物递送系统能够在受损的肝脏中大量积聚并表现出更长的滞留时间。
72.实施例4
73.《ctsclms联合hpsgn系统(fen1 hpdna)在ccl4诱导的肝纤维化小鼠中能显著降低timp1的mrna表达》
74.取6-8周龄的icr小鼠腹腔注射10％ccl
4-玉米油溶液(10ml
·
kg-1
)，每周两次，持续4周，建立小鼠纤维化模型。造模第三周开始通过尾静脉注射各组治疗药物，每次ccl4注射后第二天进行尾静脉药物注射free fen1-hpdna、fen1-nthpdna-ctsclms、fen1-hpdna-ctsclms，持续给药两周。治疗结束后，取上述肝组织加入trizol裂解，按照说明书使用rna提取试剂盒提取细胞中的总rna并定量。rna提取后，使用逆转录试剂盒对rna cdna进行反转录，并严格遵守试剂盒说明，以β-actin为对照，使用2-δδct方法定量分析timp1基因表达水平。
75.剪切timp的hpdna:
[0076]5’‑
aaaaaaaaaaggcccgtgatgagaaactcttagagtcggccttttggccgactctc-3
′
[0077]
nthpdna:
[0078]5’‑
aaaaaaaaaaacgtgacacgttcggagaaagagtcggccttttggccgactctc-3
′
[0079]
qpcr序列
[0080]
mtimp1
[0081]5’‑
gcaactcggacctggtcataa-3’[0082]5’‑
cggcccgtgatgagaaact-3’[0083]
mβ-actin：
[0084]5’‑
ggctgtattcccctccatcg-3’[0085]5’‑
ccagttggtaacaatgccatgt-3’[0086]
结果如图5所示，与健康小鼠相比，ccl4诱导的肝纤维化小鼠timp1 mrna水平显著升高。经各组治疗后，free fen1-hpdna、fen1-nthpdna-ctsclms组timp1 mrna水平与模型组相比无明显变化，fen1-hpdna-ctsclms组相比模型组显著降低。表明ctsclms是递送治疗系统的良好载体，hpsgn系统发挥作用需要相应hpdna与目标序列进行配对，fen1-hpdna-ctsclms能有效剪切timp1 mrna，有效治疗肝纤维化。
[0087]
实施例5
[0088]
《化学药物罗格列酮(rgz)、hpsgn系统(fen1 hpdna)以及两者联合在ccl4诱导的肝纤维化小鼠中的治疗作用》
[0089]
负载rgz的纳米载药系统的制备
[0090]
称取rgz 5mg溶于二甲基亚砜dmso(50μl)中。然后取10μl在剧烈超声处理下加入到1ml的ctsclms(20mg
·
ml-1
)的ppo疏水核心中。将负载rgz的ctsclms表示为rgz@ctsclms。负载rgz的fen1-hpdna-ctsclms方法和上述一致，获得的目标产物表示为rgz@fen1-hpdna-ctsclms。
[0091]
取6-8周龄的icr小鼠腹腔注射10％ccl
4-玉米油溶液(10ml
·
kg-1
)，每周两次，持续4周，建立小鼠纤维化模型。动物实验分为八组，分别为control、ccl4、free rgz、free fen1-hpdna、fen1-nthpdna-ctsclms、rgz@ctsclms、fen1-hpdna-ctsclms、rgz@fen1-hpdna-ctsclms。造模第三周开始通过尾静脉注射各组治疗药物，每次ccl4注射后第二天进行尾静脉药物注射，持续给药两周，观察小鼠状态变化并记录体重。治疗结束后眼球取血法收集小鼠血液，静置后以3000rpm/min的速度离心10min，取上清即得血清。根据各试剂盒的实验操作方法检测血清中谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)含量；取肝脏，用试剂盒检测羟脯氨酸(hyp)含量，评价各组治疗效果。取部分肝脏至于多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切
片进行he染色和masson染色。
[0092]
血清中的alt和ast是评估肝功能损害的关键指标。羟脯氨酸是胶原蛋白的主要成分之一，因此可以通过测定羟脯氨酸的含量来评估肝组织中胶原蛋白的情况。
[0093]
如图6所示，与健康小鼠相比，经ccl4造模后小鼠alt、ast、hyp水平均明显升高。与注射free rgz相比，注射rgz@ctsclms后，alt、ast、hyp的水平和含量明显降低，提示ctsclms的靶向递药功能能够显著增强药物的治疗作用。fen1-hpdna-ctsclms组的治疗效果也显著强于free fen1-hpdna和fen1-nthpdna-ctsclms组。当连续给予rgz@fen1-hpdna-ctsclms联合治疗后，与单独给予rgz@ctsclms或单独给与fen1-hpdna-ctsclms相比，alt、ast、hyp的水平和含量明显降低，表明两者联合治疗能够增强对肝纤维化的治疗效果。
[0094]
如图7所示，he染色显示模型组小鼠肝组织结构紊乱，炎症细胞浸润明显，大量细胞呈脂肪变性；和其他治疗组相比，rgz@fen1-hpdna-ctsclms组的治疗效果最佳，肝纤维化程度明显减轻。masson染色结果可以看出，相较于对照组小鼠，模型组小鼠肝组织内可见到大量的蓝色胶原沉积，提示在ccl4造模后，肝组织内分泌过量的胶原蛋白并在肝损伤处沉积。与模型组小鼠相比，rgz@ctsclms、fen1-hpdna-ctsclms、rgz@fen1-hpdna-ctsclms组小鼠肝组织胶原沉积情况均有所改善，表现在蓝色胶原面积均有不同程度的降低。其中，rgz@fen1-hpdna-ctsclms组的胶原减轻程度最为显著，该结果表明化学药物和hpsgn系统两者联合治疗能够增强对肝纤维化的治疗效果。
[0095]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。