标记物和/或载体与靶分子例如带his-标签的蛋白质通过金属配合物试剂的位点特异性动力学惰性缀合
技术领域：
：1.本发明涉及用于将靶分子如蛋白质缀合/连接至标记物和/或载体的手段和方法。具体地，本发明提供了配合物(complex)，其包含与(i)金属阳离子配体co32-或hco3-和(ii)包含螯合配体和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域配位的金属阳离子。该配合物可用于将标记物和/或载体连接至靶分子，优选蛋白质。通过本发明配合物连接标记物或载体涉及，用靶分子的配位基团置换金属阳离子配体，由此形成在金属阳离子的配位层中以靶分子作为主要配体的产物配合物。因此，本发明还提供了包括将标记物和/或载体连接至靶分子的用途和方法。还提供了通过本发明的标记和/或载体连接方法获得的产品及其用途。本发明还涉及生产本发明配合物的方法和包含用于生产本发明配合物的组分的试剂盒。
背景技术：
：：2.近年来，化学修饰的蛋白质成为许多生物学应用中非常重要的工具。生命科学研究中的多种生化和细胞技术，例如基于荧光的测定、蛋白质印迹和蛋白质纯化，都依赖于标记的或固定化的蛋白质。而且对于生物制药(例如抗体-药物偶联物、聚乙二醇化和脂化)、医学诊断，包括生物传感器、生物成像和甚至医学工程的发展而言，蛋白质的缀合是关键的生产步骤。因此，在所有应用领域中，都需要一种简单、稳定、位点特异性、且不妨碍蛋白质功能的修饰方法。此外，其他生物分子如核酸也经常被标记或连接到载体上。3.在经典的标记/固定程序中，小分子通过例如n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)衍生试剂或马来酰亚胺，以快速有效的方式，共价连接到未修饰的目标蛋白质中的反应基团(例如赖氨酸中的伯胺或半胱氨酸中的硫醇)上(chenandwu,2016)。然而，由于蛋白质中这些反应位点的遍在可得性，所有这些方法都具有内在的缺点。因此，对这些标记反应的控制是有限的，导致巨大的批次间差异，缺乏位点特异性、不均一的固定/标记化学计量，甚至是蛋白质功能的失稳定和丢失(lindhoud等，2012)。为了解决这个问题，近年来开发了几种位点特异性蛋白质缀合的新技术。4.最突出的是avi标签系统，其中生物素部分通过生物素连接酶bira的酶催化作用定点地连接到短肽标签上(tirat等，2006)。此外，在其他方法中，诸如分选酶(popp等，2007)、转谷氨酰胺酶(lin和ting，2006)、硫辛酸连接酶(fernandez-suarez，m.等，2007)和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phospho-pantheinyl-transferases)(yinetal.,2005)等酶，也用于催化蛋白质通过短识别肽标签的定向缀合。5.另一种方法是，借助非天然氨基酸，通过核糖体并入生物正交官能团(例如tetratines、炔烃、叠氮化物或降冰片烯)，来扩展遗传密码(ou等人，2011年；deiters等人，2003年；lang等人，2012年)。使用特定的连接化学，可以非常精确地在并入的基团上修饰靶蛋白质。6.作为非天然氨基酸的替代，在蛋白质表面具有独特反应性和低丰度的常规氨基酸可用于位点特异性标记。在这种情况下，大多数方法都使用工程化的半胱氨酸取代，这些取al.,2007)。12.使用涉及氧化步骤的该间接多步骤制备方法产生的基于co3 的his标签蛋白配合物，也已经被用于将蛋白质固定在表面上(wegner等人，2016年；dirusso等人，2018年)。然而，在表面固定的情况下，该方法会使用强氧化剂h2o2，这可能会对蛋白质功能产生负面影响，也可能会干扰某些表面结构。13.与上述文献类似，ep0497585a2也仅是在[co(ii)(ida)(his-蛋白质)]配合物形成后将co2 氧化成co3 。该[co(ii)(ida)(his-蛋白)]配合物与o2气体接触数小时以促进co2 氧化为co3 。然而，本领域已知，不稳定蛋白质可能因暴露于高浓度氧气数小时而受到损害。此外，本发明人无法重现所述方法，即，在[co(ii)(nta)(his-蛋白)]配合物与o2气体接触后，没有观察到稳定的配合物。[0014]zatloukalová和kucerová提出了一种形成[co(iii)(ida)(his-tag)(h2o)]配合物的方法，其中可以避开在蛋白质存在时进行氧化(zatloukalová和kucerová，2006)。在此过程中，co2 中心在与ida的预配合物中被过氧化氢氧化为co3 ，随后生成的[co(iii)(ida)(h2o)3] 与带有his标签的蛋白质配位形成最终的[co(iii)(ida)(his-tag)(h2o)]配合物(参见图2b的反应示意图；zatloukalová和kucerová，2006)。然而，该方法仍然具有主要缺点。与具有水配体的基于co2 的预配合物相比，具有水配体的基于co3 的预配合物配位明显更慢，并且如本发明人在所附实施例中所证明的，最终的配合物形成效率也低，尤其是在大多数蛋白质所需的低温下时。此外，在存在ida-缀合物的情况下使用过氧化氢仍会由于氧化作用而对缀合物(即连接到ida缀合物上的标记物和/或载体)的功能产生负面影响。例如，荧光团的荧光会因氧化而降低。此外，该方案需要从过氧化氢中纯化经氧化的预配合物，以用于进一步的下游应用。这些纯化过程既费时又费物，并且存在残留氧化剂的风险，这些残留氧化剂可能会氧化和破坏在下游应用中待修饰的蛋白质。[0015]因此，本发明的技术问题是提供改进的手段和方法，允许以简单有效并防止干扰标记物/载体和靶分子的功能和/或稳定性的方式，通过配合物形成，将标记物和/或载体连接到靶分子，例如蛋白质。[0016]该技术问题通过提供权利要求中表征的并且如下文提供的实施方案得以解决。[0017]发明概述[0018]在第一方面，本发明提供配合物形式的化合物，其包含：[0019]a)金属阳离子；[0020]b)金属阳离子配体，其为选自co32-和hco3-的碳酸根；和[0021]c)包含螯合配体和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0022]本发明人惊奇地发现，本发明的配合物是用于将标记物和/或载体连接到靶分子例如带his标签的蛋白质的有利工具。标记通过在配合物的主要配位层(primarycoordinationsphere)中使配合物的金属阳离子配体与靶分子交换而实现。通过这种交换，形成新配合物，所述新配合物具有(包含螯合配体和标记物和/或载体的)金属阳离子螯合域作为第一配体以及靶分子作为第二配体。如使用包含过渡金属阳离子co3 或pt4 的本发明配合物的所附实施例中举例说明的，本发明的配合物允许以动力学惰性方式将标记物和/或载体连接至靶分子。因为组氨酸残基是可以参与金属配合物形成的配体，尤其是与过渡金属如co3 形成配合物，因此，优选的靶分子是带有his标签的蛋白质或具有富含组氨酸区域的蛋白质。组氨酸标签可作为双齿和/或多齿配体发挥作用。[0023]本发明配合物的一个优点是，使用h2o2的氧化反应对于其中存在标记物和/或载体的配合物的生产步骤来说不是必需的，对于将标记物和/或载体连接到靶分子也不是必需的。避免氧化步骤如h2o2处理具有优点，即，可以实现标记物和/或载体的连接而不会因氧化作用而干扰靶分子、标记物和/或载体的功能。这使得由该金属配合物介导的标记和/或载体连接具有更广泛的适用性，尤其是适用于对氧化敏感的靶分子，如蛋白质。此外，它还消除了采用繁琐和耗时的洗涤步骤来去除氧化剂的必要性。[0024]对于具有低的配体交换速率的co(iii)或其他过渡金属配合物，没有任何中间步骤的直接配合物形成极其缓慢且效率低下。因此，目前用于形成这些动力学惰性配合物的现有技术方法集中在两步骤方法上。首先形成具有处于动力学不稳定的氧化状态的金属中心(例如co(ii))的配合物，然后是通常使用过氧化氢的氧化过程。这种氧化过程可导致蛋白质、金属结合域和/或载体的不可预见的功能破坏。[0025]为了克服这些局限性，本发明描述了一种直接形成动力学惰性的配合物的方法。直接以处于所需氧化状态的金属开始，可以避免在蛋白质、金属结合域或蛋白质存在下使用氧化试剂。选择的金属被引入金属结合域，与三个金属阳离子配体(碳酸根或硝酸根)预配位。第一步，两个金属阳离子配体被金属阳离子螯合域替换，之后，最后一个金属阳离子配体通过蛋白质的配位而被替换。金属与碳酸根或硝酸根的预配位可以促进最终配合物的形成，导致配合物形成速度显著更快，且配合物形成效率更高。该改进的直接配合物形成方法，使用具有配位的碳酸根或硝酸根配体的预配合物进行，这源于这些金属阳离子配体在从预配合物释放后质子化的能力。在碳酸根的情况下，配体释放后的质子化会导致气体形成，这可进一步增强该形成过程。因此，如本发明人所证明的，与使用其他配体(包括水)相比，使用碳酸根或硝酸根预配合物，可以显著更快和更有效地直接形成动力学惰性的金属配合物。如所附实施例中所示，本发明的手段和方法尤其涉及，包含和/或由金属阳离子、碳酸根(作为金属阳离子配体；co32-或hco3-)和金属阳离子螯合域组成的新型富有创造性的配合物，其中金属螯合域包含螯合配体以及标记物和/或载体。从本文的公开内容以及从所附实施例中显而易见的是，也可以使用采用“硝酸根”替代“碳酸根”(co32-或hco3-)的相应配合物。因此，本发明也可以基于相应的“硝酸根配合物”。因此，本文描述的是相应的“碳酸根配合物”以及“硝酸根配合物”。在本发明的上下文中，碳酸根和硝酸根可以被认为是等同物，因为这两种金属阳离子配体在从相应的预配合物释放后都可以被质子化。在本发明的上下文中，碳酸根配合物对于本文提供的手段和方法是优选方案。进一步的细节在下文中提供。[0026]在上述wegner和spatz(loc.cit)以及zatloukalová和kucerová(loc.cit)的现有技术中，描述了通过形成co3 介导的配合物来标记蛋白质的方法。然而，与本发明相反，这些方法都涉及使用h2o2的氧化步骤(见图2a和b)。该氧化步骤是有害的处理，会对标记物(例如荧光团)和/或载体和待标记蛋白质的稳定性和功能产生负面影响(参见所附实施例)。本发明的配合物允许规避这些现有技术方案中的氧化步骤。此外，本发明的配合物可以快速有效地配位金属结合性靶分子，优选带有his标签的蛋白质或具有富组氨酸区域的蛋白质，从而使标记物和/或载体可以通过金属阳离子介导的相互作用而连接到靶分子上。在终产物中标记物和/或载体以类似于wegner和spatz以及zatloukalová和kucerová所述的动力学惰性方式连接到靶分子上。靶分子的结合是通过金属阳离子配位配体与靶分子交换以形成新的配合物(在此称为“产物配合物”)来实现的。通过将金属配位配体选择为选自co32-和hco3-的碳酸根或硝酸根，本发明人发现，可以非常有效和快速地形成“产物配合物”，其中所述产物配合物包含含标记物/载体的金属阳离子螯合域以及与金属阳离子配位的靶分子。尤其是，本发明人发现，与采用水作为金属阳离子配体的配合物(如zatloukalová和kucerová的方法中所述)相比，尤其是在低温下，靶分子的结合更完全和更快。因此，本发明的配合物可以更快且更完全地将标记物和/或载体连接至靶分子(例如，带his-标签的蛋白质)。总之，本发明配合物的一个主要优点是，该配合物允许快速有效的连接，同时不需要在存在标记物和/或载体的情况下使用氧化剂。[0027]本发明的配合物或包含其的组合物在许多应用中特别有用，包括但不限于，用荧光团、毒素、诊断部分、靶向部分、稳定结构域和/或反应基团标记蛋白质。使用本发明配合物，特别是还可以制造生物药物，例如毒素标记的抗体和诊断剂。该标记在动力学上是惰性的(即配体交换速率为10-1s-1或更低)，因此可以防止配体交换，这样的配体交换是基于ni2 或co2 的配合物的常见问题。此外，与基于ni2 或co2 的配合物相比，该标记在热力学上更稳定。[0028]本发明的配合物还可用于实现靶分子，优选蛋白质，与载体的稳定连接。例如，载体可以是表面、珠子、纳米颗粒、辅基(prosthetic)、量子点、聚合物、水凝胶、微粒、球体(例如纳米球体和/或微球体)或其组合。例如，实施例19证明，带his标签的gfp可以连接到金纳米结构的玻璃表面。首先，金纳米结构的玻璃表面通过偶联nta-接头-硫醇试剂，借助于金颗粒与该硫醇基团的相互作用，从而被nta官能化。随后，在表面上产生本发明的配合物并连接his-gfp(图21)。此外，在非限制性实施例20中显示，带his标签的gfp可与通过接头偶联本发明配合物的生物素基团连接。包含生物素基团、接头、本发明的配合物和带his标签的gfp的产物，随后与包含链霉亲和素基团的珠子偶联(图22)。[0029]所附实施例表明，使用本发明的配合物可以将广泛多种(带his标签的)蛋白质偶联到珠子上。对于一种测试的蛋白质(分选酶a)，已经证明，酶活性在固定化后被保留(实施例14，图16c)。还证明，抗体可以使用抗体fc区的富含组氨酸区域，通过本发明的配合物，偶联到珠子上。如图16d所证实，固定化的抗体可以保留结合其抗原的能力。[0030]本发明的配合物可以实现快速有效的金属阳离子介导的靶分子标记或载体与靶分子的连接，而无需如wegner和spatz以及zatloukalová和kucerová描述的在待标记的靶分子和/或所述标记物和/或载体存在下进行氧化步骤，这使其特别适用于上述应用，在这些应用中，避免靶蛋白和/或标记物和/或载体的氧化通常是至关重要的。[0031]本发明的配合物可以在溶液中提供或以固体形式提供。本发明的配合物可以带有电荷，尤其是当在溶液中提供时。电荷将取决于金属阳离子、金属阳离子配体和金属阳离子螯合域的电荷。例如，如果配合物包含co3 作为金属阳离子、co32-作为金属阳离子配体、以及由螯合配体nta和不带电荷的标记物组成的金属阳离子螯合域，则该配合物具有电荷“2‑”(即二价负电荷)。也可以提供具有抗衡离子的配合物。当配合物进一步包含一个或多个抗衡离子时，配合物也可以作为固体提供。所述(一个或多个)抗衡离子优选为一价离子。特别优选的是来自碱金属的一价离子。当配合物带负电荷时，最优选na 和k 作为抗衡离子。[0032]本发明配合物的金属阳离子螯合域(其可替代地称为第一配体或螯合剂)包含螯合配体。所述螯合配体通过提供至少两个可以与配合物的金属阳离子配位的结合位点(即，1984)。[0036]因此，c)的金属阳离子螯合域中包含的螯合配体可以例如选自以下非限制性列表：次氮基三乙酸(nta)、亚氨基二乙酸(ida)、三(羧甲基)乙二胺(ted)、螯合肽，例如具有共有氨基酸序列(ghhph)ng的肽，其中g是甘氨酸，h是组氨酸，p是脯氨酸，n是1至3的整数；也参见seqidno：1至3)或cadystin、三氮杂环壬烷(tacn)、二亚乙基三胺-五乙酸(dtpa)、植物螯合素(phytochelatin)、羧甲基天冬氨酸(cma)、膦酸盐、单宁酸(ta)、卟啉、联吡啶胺(dpa)、植酸，次氮基丙酸二乙酸(npda),次氮基异丙酸二乙酸(nipda),n-(羟乙基)乙二胺三乙酸(hedta),1,4,7,10-四氮杂环十二烷-n,n',n",n"'-四乙酸(dota),1,4,7-三(羧甲基)-10-(2'-羟丙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷,1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(nota),1-(1,3-羧基-丙基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-4,7-二乙酸(nodaga),1,4,8,11-四氮杂环十四烷-n,n',n",n"'-四乙酸(teta)、乙二半胱氨酸、乙二胺四乙酸(edta)、1,2-二氨基环己烷-n,n,n',n'-四乙酸(dact)、双(氨基乙硫醇)羧酸、亚乙基双(氧亚乙基-次氮基)四乙酸(egta)、三亚乙基四胺-六乙酸(ttha)、1,4,7-三氮杂环壬烷次膦酸(trap)、脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)、嘌呤、嘧啶及其衍生物。[0037]所有这些螯合配体的共同点是，它们提供至少两个配位位点，可以充当路易斯碱供体，从而与金属阳离子形成配位螯合物(即螯合剂)。因此，在一个实施方案中，螯合配体可具有至少2、3、4、5或更多个可与金属阳离子配位的化学基团，即它们可充当路易斯碱。[0038]在一个优选的实施方案中，c)的金属阳离子螯合域的螯合配体选自：次氮基三乙酸(nta)、亚氨基二乙酸(ida)、具有共有序列(ghhph)ng的螯合肽，其中n为1至3；也参见seqidno：1至3)、二亚乙基三胺-五乙酸(dtpa)、次氮基丙酸二乙酸(npda)、次氮基异丙酸二乙酸(nipda)、乙二胺四乙酸(edta)、亚乙基双(氧亚乙基-次氮基)四乙酸(egta)、羧甲基天冬氨酸(cma)及其衍生物。[0039]在另一优选的实施方案中，螯合配体可以是氨基多羧酸。优选地，氨基多羧酸选自乙二胺-四乙酸(edta)、次氮基三乙酸(nta)、亚氨基二乙酸(ida)、亚乙基双(氧亚乙基-次氮基)四乙酸(egta)、二亚乙基三胺-五乙酸(dtpa)、和三亚乙基四胺-六乙酸(ttha)、三(羧甲基)乙二胺(ted)、三氮杂环壬烷(tacn)或其衍生物。[0040]在一个特别优选的实施方案中，c)的金属阳离子螯合域的螯合配体包含或选自nta、ida、talon及其衍生物。最优选nta和ida作为螯合配体，特别最优选ida。nta是四齿配体，因此与金属阳离子的结合特别强。ida是三齿的，也能强烈地结合金属阳离子，但比nta弱。与金属阳离子的强结合防止金属阳离子的释放，所述释放将导致配合物的不希望的解体或标记物和/或载体从靶分子的释放。在某些实施方案中，ida是优选的，因为具有高稳定性百分比的配合物可以比具有nta的配合物更快地形成。推测对于三齿金属结合域，蛋白质的配位得到进一步促进，因为第二金属阳离子配体可仍然保持与金属的半配位，而在使用四齿金属结合域时它被完全置换掉。由于部分配位，该配体可以容易地被蛋白质的一个组氨酸残基置换。而随着此刻的靠近，一个或两个另外的组氨酸残基也可以释放出最后的配体并形成稳定的配合物。[0041]在螯合配体的上下文中，术语“衍生物”是指具有相同先导结构但可以被其他化学反应性基团取代的化合物。优选地，本文中的术语“衍生物”包括被一个或多个选自羧基、胺、叠氮化物、丙烯酸酯、马来酰亚胺、羟基、硫醇、芳族、脂族、二硫酸酯和乙烯基砜基团的 ,la3 ,eu3 ,os2 ,pd4 ,mo3 ,fe3 ,ru2 ,gd3 ,tc3 ,re3 ,sm3 ,tb3 ,ce3 ,pr3 ,nd3 ,pm3 ,dy3 ,ho3 ,er3 ,tm3 ,yb3 ,lu3 ,v2 ,mn4 和fe2 。本领域技术人员知晓，这些金属阳离子具有非常低的水配体交换速率的特征。本发明人发现，特别是这种具有低水配体交换速率的金属阳离子是有用的金属阳离子，可用于在通过温育本发明配合物与靶分子形成的产物配合物中介导含有标记物和/或载体的金属阳离子螯合域与靶分子之间的相互作用。这是因为这些金属有利于热力学稳定且动力学惰性的产物配合物中非常稳定的相互作用。[0051]在一个优选的实施方案中，金属阳离子选自：co3 ,pt4 ,cr3 ,rh3 ,ir3 ,ir4 ,pt2 ,pd4 ,mo3 ,fe3 ,gd3 ,tb3 ,eu3 ,ru2 ,la3 ,ru3 ,re3 ,re4 ,os2 ,v2 ,mn4 ,fe2 。这些金属阳离子已在文献中描述，具有10-1s-1或更低的水配体交换速率和/或为动力学惰性金属阳离子：co3 (lippard和berg1994),cr3 (helm和merbach2002；helm和merbach,1999),rh3 (aebischeretal.1993；helm和merbach,1999),ir3 (cusanellietal.1996；helm和merbach,1999),ir4 (saitoetal.1990),pt2 (helmetal.1984；helm和merbach,1999),pt4 (giandomenicoetal.1995),pd4 (saitoetal.1990),mo3 (saitoetal.1990),fe3 (harringtonetal.2018),gd3 (caravanetal.2001),tb3 (junkeretal.2018),eu3 (morrow和chin1993),ru2 (hugi-clearyetal.1987；helm和merbach,1999),la3 (morrow和chin1993),ru3 (hugi-clearyetal.1987；helm和merbach,1999),re3 (house和house,2015),re4 (saitoetal.1990)和os2 (livingstone,1973),v2 (house和house,2015),mn4 (house和house,2015),fe2 (house和house,2015)。因此，这是合理的，这些金属阳离子可以与靶分子形成类似稳定的产物配合物，从而使标记物和/或载体稳定地连接到靶分子上。[0052]在本发明的上下文中，“动力学惰性金属阳离子”是指具有10-1s-1或更低的水配体交换速率的金属阳离子。这个定义和截断值也符合文献中对这种表述的普遍理解(taube，1952；lutheriii，2016)。用于测量水交换速率的优选方法在本文别处提及。[0053]当在金属配合物中配体(例如“产物配合物”中的靶分子)结合的上下文中使用时，“动力学惰性”，如本文所用，优选是指水溶液中的配体交换速率为10-1s-1或更低，甚至更优选10-2s-1或更低。测量配体交换速率的方法是本领域已知的。例如，可以比照使用如本文别处描述的用于测量水交换速率的方法。根据本发明，用于确定配体交换速率和/或评估在“产物配合物”中靶分子结合的动力学惰性的测定试验，可以包括测量与竞争性配体(例如咪唑或edta)和/或与还原剂(例如dtt)的竞争，如所附实施例和附图(参见例如图1、6和7b)中所述。用于评估靶分子与配合物(即“产物配合物)结合的“动力学惰性”的优选测定试验，可以通过如实施例5中示例性描述的方法来评估。具体地，以nta连接到琼脂糖珠的[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物可以如本文和所附实施例和附图中所述产生。随后，该珠子结合的[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物可以与靶分子一起温育，以形成固定在琼脂糖珠上的[co(iii)(nta)(靶蛋白)]“产物配合物”。随后，[co(iii)(nta)(靶蛋白)]配合物的化学稳定性，可以通过用pbs(＝对照)或咪唑溶液(补充250mm咪唑的pbs)(＝样品)洗涤等量的产生的琼脂糖珠来评估。可选地，可以采用基于ni2 -nta的常规基质作为比较。然后可以针对所有样品评估结合的靶分子的量(可选地在洗涤之前和之后)。确定靶分子存在(即读出)的方法取决于靶分子的特性并且是本领域已知的。例如，该测定可涉及荧光测量(例如，当靶分子具有荧光时)。对于非荧光靶分子，检测靶分子的荧光抗体可用于读出。读出的另一个例子是，当靶分子是酶或当使用针对靶分子的酶标记的抗体时，使用酶学反应。在本发明的上下文中，当相对于结合在pbs洗涤的珠粒上的靶分子的量(＝对照)，250mm咪唑洗涤的珠粒(＝样品)在洗涤后含有至少约30％、至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，优选约85％，甚至更优选至少约90％，甚至更优选约95％，最优选至少约99％的靶分子时，优选地，靶分子配体被认为在“产物配合物”中是“动力学惰性”结合的。[0054]在一个实施方案中，金属阳离子可以是co3 或cr3 。在一个特别优选的实施方案中，金属是co3 。如所附实施例中所证明的，co3 特别适合并且允许快速且容易地产生本发明的配合物并确保与靶分子的动力学惰性结合。[0055]在另一个优选的实施方案中，金属是pt4 。如所附实施例中所证明的，pt4 特别适合并且允许快速且容易地产生本发明的配合物并确保与靶分子的动力学惰性结合。[0056]本发明还涉及一种配合物，其中金属阳离子为co3 ，金属阳离子螯合域的螯合配体为nta(或其衍生物)。[0057]本发明还涉及一种配合物，其中金属阳离子为co3 ，金属阳离子螯合域的螯合配体为ida(或其衍生物)。[0058]本发明还涉及一种配合物，其中金属阳离子为co3 ，金属阳离子螯合域的螯合配体为talon(或其衍生物)。[0059]本发明还涉及一种螯合物，其中金属阳离子为pt4 ，金属阳离子螯合域的螯合配体为nta(或其衍生物)。[0060]本发明还涉及一种配合物，其中金属阳离子为pt4 ，金属阳离子螯合域的螯合配体为talon(或其衍生物)。[0061]本发明还涉及一种配合物，其中金属阳离子为pt4 ，金属阳离子螯合域的螯合配体为ida(或其衍生物)。[0062]因此，本发明涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0063]a)co3 ；[0064]b)金属阳离子配体，其为选自co32-和hco3-的碳酸根或硝酸根；和[0065]c)包含nta和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0066]本发明还涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0067]a)co3 ；[0068]b)co32-或hco3-配体；和[0069]c)包含nta和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0070]本发明还涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0071]a)co3 ；[0072]b)co32-或hco3-配体；和[0073]c)包含talon和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0074]本发明还涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0075]a)co3 ；[0076]b)co32-或hco3-配体；和[0077]c)包含ida和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0078]本发明还涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0079]a)pt4 ；[0080]b)co32-或hco3-配体；和[0081]c)包含nta和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0082]本发明还涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0083]a)pt4 ；[0084]b)co32-或hco3-配体；和[0085]c)包含ida和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0086]本发明还涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0087]a)pt4 ；[0088]b)co32-或hco3-配体；和[0089]c)包含talon和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0090]在一个实施方案中，金属阳离子螯合域的螯合配体是二亚乙基三胺-五乙酸(dtpa)并且金属阳离子选自gd3 ,in3 ,和fe3 。在一个实施方案中，金属阳离子螯合域的螯合配体是单宁酸(ta)并且金属阳离子是co3 。在一个实施方案中，金属阳离子螯合域的螯合配体是联吡啶胺(dpa)并且金属阳离子是co3 。在一个实施方案中，金属阳离子螯合域的螯合配体是1,4,7-三氮杂环壬烷次膦酸(trap)并且金属阳离子是ga3 。在一个实施方案中，金属阳离子螯合域的螯合配体是乙二半胱氨酸并且金属阳离子是re3 或tc3 。在一个实施方案中，金属阳离子螯合域的螯合配体是三亚乙基四胺-六乙酸(ttha)并且金属阳离子选自gd3 ,in3 和fe3 。在一个实施方案中，金属阳离子螯合域的螯合配体是1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(nota)并且金属阳离子是in3 。在一个实施方案中，金属阳离子螯合域的螯合配体是1-(1,3-羧基-丙基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-4,7-二乙酸(nodaga)并且金属阳离子是in3 。[0091]本发明配合物的金属阳离子配体(也可称为第二配体)选自碳酸根co32-和hco3-或硝酸根。本发明人已经发现，使用这些金属阳离子配体有利于靶分子的配位。这是通过从配合物中更快、更容易地将碳酸根或硝酸根交换为靶分子来实现的。从配合物释放后，碳酸根和硝酸根都可以质子化。这种质子化促进自配合物的释放。在碳酸根的情况下，co32-和hco3-的质子化甚至会导致气体形成。不受理论的束缚，据信气体形成进一步增加碳酸根配体与靶分子交换的交换动力学和热力学。因此，碳酸根co32-和hco3-是特别优选的金属阳离子配体。硝酸根也可用作金属阳离子配体，但这是不同的发明。[0092]在一个优选的实施方案中，金属阳离子配体是选自co32-和hco3-的碳酸根。在所附实施例中证明，这些碳酸根促进具有靶分子的产物配合物形成。换言之，本发明的配合物在将标记物和/或载体连接到靶分子方面更具反应性。[0093]在一个具体实施方案中，本发明的配合物包含[co(iii)(nta)co3]2-配合物、[co(iii)(nta)hco3]-配合物或其水合物。标记物和/或载体连接在nta上。在这些配合物中，nta占据了四个配位点，碳酸根占据了两个配位点。碳酸根是双齿配体，即有两个原子可以作为供体(即路易斯碱)与配合物中的金属阳离子配位，其促进靶分子的结合。nta是一种螯合剂，由于其四齿结合，与金属阳离子的结合特别强。因此，nta可以阻止由不希望的金属阳离子释放导致的不期望的配合物和产物配合物分解。[0094]在一个优选的实施方案中，本发明的配合物包含[co(iii)(ida)co3]-配合物、[co(iii)(ida)hco3]配合物或其水合物。标记物和/或载体连接在ida上。在这些配合物中，ida占据了三个配位点，碳酸根占据了两个配位点。碳酸根是双齿配体，即有两个原子可以作为供体(即路易斯碱)与配合物中的金属阳离子配位，其促进靶分子的结合。推测对于三齿金属结合域，蛋白质的配位可以得到额外促进，因为第二金属阳离子配体可以仍然与金属保持半配位，而在使用四齿金属结合域时其会被完全置换下来。由于部分配位，该配体可以容易地被蛋白质的一个组氨酸残基置换。由于此刻的靠近，另外的一个或两个组氨酸残基可以释放出最后的配体并形成稳定的配合物。[0095]本发明配合物的金属阳离子螯合域包含标记物和/或载体。换言之，本发明的配合物包含功能性部分。优选标记物和/或载体不同于螯合配体的配位基团，即不共享相同的原子。然而，在一些实施方案中，螯合配体和标记物和/或载体也可以共享一个或多个原子。[0096]本发明配合物的金属阳离子螯合域可包含螯合配体和标记物，但不含载体。或者，本发明配合物的金属阳离子螯合域可包含螯合配体和载体，但不包含标记物。在另一个实施方案中，本发明配合物的金属阳离子螯合域可包含载体和标记物。[0097]在一个具体实施方案中，金属阳离子螯合域还可在螯合配体与标记物和/或载体之间包含接头。这种接头可以促进配合物的形成和/或在标记物和/或载体与螯合配体之间建立限定的距离。接头原则上可以是任何适合以所需距离将标记物/载体与螯合配体共价连接的化学连接。本领域技术人员可以根据该键对预期用途的环境和条件的耐受性，依据需要来选择接头。接头可以例如包括抗体-药物偶联物(adc)接头、带负电荷的砜基团、聚乙二醇(peg)、焦磷酸二酯、基于肽的接头(例如组织蛋白酶b-反应性接头，例如val-cit-pabc或val-ala-pabc；其中cit是指l-瓜氨酸，pabc是指对氨基苄氧羰基)、腙、含二硫化物的接头、含硫醚的接头、β-葡糖苷酸或其组合。在一个实施方案中，接头可是抗体-药物偶联物(adc)接头、带负电荷的砜基团、焦磷酸二酯、基于肽的接头(例如组织蛋白酶b-反应性接头，例如val-cit-pabc或val-ala-pabc)、腙、含二硫化物的接头、含硫醚的接头、β-葡糖苷酸、核酸接头(优选dna)或其组合。抗体-药物偶联物(adc)接头是本领域已知的。可以在本发明的上下文中使用的示例性adc接头例如描述于tsuchikama和an；2018，adc_review2019；和/或jain等人，2015年，所有这些通过引用整体并入本文。基于带负电荷的砜基团的接头也是本领域已知的。可以在本发明的上下文中使用的具有带负电荷的砜基团的示例性接头在zhao等人，2011中进行了描述，该文献通过引用整体并入本文。peg接头是本领域已知的。可以在本发明的上下文中使用的示例性peg接头在lyon等人，2015中进行了描述，其通过引用整体并入本文。焦磷酸二酯接头是本领域已知的。可以在本发明的上下文中使用的示例性焦磷酸二酯接头描述于kern等人，2016年，其通过引用整体并入本文。基于肽的接头(例如组织蛋白酶b反应性接头，例如val-cit-pabc或val-ala-pabc)是本领域已知的。dubowchik等人，2002和/或hartley,2011中描述了可用于本发明上下文中的示例性基于肽的接头(例如组织蛋白酶b反应性接头，例如val-cit-pabc或val-ala-pabc)，所述文献的全部内容以引用方式并入本文。腙接头是本领域已知的。可用于本发明上下文中的示例性腙在tolcher等人，1999中进行了描述，该文献通过引用整体并入本文。含有二硫化物的接头是本领域已知的。可以在本发明的上下文中使用的示例性含二硫化物的接头在saito等人，2003中进行了描述，该文献通过引用整体并入本文。含有硫醚的接头是本领域已知的。可以在本发明的上下文中使用的示例性含硫醚的接头描述于stenton等人，2018年，其通过引用整体并入本文。β-葡糖苷酸接头是本领域已知的。可以在本发明的上下文中使用的示例性β-葡糖苷酸接头在jeffrey等人，2010中进行了描述，其通过引用整体并入本文。核酸接头，例如dna接头是本领域已知的。[0098]金属阳离子螯合域的标记物可以包含或由以下组成：荧光团、诊断剂、靶向部分、治疗剂、聚乙二醇(peg)分子、脂质、生物素(和/或其衍生物，例如,光敏生物素(photobiotin)：n-(4-叠氮基-2-硝基苯基)-氨基丙基-n'-(n-d-生物素酰基-3-氨基丙基)-n'-甲基-1,3-丙二胺(forsteretal.,1985),蛋白质(例如抗体)、肽或毒素。标记物还可以包含反应基团或由反应基团组成，优选选自硫醇基团或适用于点击化学(clickchemistry)的反应基团。适用于点击化学的反应基团的非限制性实例是叠氮化物、炔烃、硝酮、四嗪和四唑。本文别处提到的术语“衍生物”的定义在此比照适用。[0099]标记物可包括可直接检测的功能性部分(例如荧光、生色、电子致密、化学发光和放射性标记物)，以及可间接检测的部分，例如酶或配体，例如通过酶促反应或分子相互作用检测。[0100]示例性标记物包括但不限于，放射性同位素32p,14c,125i,3h,和131i(优选这些原子不形成螯合配体的一部分)、荧光团、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(与使用过氧化氢来氧化染料前体如hrp的酶结合使用)、乳过氧化物酶(lactoperoxidase)或微过氧化物酶(microperoxidase)、生物素/亲和素、自旋标记、噬菌体标记、稳定的自由基等。在另一个实施方案中，标记物是正电子发射体。正电子发射体包括但不限于，68ga,18f,64cu,86y,76br,89zr,和1241。在一个特定实施方案中，正电子发射体是89zr。[0101]在一个实施方案中，所述标记物是对氧化剂(优选h2o2)处理敏感的标记物。“对氧化剂敏感”在本文中是指在氧化剂处理后，标记物显示出降低的功能/活性(例如，在荧光团的情况下，荧光)和/或稳定性。优选地，氧化剂处理是用20mmh2o2溶液处理并且标记物在至少0.5h、1h、2h或24h的处理之后是敏感的。在优选的氧化剂敏感性测试中，温育可以在20mmh2o2溶液中进行至少1小时，例如恰好1小时，正如wegner和spatz，2013年中对氧化步骤所描述的。或者，该测试可以在0.05％(v/v)h2o2溶液中进行至少90分钟，例如恰好90分钟，如zatloukalová和kucerová的氧化步骤所述。为了缩短测试时间，还可以使用具有更高h2o2浓度的溶液，例如1％(v/v)h2o2。优选的h2o2浓度和温育时间，包括可用于评估h2o2敏感性的时间过程实验，在所附实施例中描述。用于测量氧化剂敏感性的测定试验包括，用包含氧化剂(例如h2o2)的溶液(在所需的氧化剂浓度下，优选在水溶液中，甚至更优选在水中)温育，并在处理之前和处理期间的不同时间点，测量指示标记物功能/活性和/或稳定性的读出(例如，对于荧光团，测量发射的荧光)。当读出测量值表明标记物功能/活性和/或稳定性丧失时，标记物被认为是“氧化敏感的”。评估标记物功能/活性和/或稳定性丧失的优选时间点是，在如上所述所使用的氧化剂存在下将co2 氧化为co3 所需的时间。在评估h2o2敏感性时，优选的h2o2浓度和温育时间是在本段落中上面指出的。在所附实施例中描述了用于测试荧光团标记物的氧化敏感性的示例性方法。本领域技术人员可以根据所使用的标记物来修改该测定，并适应性地调整参数如h2o2浓度和温育时间。[0102]在一个实施方案中，标记物可以包括荧光团或可以由荧光团组成。荧光团是本领域已知的并且是公众可获得和/或商业可得的。将荧光团偶联到金属阳离子螯合域的螯合配体的方法也是本领域已知的。如所附实施例所示，许多荧光团(例如荧光素、fitc、atto488和alexa488)对h2o2处理敏感。这种敏感性使得本发明的配合物特别适合在荧光团作为标记物的情况下使用。然而，这种优势并不限于荧光团。在一个实施方案中，金属结合域可以包含荧光团作为标记物并且螯合配体可以是nta。在一个实施方案中，金属结合域可以包含荧光团作为标记物并且螯合配体可以是ida。[0103]在一个实施方案中，荧光团可以是荧光素、fitc、atto488和alexa488。如所附实施例中所证明的，这些荧光团对h2o2处理敏感。[0104]在一个实施方案中，本发明的配合物，更具体地标记物和/或载体，可以不是或不包含如shao等人所述的卟啉-磷脂(邵等人，2015年)。[0105]在本发明上下文中，术语“标记物”不包括作为金属阳离子螯合域的螯合配体的一部分的单原子，例如氢原子。优选地，标记物涉及包含至少两个原子、至少三个或至少10个原子的结构。[0106]优选地，标记物是功能性部分和/或可以用本领域已知的方法(例如nmr、荧光测量、酶学测定法等)检测的部分。[0107]如上所述，金属结合域可包含载体(任选地还有标记物)。根据本发明的载体的非限制性实例是聚合物、水凝胶、微粒、纳米颗粒、球体(例如纳米球或微球)、珠子(例如微珠)、量子点、辅基和固体表面。在一个实施方案中，载体可以包括或者是纳米图案化的金表面。这种纳米图案化的金表面可以用硫醇残基进行官能化。[0108]本领域技术人员知晓，将螯合配体连接/固定在载体上以形成包含螯合配体和载体的金属结合域的技术。例如，如果螯合配体是氨基多羧酸(例如nta)，则螯合配体可以例如通过羧酸基团或氨基基团中的至少一个与固相共价结合。在另一个实施方案中，螯合配体可以通过酰胺键或酯键连接到载体上。[0109]在一个优选的实施方案中，载体是珠子(例如微珠)，例如琼脂糖珠。因此，本发明涉及，具有连接在其上的本发明配合物(没有标记物和/或载体)的珠子(例如微珠)。这些珠子也可以称为亲和基质。这种具有本发明配合物的珠子是一种即用型试剂，可以用于将靶分子连接到珠子上(即，将靶分子固定到珠子上)。[0110]因此，本发明涉及一种配合物(例如用于将靶分子连接到珠子的配合物)，其包含：[0111]a)co3 ；[0112]b)金属阳离子配体，其为选自co32-和hco3-的碳酸根或硝酸根；和[0113]c)包含nta和珠子的金属阳离子螯合域。[0114]优选地，本发明涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0115]a)co3 ；[0116]b)co32-或hco3-配体；和[0117]c)包含nta和珠子的金属阳离子螯合域。[0118]更优选地，本发明涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0119]a)co3 ；[0120]b)co32-或hco3-配体；和[0121]c)包含ida和珠子的金属阳离子螯合域。[0122]此类配合物可如所附实施例中所述产生。例如，nta琼脂糖树脂(qiagen,1022963)可以用10个珠体积的ddh2o洗涤一次，用3个珠体积的100mmedtaph7.5洗涤一次，用10个珠体积的ddh2o洗涤三次。随后可将在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o或k3[co(iii)(co3)3]*3h2o以10个珠体积加入珠子中。在23℃以1100rpm在恒温振荡器中振荡温育48小时后，可以用10个珠体积的ddh2o洗涤珠子两次，用10个珠体积的蛋白质缓冲液(50mmtrisph7.4，150mmnacl)洗涤一次。最后可以收集珠子(例如通过离心)以获得连接在珠子(作为载体)上的配合物。[0123]如所附实施例所示但不受理论束缚，金属阳离子、金属阳离子配体和金属阳离子螯合域温育以形成本发明配合物的温育时间，可以影响本发明配合物与靶分子的之后缔合。用于形成本发明配合物的温育时间在本发明的上下文中是“配合物形成时间”。本发明配合物与靶分子的温育时间在本发明的上下文中是“配合物-靶温育时间”。非限制性实施例18显示，例如，当配合物形成时间为10分钟时，在30分钟的配合物-靶温育时间后，相比于具有相同的配合物-靶温育时间但具有48小时的配合物形成时间的情况，有显著更多的靶分子(即his6-gfp)结合到本发明的配合物上(图20b)。然而，当配合物-靶温育时间延长(例如至48小时)时，his6-gfp与本发明配合物的有效结合可以被恢复(参见例如图10)。本领域技术人员可以容易地，根据需要，适应性地调整相应的温育时间。[0124]此外，所附实施例表明，配合物形成时间和配合物-靶温育时间两者均影响所得产物配合物的稳定性，即本发明配合物与靶分子之间的稳定性。实施例18证明，当配合物形成时间为10分钟且配合物-靶温育时间为30分钟时，靶分子与本发明的配合物有效结合，但只有一小部分产物配合物是动力学惰性的，即对咪唑处理具有抗性(图20b)。当一个温育时间，即配合物形成时间或配合物-靶温育时间被延长(例如至48小时)时，动力学惰性产物配合物的比例将增加。[0125]也如非限制性实施例18所示，10分钟的配合物形成时间和48小时的配合物-靶温育时间的组合可以导致高比例的稳定产物配合物。此外，48小时的配合物形成时间和30分钟的配合物-靶温育时间的组合也可以导致稳定的产物配合物(参见例如实施例10，图11)。如上所述，48小时的配合物形成时间可导致靶分子与本发明配合物的结合效率降低。[0126]因此，根据靶分子的性质，本领域技术人员知晓如何选择合适的温育时间。可能的情况是，靶分子非常倾向于例如在温育过程中发生变性或聚集，但需要动力学惰性的产物配合物。因此，当需要时，本领域技术人员可以选择延长的配合物形成时间(例如48小时)和较短的配合物-靶温育时间(例如30分钟)，尽管可能减少所得产物配合物的量。应注意，所附实施例18是用nta作为金属螯合配体进行的。[0127]不希望受理论束缚，值得注意的是，上述温育时间的影响可能取决于所使用的金属螯合配体。例如，在所附非限制性实施例15中，ida用作金属螯合配体，并且所述实施例证明，即使在两个短的温育时间(即10分钟的配合物形成时间和30分钟的配合物-靶温育时间),也可以形成高比例的动力学惰性的产物配合物。[0128]因此，本领域技术人员明了，可能需要，针对每个单独的金属螯合配体，确定温育时间可对产物配合物稳定性造成的影响。然而，相应温育时间的这种适应性调整完全在相关技术人员的技能范围内，并且可以通过本发明的教导和其中提供的实验部分的说明和科学细节来容易地实现。类似地，本领域技术人员也能够容易地适应性调整其他参数，如ph、温度和缓冲系统，以获得动力学惰性的产物配合物。[0129]表1可以帮助本领域技术人员确定温育时间对产物配合物稳定性的影响以及对稳定的，即动力学惰性的产物配合物的产率的影响。[0130]例如，中等稳定性是指，与导致高稳定性(即高比例的动力学惰性产物配合物)的温育时间相比，较小比例的产物配合物是动力学惰性的。应注意的是，中等稳定性也可导致在某些应用和
技术领域：
：中有用的稳定产物配合物产率。当无限制量的靶分子可得且短期内需要稳定的产物配合物时，本领域技术人员可参考以下方案，尤其是当nta用作金属阳离子螯合配体时：[0131]-选择两个较短的温育时间；[0132]-用咪唑处理生成的产物配合物(例如结合在珠子上)以去除非动力学惰性的产物配合物；[0133]-(例如通过回收珠子)回收抗咪唑处理的产物配合物，即动力学惰性的产物配合物；[0134]本领域技术人员非常清楚如何根据应用来适应性调整所述方案。[0135]很明显，表1可以进一步用于选择配合物形成时间和配合物-靶温育时间。[0136]因此，表1中公开的时间可以与本文所述的本发明配合物、方法和用途组合。[0137]因此，本发明涉及例如配合物，其包含：[0138]a)金属阳离子；[0139]b)金属阳离子配体co32-或hco3-；和[0140]c)包含螯合配体和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域；[0141]其中配合物形成时间约为48小时。[0142]本发明还涉及一种配合物，其包含：[0143]a)金属阳离子；[0144]b)金属阳离子配体co32-或hco3-；和[0145]c)包含螯合配体和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域；[0146]其中配合物形成时间约为10分钟。[0147]应注意的是，表1仅用于举例说明目的，并不以任何方式限制本发明的范围。[0148]表1：配合物形成时间和配合物-靶温育时间对产物配合物稳定性和稳定的产物配合物的产率的影响。[0149]如果没有另外说明，所有温育步骤均在25℃进行。[0150][0151][0152]可以通过在温育过程中向系统中引入能量/暴露于能量来增强nta与co3 的结合。这种将能量引入系统/暴露于能量的方式可以是在不同频率的电磁共振技术(如与nmr、x射线、uv-vis一起使用)、热、超声或等离子体共振技术。[0153]本发明的载体或其表面可以进一步用氨基基团、羧酸基团和/或活化酯如nhs酯官能化。[0154]包含载体的金属结合域的进一步非限制性实例描述于wo2014/072525a1和wo2003/072143中，所述文献通过引用整体并入本文。[0155]在第二个方面，本发明涉及包含本发明配合物的组合物。本文其他地方对配合物所描述的内容在此比照适用。[0156]除了配合物之外，组合物可以包含另外的化合物。此类化合物也可以是用于产生本发明配合物的化学化合物，如本文别处所描述。组合物还可包含其他配合物，例如具有相同金属阳离子但不同配体的配合物。组合物可以是溶液或固体的形式。[0157]在一个实施方案中，本发明的组合物可以是包含本发明配合物和hco3-或co32-的溶液。hco3-或co32-的存在可以阻止配合物的金属阳离子配体的释放，即促进配合物的稳定性。当金属阳离子配体也是碳酸根时，优选在溶液中使用hco3-或co32-。如果使用硝酸根作为金属阳离子配体，则溶液可以包含硝酸根而不是hco3-或co32-。[0158]组合物溶液中hco3-或co32-的浓度可以是至少1mm，优选至少10mm，最优选1m。组合物溶液中硝酸根的浓度可以是至少1mm，优选至少10mm，最优选1m。[0159]本发明人发现，本发明的配合物也可以作为在其他成分存在的情况下，例如，在合成后未纯化时，将标记物和/或载体连接到靶分子的试剂，来实现其功能。因此，本文所述的本发明配合物的用途以及本文所述的使用本发明配合物的方法可以使用本发明的组合物来比照实施。本领域技术人员可以避免组合物中可能对相应用途或方法的效率和/或动力学产生负面影响的组分。[0160]在第三方面，本发明提供了一种生产本发明配合物的方法。该生产方法包括一起温育：(i)金属阳离子；(ii)金属阳离子配体，和(iii)金属阳离子螯合域。在溶液中(即，在溶剂存在下，优选水溶液)温育这些组分期间，本发明的配合物将容易地形成。如上所述，在本发明的上下文中，所述温育的时间是“配合物形成时间”。表1和所附实施例可以帮助本领域技术人员选择合适的配合物形成时间。因此，本发明还涉及一种生产方法，包括一起温育(i)金属阳离子；(ii)金属阳离子配体和(iii)金属阳离子螯合域，其中温育时间，即配合物形成时间为约48小时。本发明还涉及生产方法，其包括一起温育(i)金属阳离子；(ii)金属阳离子配体和(iii)金属阳离子螯合域，其中温育时间，即配合物形成时间为约1小时。本发明进一步涉及生产方法，包括一起温育(i)金属阳离子；(ii)金属阳离子配体和(iii)金属阳离子螯合域，其中温育时间，即配合物形成时间为约3.5小时。此外，本发明涉及生产方法，包括一起温育(i)金属阳离子；(ii)金属阳离子配体和(iii)金属阳离子螯合域，其中温育时间，即配合物形成时间为约30分钟。同样，其他温育时间在本领域技术人员的常规技能中。[0161]在本文其他地方关于金属阳离子、金属阳离子配体和金属阳离子螯合域的描述，在此比照适用。[0162]在一个优选的实施方案中，金属阳离子和金属阳离子配体可以以中性配合物，优选盐的形式提供(例如作为固体或作为溶液)。中性配合物(例如盐)也可以包含其他组分。在该实施方案中，温育意味着将中性配合物(例如盐)与金属阳离子螯合域在溶液中混合并将该混合物保持规定的时间。当使用中性配合物(例如盐)时，该方法可以进一步包括产生中性配合物(例如盐)的步骤。任选地，盐可以作为固体得到并且可以被过滤和/或洗涤。[0163]温育可以进行至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少8小时、至少10小时、至少12小时、至少15小时、至少18小时、至少24小时或至少48小时。换言之，配合物形成时间可以是至少约1分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约8小时、至少约10小时、至少约12小时、至少约15小时、至少约18小时、至少约24小时或至少约48小时(也参见表1)。温育时间越长，形成的配合物就越多。在某个反应时间点，可以观察到配合物形成的饱和。观察到这种饱和的时间点和形成的配合物的产率取决于，例如，温度和所用组分的浓度以及组分本身(例如选择的缓冲液)。对于该生产过程，达到饱和不是必需的，但可以提高生产产量。[0164]温育原则上可以在用于反应的溶剂处于液态的任何温度下进行。当使用水溶液或水作为溶剂时，温度可以从0℃到99℃之间选择。优选地，根据所使用的标记物和/或载体的热稳定性来选择温度。因此，优选的温度范围是例如2℃至42℃、4℃至37℃和4℃至25℃。不受理论的束缚，更高的温度可以促进配合物的形成，因此优选更高的温度，只要对标记物和/或载体稳定性没有负面影响即可。本领域技术人员可以根据标记物和/或载体的热稳定性的知识来选择温度。[0165]金属阳离子、金属阳离子配体和金属阳离子螯合域可以各自单独地选择，如本文别处所述。本文别处描述的关于这些组分或其子集之组合的优选方式，在此比照适用。[0166]本发明配合物的生产方法可以进一步包括收集和/或纯化配合物。如上所述，本发明配合物在其他化合物存在下，特别是还包括通过本发明生产方法的温育步骤生成的反应混合物时，也发挥其功能。然而，在某些情况下，可能期望纯化和/或分离配合物。洗涤优选用包含1mm、优选10mm、甚至更优选100mm并且最优选1m的co32-或hco3-的溶液进行。如所附实施例和附图所示，当本发明的配合物用于将标记物和/或载体连接到靶分子(例如蛋白质)时，用这种溶液洗涤本发明的配合物可以导致标记物和/或载体的连接得到改进。不受理论束缚，用包含1mco32-或hco3-的溶液进行洗涤步骤，可防止co32-或hco3-配体在洗涤过程中从本发明的配合物释放。[0167]如果该方法包括载体，则纯化和/或分离可涉及一个或多个洗涤步骤。然后可以通过在最后的洗涤步骤之后从载体去除洗涤缓冲液来分离载体。例如，如果使用珠子，可以通过离心使珠子沉淀并且可以去除上清液。备选地，可以使用允许液体流过但保留附着载体的配合物的过滤柱。过滤柱的优点是，与使用沉淀和吸出上清液相比，在洗涤步骤中损失较少的载体(例如珠子)。[0168]当使用标记物时，纯化方法可涉及使用特异性识别标记物的亲和基质。在与亲和基质结合后，可以将配合物洗涤一次或多次以去除游离试剂。在最后一步中，可以洗脱配合物。配合物的纯化和分离可另外或可选地包括色谱，例如尺寸排阻色谱或阴离子或阳离子交换色谱。或者，可以通过ni2 -nta树脂将标记与未标记的蛋白分开，因为与带有游离his标签的未标记蛋白质相比，标记蛋白质与ni2 -nta将显示减少的相互作用至没有相互作用，如wegner和spatz，2013年所示。[0169]纯化本发明配合物的方法，尤其是当配合物不包含载体并且使用co3 作为金属阳离子时，也可以通过本领域中描述的方法进行(参见，例如shibatam.，1983)。[0170]本发明的优选配合物包含co3 作为金属阳离子和选自co32-或hco3-的碳酸根作为金属阳离子配体。用于生产本发明的这种优选配合物的方法可以包括，以具有抗衡离子的中性配合物形式，例如盐的形式，提供co3 和co32-或hco3-。或者，可以在溶液中提供包含co3 和co32-或hco3-的带电荷配合物。在一个优选的实施方案中，中性配合物(和盐)选自三(碳酸根)合钴(iii)酸钠三水合物(na3[co(iii)(co3)3]*3h2o)或三(碳酸根)合钴(iii)酸钾三水合物(k3[co(iii)(co3)3]*3h2o)。[0171]三(碳酸根)合钴(iii)酸钠三水合物(na3[co(iii)(co3)3]*3h2o)可以如bauer和drinkard(baueranddrinkard1960)所述合成。简而言之，可以边搅拌，边将在50mlddh2o中的0.1摩尔(29.1克)co(ii)(no3)*6h2o(sigma；1.02554)与10ml30％过氧化氢(riedel-dehaen；18312)的混合物逐滴加入0.5摩尔(＝42.0克)碳酸氢钠(merck；1.06329)在50mlddh2o中的冰冷浆液。然后可以在连续搅拌下在冰上温育混合物1小时。随后，可以过滤该橄榄色产物并用冷水、无水乙醇和无水乙醚分别洗涤三次。最后，产物可以在真空下干燥过夜，并且可以可选地在-20℃的氮气气氛中储存。本领域技术人员可以适应性地调整使用的浓度和量。可以通过nmr来确认生产成功，例如如所附实施例中所用。[0172]三(碳酸根)合钴(iii)酸钾三水合物(k3[co(iii)(co3)3]*3h2o)可以在溶液中合成，如shibata(shibata1983；morietal.1956的调整)所述。简而言之，可以在搅拌下将在24mlddh2o中的0.1摩尔(24克)co(ii)cl2*6h2o(honeywell；255599)和40ml30％过氧化氢的混合物逐滴加入到0.7摩尔(70克)碳酸氢钾(honeywell；237205)在70mlddh2o中的冰冷浆液。随后，所得绿色溶液可被过滤(例如通过抽吸)并直接用于后续实验。本领域技术人员可以适应性调整使用的浓度和量。可以通过nmr来确认生产成功，例如如所附实施例中所用。[0173]当要形成的配合物的金属阳离子配体是hco3-或co32-时，温育在包含hco3-或co32-的溶液(优选缓冲溶液)中进行。优选地，hco3-或co32-以至少1mm、优选至少10mm和最优选1m的浓度提供。[0174]特别优选的是，本发明配合物的生产方法不包括，在标记物和/或载体存在下，例如通过h2o2处理，氧化形成本发明配合物中心的金属阳离子的氧化步骤。[0175]一方面，本发明进一步涉及一种试剂盒，其包括：[0176]a)金属阳离子；[0177]b)金属阳离子配体，其为选自co32-和hco3-的碳酸根或硝酸根，优选co32-和hco3-；和[0178]c)包含螯合配体和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0179]在本文别处关于金属阳离子、金属阳离子配体和金属阳离子螯合域、螯合配体和标记物和/或载体所描述的内容，在此比照适用。[0180]试剂盒可以是用于生产本发明配合物的试剂盒，即可以包含可以反应形成本发明配合物的组分。在另一个实施方案中，在该试剂盒中可包含已组装的配合物。[0181]在一个特别优选的实施方案中，金属阳离子是co3 ，并且该试剂盒以三(碳酸根)合钴(iii)酸钠三水合物(na3[co(iii)(co3)3]*3h2o)或三(碳酸根)合钴(iii)酸钾三水合物(k3[co(iii)(co3)3]*3h2o)形式包含金属阳离子和金属阳离子配体。优选地，金属阳离子螯合域包含与配体和/或载体偶联的talon、nta或ida，优选nta或ida，最优选ida。使用该试剂盒可以产生根据本发明的优选co3 配合物。[0182]在一方面，试剂盒的组分a)至c)可以不作为一个实体，即，以本发明配合物的形式提供。[0183]在另一方面，试剂盒还可以包含组装成本发明配合物的金属阳离子、金属阳离子配体和金属阳离子螯合域，例如，以盐的形式(例如，具有本文别处指出的抗衡离子；或在溶液中，例如在包含co32-或hco3-的溶液中，例如，如在本发明组合物的上下文中所定义的)。此类试剂盒还可包含试剂，例如合适的反应缓冲液(优选如本文别处针对使用本发明配合物的方法和用途时所描述的任何缓冲液)。任选地，该试剂盒还可包括纯化材料(例如珠子、琼脂糖珠)和/或过滤柱。在一个优选的实施方案中，试剂盒可以包含本发明的配合物，其中载体是珠子(例如微珠)。在该实施方案中，配合物作为即用型亲和树脂提供用于靶分子结合。[0184]如上所述，本发明的配合物特别适用于通过金属阳离子介导的相互作用将标记物或载体连接到靶分子上。本发明人惊奇地发现，相对于先前使用的涉及水作为金属阳离子配体的配合物，使用选自co32-或hco3-的碳酸根或硝酸根可以利于具有靶分子的配合物形成。在本领域中，仅描述了不具有标记物和/或载体的[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物(davies和hung，1976；visser等，2001)。然而，这些现有技术文献既没有提供用标记物修饰该配合物的动机，也没有提供使用该配合物来标记靶分子例如蛋白质(例如带his标签的蛋白质)的动机。特别是，这些现有技术文献也没有提示本发明人发现的在将标记物和/或载体连接到靶分子方面的有利特征(参见所附实施例)。[0185]在第四方面，本发明涉及本发明配合物用于将配合物中包含的标记物和/或载体连接到靶分子上的用途。金属阳离子介导的与标记物和/或载体之间的连接，由此通过使本发明的配合物与靶分子接触，从而使得靶分子可以置换配合物的主要配位层中的金属阳离子配体，来实现。因为金属阳离子配体选自co32-,hco3-和硝酸根，所以使用本发明的配合物可以以特别高的速率来实现该连接。正如所附实施例中以碳酸根co32-进行的举例说明，配位层中这些金属阳离子配体可以容易地被靶分子置换，尤其是被包含两个作为路易斯碱起作用的基团的靶分子(例如，带his标签的蛋白质)置换。不受理论的束缚，据信本发明配合物的金属阳离子配体在从配合物中释放后质子化，这反过来促进了它们从配合物中的释放和与靶分子的交换。在碳酸根作为金属阳离子配体的情况下，碳酸根的质子化导致气体形成，其通过促进金属阳离子配体释放，甚至进一步促进靶分子结合。因此，碳酸根co32-和hco3-是本发明上下文中特别优选的金属阳离子配体。[0186]因此，本发明提供了本发明的配合物或组合物用于将标记物和/或载体连接至靶分子的用途。本发明的靶分子包含核酸(例如dna、rna，或由核苷酸类似物制成的dna或rna类似物)、肽或蛋白质。特别地，根据本发明的靶分子可以是核酸(例如dna、rna，或由核苷酸类似物制成的dna或rna类似物)、肽或蛋白质。特别优选的是，本发明上下文中的靶分子包含蛋白质或肽。类似地，还特别优选靶分子是蛋白质或肽。包含在靶分子中的蛋白质或肽、或形成靶分子的蛋白质或肽，必须被配置为使得它们可以在金属配合物中充当配体(路易斯碱)。这意味着该分子必须包含一个或多个部分；特别是(一个或多个)氨基酸，所述部分可以作为配体/路易斯碱起作用并可以与配合物的金属阳离子配位。换言之，靶分子必须被配置为使得其可以交换本发明配合物中的金属阳离子配体从而形成包含靶分子作为配体的新配合物。例如，可以如下测试靶分子的配体是否可以交换本发明配合物中的金属阳离子配体：(i)使用以本发明配合物官能化的珠子(可以如所附实施例中所述进行此类珠子的制备)；(ii)添加靶分子(例如根据所附实施例中描述的方案)；(iii)温育珠子与靶分子(优选，在4℃，至少30分钟，至少1小时，至少3小时，至少3.5小时，至少24小时，优选48小时)；(iv)分离珠子和上清液；(v)通过靶特异性方法(例如基于荧光、抗体检测、酶学测试、定量质谱等)分析上清液和/或珠子中的靶分子。应包括无配合物的阴性对照。然后可以通过测量上清液中靶分子量的减少和/或与珠子结合的靶分子量的增加来检测交换。[0187]在一个优选的实施方案中，靶分子的蛋白质或肽(即包含在靶分子中或形成靶分子)包含在序列[xnsm]k中具有至少四个氨基酸残基的“金属阳离子配体氨基酸基序”，其中x在每个位置上独立地选自可以与本发明配合物的金属阳离子配位，即作为路易斯碱起作用的一组氨基酸；s是不包含在第一组氨基酸中的氨基酸(s在每个位置独立地选自该列氨基酸)；n在每种情况下独立地为1-4；m在每种情况下独立地为0-6；并且k是2-6(参见seqidnos：4至8)，优选2-5(参见seqidnos：4至7)，并且其中“金属阳离子配体氨基酸基序”包含至少4个，优选至少6个，最优选至少8个，选自能够与本发明配合物的金属阳离子配位的氨基酸。“金属阳离子配体氨基酸基序”可以具有规则的序列，即n和m在每次出现时具有相同的值，或不规则的序列，即n和m可以具有不同的值。因此，在一个实施方案中，靶分子可以包含“金属阳离子配体氨基酸基序”，该“金属阳离子配体氨基酸基序”包含如seqidno:4至8中定义的任何氨基酸序列或由其组成，其中“金属阳离子配体氨基酸基序”包括至少4个，优选至少6个，最优选至少8个，选自能够与本发明配合物的金属阳离子配位的氨基酸。氨基酸基序内具有数目更多的能与本发明配合物的金属阳离子配位的第一组氨基酸，可以增加对金属配合物的结合强度和/或特异性，即可以促进与标记物和/或载体的连接。[0188]“能够与本发明配合物的金属阳离子配位的氨基酸组”可以由甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、精氨酸、硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸组成。优选地，能够与本发明配合物的金属阳离子配位的氨基酸组由甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸组成。甚至更优选地，能够与本发明配合物的金属阳离子配位的氨基酸组由甘氨酸、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸组成。已知这些氨基酸适合作为金属配体，能与金属阳离子形成配合物。(chinetal.,1999；mcauliffetal.1966；sugimorietal.1993；sajadi,2010；bellandsheldrick2014)。最优选地，“能够与本发明配合物的金属阳离子配位的氨基酸组”由组氨酸组成；即“x”是组氨酸。[0189]本文所用的“金属阳离子配体氨基酸基序”优选被配置为使得其可以交换本发明配合物中的金属阳离子配体，以形成包含“金属阳离子配体氨基酸基序”作为配体的新配合物。与金属阳离子配体交换以形成新的配合物,可以如上文针对靶分子所述进行测试。[0190]组氨酸是一种经过充分研究的金属阳离子配合物配体，使用金属离子和组氨酸标签形成配合物被广泛地应用于蛋白质生物化学领域中，例如，用于纯化蛋白质或将其附着到表面。在本发明的上下文中，靶分子(例如形成靶分子或包含在其中的蛋白质或肽)可包含“间隔组氨酸标签”，其在序列[hnsm]k中包含至少四个组氨酸残基，其中h是组氨酸，s在每个位置独立地选自不同于组氨酸的氨基酸残基，优选地选自甘氨酸和/或丝氨酸和/或苏氨酸的氨基酸残基，n在每种情况下独立地为1-4，m在每种情况下独立地为0-6，并且k是2-6(参见seqidno：9至13)，优选2-5(参见seqidno：10至13)。间隔组氨酸标签可以具有规则序列，即n和m在每次出现时具有相同的值，或不规则序列，即n和m可以具有不同的值。因此，在一个实施方案中，靶分子可包含间隔组氨酸标签，其包含如seqidno:9至13中定义的任何氨基酸序列或由其组成，其中“金属阳离子配体氨基酸基序”包含至少4个，优选至少6个，最优选至少8个组氨酸残基。多组氨酸标签中更多数量的组氨酸，可以增加对金属阳离子(例如co3 )的结合强度和特异性。然而，过多的连续组氨酸在某些情况下会降低重组蛋白(例如在大肠杆菌中重组表达的蛋白)的表达水平和溶解度。这些问题可以通过用包含甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸的短间隔，即，使用间隔组氨酸标签，中断组氨酸的连续出现来克服。[0191]在一个特别优选的实施方案中，靶分子可以包含his-标签。his-标签可以包含或由2至14个，优选3至10个，甚至更优选4至8个连续的组氨酸或组氨酸样残基组成。在一个实施方案中，his标签可以包括至少2个，优选至少3个，优选至少4个，优选至少5个，最优选至少6个(例如2、3、4、5、6、7或8个)连续的组氨酸或组氨酸样残基。“组氨酸样”是指含有咪唑基团的非天然氨基酸衍生物。在一个特别优选的实施方案中，his-标签由至少4个，优选至少5个，最优选至少6个(例如4、5、6、7或8个)连续的组氨酸残基组成。[0192]his-标签可以是在天然蛋白质中出现的序列段或可以是重组组氨酸标签。“重组”在本文中是指，通过基因工程人工生成的his标签，例如通过改变编码核酸序列使得包含his标签的融合蛋白得以表达。[0193]his-标签可以包含在靶分子的n-末端或c-末端，或者可以作为内部序列段提供。在一些实施方案中，his-标签可以在n-末端和c-末端。[0194]在一个实施方案中，本发明的靶分子可以具有三维结构，其中至少2个，优选至少3个，优选至少4个，优选至少5个，最优选至少6个组氨酸或组氨酸样残基在空间上接近。在此上下文中，“空间接近”优选意指每个残基之间的距离为0至5埃。两个残基之间的“距离”是，两个独立的相邻组氨酸侧链或组氨酸样侧链的两个最近的氮原子之间的最短距离。[0195]本发明靶分子的非限制性优选实例是药物、诊断剂、研究剂、化妆品和/或用于环境处理的蛋白质(例如用于水处理的蛋白质)。[0196]靶分子的其他非限制性优选实例是包含以下的分子或由以下组成的分子：酶、靶向蛋白(例如抗体、纳米抗体等)、细胞因子、转运蛋白(例如用于脂肪酸转运的fabs)、储存蛋白(例如铁蛋白)、机械支持蛋白(例如胶原蛋白)、生长因子、激素(例如胰岛素或tsh)、干扰素、糖蛋白、合成工程化的蛋白或其片段。[0197]本发明上下文中使用的靶分子也可以是核酸。核酸包括嘌呤和嘧啶碱基。已知两者都能够与本发明的金属阳离子形成配合物。优选地，核酸包含至少2个，优选地至少5个并且甚至更优选地至少10个碱基。核酸包括dna、rna、lna和本领域已知的其他核酸衍生物。最优选的是dna。特别地，设想靶分子是折纸结构(origamistructure)，即具有三维折叠的核酸结构。通常通过包括支架链(scaffoldstrand)和u形环链(staplestrand)的几个核酸链的碱基配对，形成这种折纸结构。[0198]本发明的配合物或组合物用于标记靶分子的用途涉及，通过将本发明配合物的金属阳离子配体交换为靶分子，将标记物和/或载体连接至靶分子。所述交换通过使本发明的配合物与靶分子接触来实现。因此，该用途优选包括使本发明的配合物与靶分子在溶液中接触。[0199]因此，一方面，本发明涉及将标记物和/或载体连接到靶分子的方法，包括将本发明配合物或包含本发明配合物的组合物与靶分子一起温育的步骤。靶分子是如本文别处定义的靶分子。[0200]“温育”是指将配合物和靶分子混合在溶液中，并允许混合物反应规定的时间。如上所述，在本发明的上下文中，配合物与靶分子温育的时间是“配合物-靶温育时间”。表1和所附实施例可以帮助本领域技术人员选择配合物-靶温育时间。因此，本发明例如涉及，本发明配合物用于将配合物中包含的标记物和/或载体连接到靶分子上的用途，其中配合物-靶温育时间可为约48小时。如本文所述，配合物形成时间也可以影响产物配合物的形成。也如本文所述，配合物形成时间可以基于表1或所附实施例来选择。因此，本发明涉及例如，本发明配合物用于将配合物中包含的标记物和/或载体连接至靶分子的用途，其中配合物形成时间为约48小时并且配合物-靶温育时间是大约3.5小时。在另一个示例性实例中，本发明还涉及，本发明配合物用于将配合物中包含的标记物和/或载体连接至靶分子的用途，其中配合物形成时间为约10分钟并且配合物-靶温育时间约为48小时。本发明进一步涉及，本发明配合物用于将包含在配合物中的标记和/或载体与靶分子连接的用途，其中配合物形成时间为约10分钟且配合物-靶温育时间为约30分钟。本发明还涉及，本发明配合物用于将配合物中包含的标记物和/或载体连接到靶分子上的用途，其中配合物形成时间为约10分钟且配合物-靶温育时间为约3小时。本发明还涉及，本发明配合物用于将配合物中包含的标记物和/或载体连接到靶分子上的用途，其中配合物形成时间为约48小时且配合物-靶温育时间为约1小时。[0201]在本发明配合物用于将配合物中包含的标记物和/或载体连接到靶分子的用途的一个具体实施方案中，金属螯合配体是ida并且配合物形成时间是10分钟并且配合物-靶温育时间为约30分钟。[0202]在本发明配合物用于将配合物中包含的标记物和/或载体连接到靶分子的用途的另一个优选实施方案中，金属螯合配体是ida并且配合物形成时间是10分钟并且配合物-靶温育时间为约3小时。[0203]将标记物和/或载体连接到靶分子的方法可以包括，回收和/或纯化其上连接有标记物和/或载体的靶分子的步骤。这将提供其上连接有标记物和/或载体的分离靶分子。[0204]如果方法包括连接载体，则可以通过分离载体来实现载体所连接的靶分子的纯化和/或分离。例如，如果使用固体载体，可以通过离心将珠子沉淀并且可以去除上清液。或者，可以使用允许液体流过但保留附着载体的配合物的过滤柱。任选地，可以用缓冲溶液洗涤载体以去除杂质。[0205]通常，无论使用载体或标记物，分离和/或纯化都可以通过色谱进行。所述色谱可以包括或由大小排阻层析组成，其利用连接到载体和/或标记物的靶分子与游离靶分子和本发明配合物之间的分子大小和形状差异。[0206]可以用于纯化根据本发明的带有标记物和/或载体的靶分子的方法也描述在wo2014/072525中，该文献通过引用整体并入本文。[0207]在一个实施方式中，还可以使用wo2014/072525中描述的常规ni-nta柱进行纯化。[0208]本发明配合物或包含其的组合物的温育可以在具有不同ph值的溶液中进行。而标记物和/或载体与靶分子的连接可以在多种ph值下发生。ph值越低，越有利于金属阳离子配体(即碳酸根或硝酸根)的释放。这是因为释放的配体可以被质子化。当质子化时，碳酸根co32-和hco3-甚至可以形成气体释放出来。[0209]虽然原则上较低的ph值有利于交换反应，但温育期间的ph通常选择在与所用靶分子相容的范围内。特别是蛋白质在许多情况下对过低或过高的ph值敏感。优选选择ph以使得靶分子的稳定性(例如蛋白质的三维折叠和/或蛋白质的生物学功能)得以维持。然而，也优选将ph选择在靶分子的ph稳定性范围的下限以促进配体交换，即标记物和/或载体与靶分子的连接。本领域技术人员知晓，测试在不同ph值下蛋白质的稳定性和功能的测定法。[0210]在一个优选的实施方案中，本发明配合物与靶分子温育期间的ph在4.0和9.5之间，优选在5.5和8.0之间。在这些ph范围内，大多数靶分子，特别是大多数蛋白质，是稳定的和/或功能性的。[0211]金属阳离子配体和靶分子的交换通常在短时间内发生。因此，根据所需的连接效率和所用的靶分子，根据本发明用于连接标记物和/或载体的方法的温育步骤，可以进行短至仅至少约10秒，优选至少约1分钟，最优选至少约10分钟的时间。在优选的实施方案中，温育进行至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约7小时、至少约9小时、至少约12小时、至少约24小时或至少约48小时。不受理论的8.5；tea:7.0-8.5；tes:6.5-8.5；tris:6.8-9.5；碳酸盐缓冲剂:8.5-11.0。[0220]原则上，其他ph值也可以与上述每种缓冲液一起使用，因为反应可以在宽泛的ph值范围内进行，因此缓冲能力不是绝对必需的。然而，为了保持ph恒定并更好地控制反应，优选在上述ph范围内的ph，其中缓冲剂具有缓冲能力。[0221]缓冲剂可以以不同浓度使用，例如1mm至1m，优选1mm至250mm，最优选1mm至100mm(例如50mm)。本领域技术人员可以通过评估连接效率和使用不同的缓冲剂浓度来测试理想的缓冲剂浓度。[0222]如所附实施例中所证明的，缓冲物质/试剂的选择可影响标记物和/或载体对靶分子的连接效率。不受理论束缚，具有低金属结合常数的缓冲剂显示出增加的连接效率。低金属阳离子结合常数可防止缓冲剂与金属配位并封闭在主要配位层中的配体位置。[0223]因此，在一个实施方案中，本发明上下文中使用的缓冲物质/试剂可以是具有低金属结合常数的缓冲物质/试剂。ferreira等人2015公开了对“低金属结合常数”的理解和此类缓冲物质/试剂的优选实例，其全部内容以引用方式并入本文。[0224]此外，在一个优选的实施方案中，温育步骤在包含一个或更少(优选零个)选自胺基和羰基的基团的缓冲物质/试剂的存在下进行。这些基团包括路易斯碱，可以介导与配合物中金属阳离子的结合。因此，不存在这些基团可以降低或阻止缓冲物质与金属阳离子的结合，从而促进靶分子的结合。[0225]如所附实施例所证实，以下缓冲剂可有利地促进标记物和/或载体连接：mes、hepes、bis-tris和pipes。实施例说明，这些缓冲剂导致比基于tris的缓冲剂更高的连接效率。因此，在一个特别优选的实施方案中，温育期间存在于溶液中的缓冲物质可以选自mes、hepes、bis-tris和pipes。这些缓冲物质特别有利于标记物和/或载体连接。非限制性实施例13说明，可能需要根据用于温育的ph来选择缓冲剂。当在约7.5的ph下进行本发明配合物和靶分子的温育时，可以使用hepes而不是bistris。当在约5.5的ph下进行本发明配合物和靶分子的温育时，可以使用bistris。最合适的缓冲液和ph值的确定完全在相关技术人员的技能范围内，并且可以通过本发明的教导和其中提供的实验部分的说明和科学细节来容易地实现。[0226]鉴于这些结果并基于保持缓冲剂与金属阳离子结合尽可能低的理论考虑，缓冲物质可优选选自：bistris、caps、capso、hepes、hepbs、heppso、mes、mops、mopso、pipes、taps和tes。[0227]在一个优选的实施方案中，可以在溶液中存在ca2 离子的情况下进行本发明配合物或包含该配合物的组合物与靶分子的温育。当本发明配合物的金属阳离子配体是选自hco3-或co32-的碳酸根时，ca2 离子的存在是特别优选的。这是因为ca2 离子可以形成不溶性caco3，caco3从溶液中沉淀出来，从而促进碳酸根从配合物中释放出来。这又促进了靶分子作为配体的结合，从而有利于标记物和/或载体与靶分子的连接。优选地，通过溶解cacl2在反应溶液中来提供ca2 离子。ca2 离子可以在反应开始时加入，即可以在本发明配合物与靶分子接触时直接加入。或者，较不优选地，可以在反应期间以盐(优选cacl2)的形式加入ca2 离子。ca2 离子(优选以cacl2的形式)优选以0.1至50mm、甚至更优选0.1-10mm并且最优选1mm的浓度添加。[0228]根据本发明将标记物和/或载体连接到靶分子的方法不需要例如通过h2o2处理，氧化本发明配合物的金属阳离子的氧化步骤。在一个优选的实施方案中，根据本发明将标记物和/或载体连接到靶分子的方法不包括氧化步骤，例如用h2o2处理。这在形成co3 介导的标记物和/或载体连接的情况下是特别优选的。在先前报道的方法(例如wegner和spatz，2013)中，co3 介导的功能性部分的连接是通过形成his标签靶蛋白作为配体的co2 配合物、并仅在之后氧化co2 为co3 来实现的。如所附实施例所证实，在co阳离子存在下的这种氧化步骤会导致自发的芬顿反应，从而导致蛋白质降解。此外，蛋白质的氧化可干扰蛋白质折叠和功能。因此，本发明方法的一个特别优势是不需要氧化步骤。[0229]用于将标记物和/或载体连接到靶分子的方法，还可以包括产生如本文别处所述的本发明配合物(以及任选地中性配合物，例如其盐)。[0230]根据本发明将标记物和/或载体连接到靶分子的方法，导致产生标记的和/或载体连接的靶分子。因此，该方法也可称为用于产生连接有标记物和/或载体的靶分子的方法。在本文别处指出的关于靶分子的优选方案，在此比照适用。因此，在一个实施方案中，本发明的方法可以是一种将标记物和/或载体连接到蛋白质，例如带有his标签的蛋白质、抗体、其衍生物(例如包括scfv片段和纳米抗体)或其结构域的方法。[0231]将标记物和/或载体连接到靶分子的方法的一个优选实施方案是，靶分子是带his标签的蛋白质并且带his标签的蛋白质连接到载体，所述载体是表面(例如芯片)。在这种优选使用co3 作为金属阳离子、如本文定义的碳酸根作为金属阳离子配体、以及nta、talon或ida作为螯合配体的方法中，his-标签蛋白质被连接到所述表面上。由于靶分子的高稳定性和动力学惰性结合，蛋白质可以以近乎共价的方式结合到表面，并对于咪唑和其他螯合物(例如edta)以及还原等效处理，呈惰性。[0232]在又一方面，本发明涉及通过根据本发明将标记物和/或载体连接到靶分子的方法可获得的或获得的具有连接到其上的标记物和/或载体的靶分子。通过本发明方法获得的、标记的和/或载体连接的靶分子具有如下特征：靶分子和标记物和/或载体都不经历氧化步骤(例如h2o2处理)。相比之下，先前报道的产生此类结构的方法涉及，在i)靶分子和ii)标记物和/或载体中的至少一者或两者存在下的氧化步骤。因此，本发明方法的产物具有未被氧化且不含氧化剂如h2o2的优点。对于产生的标记和/或载体连接的靶分子的医学用途，这也具有关键优势。[0233]在本文别处关于根据本发明的配合物、其组分、靶分子和将标记物和/或载体连接到靶分子的方法所描述的内容，在此比照适用。[0234]通过本发明方法可获得的其上连接了标记物和/或载体的靶分子也是配合物。该获得的“产物配合物”包含本发明配合物的金属阳离子以及与其配位的i)本发明配合物的金属结合域和ii)靶分子。[0235]本发明还提供了一种组合物，其包含通过将标记物和/或载体连接到靶分子的方法可获得或获得的标记的和/或连接有载体的靶分子。[0236]通过本发明方法可获得或获得的标记的和/或载体连接的靶分子、或包含其的组合物，可用作研究试剂。因此，本发明还涉及，通过本发明方法可获得的或获得的标记的或载体连接的靶分子作为研究试剂的用途。类似地，提供了方法，所述方法包括步骤：使用通过本发明方法产生的标记的或载体连接的靶分子作为研究试剂。例如，靶分子可以是固定在固相载体上用于细胞培养的细胞外基质蛋白。[0237]在一个实施方案中，通过本发明方法可获得的或获得的标记的和/或载体连接的靶分子、或包含其的组合物，可用作体外诊断剂。例如，靶分子可以是特异性识别分析物的检测性蛋白(例如，可以识别分析物抗原的抗体)，并且可以配置标记物和/或载体以符合本领域已知的测量方法。[0238]本发明涉及，通过本发明方法可获得的或获得的标记的和/或载体连接的靶分子或包含其的组合物用作药物。类似地，提供了一种治疗方法，其包括向患者施用有效量的通过本发明方法可获得或获得的标记的和/或载体连接的靶分子或包含其的组合物。优选地，靶分子选自酶、靶向蛋白例如抗体、细胞因子(例如g-csf)、转运蛋白例如用于脂肪酸转运的fabs、储存蛋白例如铁蛋白、机械支持蛋白如胶原蛋白、生长因子、激素如胰岛素或tsh、干扰素、糖蛋白、合成的工程化蛋白或其片段。[0239]本发明尤其还包括，当用作体内药物时，靶分子和/或标记物可以从包含靶分子的“产物配合物”中释放出来的实施方案，例如，在配合物与体内靶结构结合后释放。因此，通过本发明方法可获得的其上连接了标记物和/或载体的靶分子，可以被配置成允许标记物和/或靶分子可以被释放，优选在体内释放的形式。释放可通过产物配合物中金属阳离子的还原、ph值变化和/或通过靶分子和/或标记物与靶结构(例如受体或细胞表面蛋白，例如癌细胞特异性表面蛋白)的结合而触发。[0240]本发明尤其提供以下实施方案：[0241]1.一种配合物，其包含：[0242]a)金属阳离子；[0243]b)金属阳离子配体co32-或hco3-；和[0244]c)包含螯合配体和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0245]2.项目1的配合物，其中金属阳离子螯合域的螯合配体是包含一个或多个羧酸基团和/或一个或多个胺基团和/或一个多个芳族胺和/或磷酸根的多齿配体。[0246]3.项目1的配合物，其中c)的金属阳离子螯合域的螯合配体选自：[0247]次氮基三乙酸(nta)、亚氨基二乙酸(ida)、三(羧甲基)乙二胺(ted)、螯合肽如具有共有序列(ghhph)ng的肽，其中n＝1-3(参见seqidno：1至3)或cadystin、三氮杂环壬烷(tacn)、二亚乙基三胺-五乙酸盐(dtpa)、植物螯合素、羧甲基天冬氨酸(cma)、膦酸盐、单宁酸(ta)、卟啉、联吡啶胺(dpa)、植酸、次氮基丙酸二乙酸(npda),次氮基异丙酸二乙酸(nipda),n-(羟乙基)乙二胺三乙酸(hedta),1,4,7,10-四氮杂环十二烷-n,n',n",n"'-四乙酸(dota)、1,4,7-三(羧甲基)-10-(2'-羟丙基)-1,4,7,10-四氮杂环癸烷，1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(nota),1-(1,3-羧基-丙基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-4,7-二乙酸(nodaga),1,4,8,11-四氮杂环十四烷-n,n',n",n"'-四乙酸(teta)、乙二半胱氨酸、乙二胺四乙酸(edta)、1,2-二氨基环己烷-n,n,n',n'-四乙酸(dact)、双(氨基乙硫醇)羧酸、亚乙基双(氧亚乙基-次氮基)四乙酸(egta)、三亚乙基四胺-六乙酸(ttha)、1,4,7-三氮杂环壬烷次膦酸(trap)、脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)、嘌呤、嘧啶及其衍生物。[0248]4.项目1的配合物，其中c)的金属阳离子螯合域的螯合配体选自：次氮基三乙酸(nta)、亚氨基二乙酸(ida)、具有共有序列(ghhph)ng的螯合肽、二亚乙基三胺-五乙酸盐(dtpa)、次氮基丙酸二乙酸(npda)、次氮基异丙酸二乙酸(nipda)、乙二胺-四乙酸(edta)、亚乙基双(氧亚乙基-次氮基)四乙酸(egta)、羧甲基天冬氨酸(cma)及其衍生物。[0249]5.项目1的配合物，其中c)的金属阳离子螯合域的螯合配体包含或选自nta,ida及其衍生物。[0250]6.项目1至4中任一项的配合物，其中所述金属阳离子是过渡金属阳离子。[0251]7.项目1至5中任一项的配合物，其中所述配合物的金属阳离子是二价、三价或四价金属阳离子。[0252]8.项目1至6中任一项的配合物，其中所述金属阳离子是水配体交换速率为10-1s-1或更低，优选10-2s-1或更低的金属阳离子。[0253]9.项目1至7中任一项的配合物，其中金属阳离子选自：co3 ,cr3 ,rh3 ,ir3 ,pt2 ,pt4 ,ru2 ,ru3 ,la3 ,eu3 ,os2 ,pd4 ,mo3 ,fe3 ,ru3 ,gd3 ,tc3 ,re3 ,sm3 ,tb3 ,ce3 ,pr3 ,nd3 ,pm3 ,dy3 ,ho3 ,er3 ,tm3 ,yb3 ,v2 ,mn4 ,fe2 和lu3 。[0254]10.项目1至7中任一项的配合物，其中金属阳离子选自：co3 ,cr3 ,rh3 ,ir3 ,ir4 ,pt2 ,pt4 ,pd4 ,mo3 ,fe3 ,gd3 ,tb3 ,eu3 ,ru2 ,la3 ,ru3 ,re3 ,re4 ,v2 ,mn4 ,fe2 和os2 。[0255]11.项目1至7中任一项的配合物，其中金属阳离子是co3 。[0256]12.项目1至11中任一项的配合物，其中b)的金属阳离子配体是碳酸根co32-或碳酸氢根hco3-。[0257]13.项目1至12中任一项的配合物，其中所述配合物包含[co(iii)(nta)co3]2-,[co(iii)(nta)hco3]-配合物或其水合物，其中标记物和/或载体连接在nta上。[0258]14.项目1至13中任一项的配合物，其中所述标记物包含荧光团、诊断剂、靶向部分、治疗剂、peg分子、脂质、生物素和/或其衍生物、蛋白质、肽、毒素和/或选自硫醇、叠氮化物、炔烃、硝酮、四嗪和四唑的反应性基团。[0259]15.项目1至13中任一项的配合物，其中所述标记物包含或为荧光团。[0260]16.项目1至13中任一项的配合物，其中所述标记物包含或为生物素或其衍生物。[0261]17.项目1至13中任一项的配合物，其中所述载体是聚合物、水凝胶、微粒、纳米颗粒、球体(包括纳米球和微球)、珠子、量子点、辅基、或固体表面。[0262]18.项目1至17的配合物，其中金属阳离子螯合域包含螯合配体与标记物和/或载体之间的接头。[0263]19.一种组合物，其包含项目1至18中任一项所定义的配合物。[0264]20.项目1至18中任一项的配合物或项目19的组合物用于标记靶分子的用途，其中所述靶分子包含可交换配合物中的金属阳离子配体的蛋白质、肽或核酸，优选蛋白质或dna，甚至更优选地，其中所述靶分子在序列[hnsm]k中包含至少4个组氨酸残基或组氨酸样残基，其中h是组氨酸残基或组氨酸样残基，其中s是间隔氨基酸残基，其中n在每种情况下独立地为1至4，其中m在每种情况下独立地为0至6，并且其中k为2至6。[0265]21.项目1至18中任一项的配合物或项目19的组合物用于标记靶分子的用途，其中所述靶分子含有包含至少两个组氨酸残基的富含组氨酸的区域，其中所述富含组氨酸的区域由靶分子的三维折叠形成，该折叠使所述的至少两个组氨酸残基在空间上接近，其中所述的至少两个组氨酸残基具有0至5埃的距离并且在氨基酸序列中不连续。[0266]22a.项目21的用途，其中所述富含组氨酸的区域是抗体的fc区。[0267]22b.项目1至18中任一项的配合物或项目19的组合物用于将标记物和/或载体连接至抗体、其结构域(例如fc区)或其片段的用途。[0268]22c.项目22b的用途，其中所述标记物是毒素。[0269]23.项目1至18中任一项的配合物或项目19的组合物用于标记靶分子的用途，所述靶分子含有富含组氨酸样残基的区域，该区域在所述靶分子的三维折叠过程中当所述组氨酸样残基在空间上接近时产生，其中所述的至少两个组氨酸样残基具有0至5埃的距离并且在氨基酸序列中不连续。[0270]24.项目20、21或23的用途，其中所述靶分子是药物、诊断剂、研究剂、化妆品和/或用于环境处理(例如水处理)的蛋白质。[0271]25.项目20、21或23的用途，其中所述靶分子包含或者是肽或蛋白质。[0272]26.项目20、21、23、24或25的用途，其中所述靶分子包含或是酶、靶向蛋白例如抗体、细胞因子、转运蛋白例如用于脂肪酸转运的fabs、储存蛋白质如铁蛋白、机械支持蛋白如胶原蛋白、生长因子、激素如胰岛素或tsh、干扰素、糖蛋白、合成的工程化蛋白或其片段。[0273]27.项目20至26中任一项的用途，其中所述靶分子在n-末端、c-末端或在内部序列区域包含组氨酸残基或组氨酸样残基。[0274]28.项目20至26中任一项的用途，其中以his标签的形式包含所述组氨酸残基或组氨酸样残基，优选其中所述his标签由2至10个，优选4至8个，并且最优选6至8个连续残基组成。[0275]29.项目1至18中任一项的配合物或项目19的组合物用于生产药物、诊断剂和/或化妆品的用途。[0276]30.一种试剂盒，其包含：[0277]a)金属阳离子，优选项目5至11中任一项所定义的金属阳离子；[0278]b)金属阳离子配体co32-或hco3；和[0279]c)包含螯合配体和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域，优选项目2至4和14至18中任一项所定义的金属阳离子螯合域。[0280]31.生产项目1至18中任一项的配合物的方法，包括在溶液中温育：(i)金属阳离子；(ii)项目1b)中所定义的金属阳离子配体；(iii)项目1c)中所定义的金属阳离子螯合域。[0281]32.项目31的方法，还包括收集和/或纯化项目1至18中任一项的配合物。[0282]33.项目31或32的方法，其中金属阳离子螯合域是项目2至18中任一项所定义的金属阳离子螯合域。[0283]34.项目31至33中任一项所述的方法，其中所述金属阳离子为项目5至11中任一项所定义的金属阳离子。[0284]35.项目31至34中任一项所述的方法，其中所述金属阳离子为co3 ，其中所述金属阳离子结合配体为co32-或hco3-，且其中co3 和co32-或hco3-以具有抗衡离子的中性配合物的形式提供，例如以盐的形式提供，或以包含co3 和co32-或hco3-的带电荷配合物的形式提供。[0285]36.项目35的方法，其中所述中性配合物是三(碳酸根)合钴(iii)酸钠三水合物(na3[co(iii)(co3)3]*3h2o)或三(碳酸根)合钴(iii)酸钾三水合物(k3[co(iii)(co3)3]*3h2o)。[0286]37.项目31至36中任一项的方法，其中，在包含hco3-或co32-的缓冲液中进行温育，优选hco3-或co32-的浓度为至少1mm，优选至少10mm，最优选1m。[0287]38.一种将标记物和/或载体连接到靶分子的方法，包括将项目1至18中任一项的配合物或项目19的组合物与靶分子一起温育的步骤，其中所述靶分子是项目20至28中任一项所定义的靶分子。[0288]39.项目38的方法，其中该方法进一步包括回收和/或纯化其上连接了标记物和/或载体的靶分子的步骤。[0289]40.项目38或39的方法，其中该溶液的ph值为4.0至9.5，优选5.5至8.0。[0290]41.项目38至40中任一项的方法，其中温育进行至少10秒，优选1分钟，最优选10分钟。[0291]42.项目38至41中任一项的方法，其中在0至95℃之间，优选0至60℃之间，最优选0至42℃之间的温度下进行温育。[0292]43.项目38至42中任一项的方法，其中该方法进一步包括，在温育之前在包含hco3-或co32-的溶液中洗涤本发明的配合物，优选hco3-或co32-的浓度为至少1mm，优选10mm，最优选1m，和/或其中在包含hco3-或co32-的溶液中进行温育，优选hco3-或co32-的浓度为至少1mm，优选10mm，最优选1m。[0293]44.项目38至43中任一项的方法，其中所述温育在水或水溶液中进行。[0294]45.项目38至44中任一项的方法，其中在包含一种或多种选自下组的有机溶剂的溶液中进行温育：dmso、dmf、dms、乙腈和异丙醇。[0295]46.项目38至45中任一项的方法，其中温育在包含一种或多种good氏缓冲物质，tris、磷酸盐和/或碳酸盐/碳酸氢盐的水溶液中进行。[0296]在该项目的一个实施方案中，缓冲液可以是pbs。[0297]47.项目38至46中任一项的方法，其中在ca2 存在下进行温育，优选ca2 以cacl2的形式提供。[0298]48.项目38至47中任一项的方法，其中在包含一种或多种缓冲物质的水溶液中进行温育，其中所述(一种或多种)缓冲物质不包含胺、羧酸、芳族胺和/或磷酸基团。[0299]49.项目38至48中任一项的方法，其中在包含一种或多种选自以下的缓冲物质的水溶液中进行温育：aces、ampso、bes、bistris、bistris丙烷、硼酸盐、caps、capso、ches、dipso、epps、hepes、hepbs、heppso、mes、mops、mopso、pipes、popso、taps、tapso、tea、tes、碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液、磷酸盐缓冲液(例如pbs)和tris。[0300]50.项目38至49中任一项的方法，其中在含有一种或多种选自以下的缓冲物质的水溶液中进行温育：bistris、caps、capso、hepes、hepbs、heppsomes、mops、mopso、pipes、taps、tes、磷酸盐缓冲液(例如pbs)和tris。[0301]51.项目38至50中任一项的方法，其中在包含选自以下的缓冲物质的水溶液中进行温育：bis-tris、mes、hepes和pipes。[0302]52.项目38至51中任一项的方法，其中该方法不涉及在标记物和/或载体存在下的氧化步骤，例如用h2o2处理。[0303]53.一种标记的或载体连接的靶分子，其可通过项目38至52中任一项所定义的方法获得。[0304]54.一种组合物，包含项目53的标记的或载体连接的靶分子。[0305]55.项目53的标记的或载体连接的靶分子或项目54的组合物作为研究试剂的用途。[0306]56.项目53的标记的或载体连接的靶分子或项目54的组合物用作药物。[0307]本发明的“配合物”是指由金属阳离子和配体形成的配合物。因此，术语配合物优选涉及配位配合物或金属配合物。配合物包含金属阳离子形式的路易斯酸和一个或多个配体形式的一个或多个路易斯碱。本发明的配合物具有至少两个如本文别处定义的配体。[0308]如本文所用，术语“蛋白质”和“肽”均涉及由氨基酸组成的多肽。术语“肽”是指具有20个或更少氨基酸的多肽。术语“蛋白质”是指具有超过20个氨基酸的多肽。术语多肽包括“肽”和“蛋白质”。在本文中提及“蛋白质或肽”时，也包括多肽。[0309]如本文所用，“抗体”是可以特异性或选择性结合靶蛋白的任何分子。抗体可以包括或可以是抗体或其部分/片段，其中部分/片段显示与全长抗体基本相同的结合活性。抗体还可包括多价分子、多特异性分子(例如，diabody)、融合分子、aptimer、avimer或其他天然存在或重组产生的分子。可用于本发明的示例性抗体包括抗体样分子。抗体样分子是可以通过与靶分子结合而表现出功能的分子(参见，例如currentopinioninbiotechnology2006,17:653-658；currentopinioninbiotechnology2007,18:1-10；currentopinioninstructuralbiology1997,7:463-469；proteinscience2006,15:14-27)，并且包括，例如，darpins(wo2002/020565)、affibody(wo1995/001937)、avimer(wo20011/wo2005/040229)、adnectin(wo2002/032925)和fynomers(wo2013/135588)。一般而言，术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于，单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全人抗体和抗体片段等，只要它们表现出所需的抗原结合活性。本发明中的抗体还可以是嵌合抗体、重组抗体、重组抗体的抗原结合片段，或人源化抗体。[0310]术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指非完整抗体的分子，其包含完整抗体的一部分并结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于fv、fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2；diabody；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；和由抗体形成的多特异性抗体。[0311]术语“配体”是指以某种方式与另一种物质相互作用的物质。在本发明的上下文中，当在配合物的上下文中使用时，“配体”是指包含能够与路易斯酸形成配位键的路易斯碱的分子。在其他实例中，配体是一种物质，通常是有机的，其包含可以与金属离子形成配位键的基团。配体，当与金属离子配位时，可具有本领域技术人员已知的多种结合模式，包括例如末端(即，与单个金属离子结合)和桥连(即，路易斯碱的一个原子与不止一个金属离子结合)。[0312]术语“路易斯酸”和“路易斯酸的”是本领域公认的，是指可以接受来自如上定义的路易斯碱的一对电子的化学部分。[0313]术语“路易斯碱”和“路易斯碱的”通常是指在某些反应条件下能够提供一对电子的化学部分。根据路易斯碱和金属离子的身份，路易斯碱可以具有在某些配合物中提供单电子的特征，但对于大多数目的而言，优选将路易斯碱理解为双电子供体。路易斯碱性部分的实例包括，不带电荷的化合物，例如醇、硫醇和胺，以及带电荷的部分，例如醇盐、硫醇盐、碳负离子和各种其他有机阴离子。在某些实例中，路易斯碱可由单个原子组成，例如氧化物。[0314]术语“配位”或“配位的”是指配体和金属阳离子之间的相互作用。[0315]本发明上下文中的术语“诊断物”或“诊断剂”涉及诊断类型的试剂。非限制性实例是可随后使用正电子发射断层扫描(pet)或单光子发射计算机断层扫描(spect)成像或本领域技术人员已知的其他方法检测的放射性核苷酸、可通过本领域已知的方法检测的荧光部分和酶活性部分。诊断剂还可以包括包含与其相连的放射性核苷酸、荧光团或酶的抗体。[0316]术语“药物”涉及任何治疗性或预防性物质，包括但不限于小分子、生物药(例如抗体)。一种优选的药物是抗体。[0317]本发明通过以下附图和实施例举例说明。[0318]附图简述:[0319]图1：[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物的化学反应性。[0320]在co2 和co3 配合物中心具有固定化的his6-gfp(seqidno:14)的nta珠，与不同的螯合剂以及还原剂和250mm咪唑的组合一起温育，并测量洗脱的his6-gfp的量。由于co3 中心的动力学惰性，当以[co(iii)(nta)(his6-gfp)]的形式固定在珠子上时，his6-gfp几乎不会被洗脱。图改编自wegnerandspatz,2013(wegnerandspatz,2013)。[0321]图2：通过[co(iii)(nta)]化学标记his标签蛋白的方法示意图。[0322]按wegner&spatz(wegnerandspatz)于2013年公布的，通过氧化预先形成的[co(ii)(nta)(his-蛋白)]配合物形成[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物。nta预先加载co2 离子(来自co(ii)cl2)并与带有his标签的蛋白质一起温育。最后，通过用20mmh2o2氧化整个蛋白质配合物1小时，将co2 中心转化为co3 。然而，这种方法有一个主要缺点，即，氧化步骤会影响所缀合蛋白的功能和稳定性。此外，连接到nta部分的缀合物也会受到氧化过程的影响。[0323]b按照zatloukalová和kucerova于2006年发表的(zatloukalova和kucerova，2006)，通过氧化预先形成的[co(ii)(ida)(h2o)3]配合物形成[co(iii)(ida)(his-蛋白)]配合物。ida预加载co2 离子(来自co(ii)cl2)，通过用20mmh2o2.氧化[co(ii)(ida)(h2o)3]配合物1小时，将co2 中心转化为co3 。随后，[co(iii)(ida)(h2o)3] 配合物与带有his标签的蛋白质一起温育。由于配合物形成非常缓慢且结合效力低，该方案具有局限性。此外，连接到ida部分的缀合物也会受到氧化过程的影响。[0324]c使用钴(iii)碳酸盐形成[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物。nta预载来自钴(iii)碳酸盐(例如na3[co(iii)(co3)3]*3h2o)的co3 离子，以形成本发明的配合物。然后将配合物与带有his标签的蛋白质一起温育。该方案是用于缀合his标签蛋白质的一个非常简单的工作流程，该缀合可以在温和的反应条件下进行。由于反应可以在生理缓冲条件下连续进行，因此蛋白质和nta缀合物(即,标记物(例如荧光团)和/或载体)的功能可以得到完全保留。此外，与方案b中的两个水配体相比，碳酸根配体允许更快、更有效的蛋白质结合。[0325]d使用铂(iv)硝酸盐形成[pt(iv)(nta)(his-蛋白)]配合物。nta预载来自硝酸铂(iv)溶液的pt4 离子以形成本发明的配合物。然后将配合物与带有his标签的蛋白质一起温育。该方案是用于缀合his标签蛋白质的一个非常简单的工作流程，可以在温和的反应条件下进行。与方案b中的两个水配体相比，硝酸根配体允许更快和更有效的蛋白质结合。[0326]图3：用过氧化氢氧化荧光团。将不同的荧光团与0.05％h2o2温育约21小时，之后与1％h2o2温育。每15(0.05％h2o2)到30(1％h2o2)分钟测量一次荧光团的荧光。在h2o2处理期间，所有荧光团都显示出荧光强度的降低，说明使用h2o2的氧化步骤会干扰标记物的功能和稳定性。[0327]图4：通过h2o2在钴氧化过程中引起的蛋白质降解和his标签断裂。his标签蛋白(3,3μm)在有或没有66μmcocl2和20mmh2o2的情况下温育1小时。使用与辣根过氧化物酶偶联的α-his6-标签-抗体(克隆h-3)通过蛋白质印迹分析了蛋白质稳定性和his-标签断裂。在暴露于钴和h2o2后，蛋白质自发地显示出部分降解迹象以及his标签的断裂。所示图像上的凝胶泳道源自相同的凝胶/膜。[0328]图5：nta及其钴配合物的1h-nmr谱。[0329]anta的1h-nmr测量显示在～3.6ppm的峰，这与使用软件nmrpredict(https://www.nmrdb.org/new_predictor/index.shtml？v＝v2.103.0；2019年4月版)，参见banfiandpatiny,2008；castilloetal.2011；aires-de-sousaetal.2002)以insilco方式产生的谱相符。b当nta与co2 和d2o配合形成[co(ii)(nta)(d2o)2]-(用cocl2*6h2o合成)时，峰从～3.6ppm位移到～3.8ppm。c d当用na3[co(iii)(co3)3]*3h2o(c)或k3[co(iii)(co3)3]*3h2o(d)产生配合物时，峰进一步位移到～1.9ppm，表明存在期望的碳酸根配合物[co(iii)(nta)(co3)]2-。所有ppm位移均相对于在4.7ppm的剩余h2o的峰进行归一化。[0330]图6：通过[co(iii)(nta)(co3)]2-获得的[co(iii)(nta)(his6-percevalhr)]配合物的稳定性。在ni2 和co3 配合物中心(后者由na3[co(iii)(co3)3]*3h2o产生)具有固定化的his6-percevalhr(seqidno:15)的nta珠，用pbs或咪唑(250mm)洗涤，然后保留在珠子上的his6-percevalhr量通过荧光测量来确定。通过[co(iii)(co3)3]盐产生的[co(iii)(nta)(his6-percevalhr)]配合物由此在咪唑中显示出与通过h2o2氧化过程形成的配合物相似的化学稳定性(与图1相比)。误差线： /-sd；p值：《0.001：***；《0.01：**；《0.05：*；≥0.05：不显著。[0331]图7：蛋白质与[co(iii)(nta)]配合物的结合。[0332]用[ni(ii)(nta)(h2o)2]-,[co(iii)(nta)(h2o)2]或[co(iii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖珠与his6-gfp(seqidno:14)一起温育。[0333]a在不同时间点通过荧光测量上清液，确定剩余的未结合蛋白。结合碳酸根分子的[co(iii)(nta)]配合物结合蛋白质的速度，显著地快于结合水分子的[co(iii)(nta)]配合物。[0334]b温育312小时后，用缓冲液或250mm咪唑洗涤珠子，并通过荧光测量确定珠子上保留的his6-gfp量。所有[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物在咪唑中都显示出类似的化学稳定性。然而，用[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物官能化的珠子比预装[co(iii)(nta)(h2o)2]的珠子结合显著更多的蛋白质。误差线： /-sd；p值：《0.001：***；《0.01：**；《0.05：*；≥0.05：不显著[0335]图8：缓冲物质对蛋白质结合的影响。[0336]a b：用[co(iii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖珠在不同的缓冲液中与his6-gfp(seqidno:14)一起温育。不同时间点上通过上清液的荧光测量来确定剩余的未结合蛋白。在基于mes和bis-tris的缓冲溶液中，与基于tris的缓冲液相比，配合物的形成速度更快，并且与基于tris和hepes的缓冲液相比，也更有效。图b是图a在实验开始后的0和3小时的时间点的放大图。误差线： /-sd。[0337]图9：[co(iii)(nta)(co3)]2-和[co(iii)(nta)(h2o)2]的uv-vis光谱[0338][co(iii)(nta)(co3)]2-和[co(iii)(nta)(h2o)2]在室温下水溶液中的可见吸收光谱。[co(iii)(nta)(co3)]2-通过将nta与na3[co(iii)(co3)3]*3h2o一起温育而产生，并且[co(iii)(nta)(h2o)2]通过以下方法产生：用h2o2氧化通过nta与co(ii)cl2*6h2o温育而形成的[co(ii)(nta)(h2o)2]配合物。两个最大值中每一个的峰位移表明[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物中存在碳酸根配体。[0339]图10：co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的形成和稳定性取决于na3[co(iii)(co3)3]*3h2o与nta的温育时间和温度[0340]nta官能化的琼脂糖珠在4℃(a),25℃(b)和70℃(c)温育不同的时间段。随后，将得到的[coiii)(nta)(co3)]2-配合物与his6-gfp温育48小时。最终[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性通过使用基于hepes的缓冲液或在缓冲液中的250mm咪唑进行严格洗涤来测试。固定在珠子上的蛋白质量通过bca测定法确定。随着na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的增加，当蛋白质随后在25℃温育48小时后，稳定配合物的百分比以及珠子上固定的his6-gfp增加。随着温度升高，更早达到固定的蛋白的饱和。误差线： /-sd[0341]图11：[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的形成和稳定性取决于[co(iii)(nta)(co3)]2-与his6-gfp的温育时间和温度[0342][coiii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖磁珠在4、25和37℃下温育不同时间段，最终[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性通过使用蛋白质结合缓冲液或在缓冲液中的250mm咪唑进行严格洗涤来测试。基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，确定固定在珠上的蛋白质量。a基于其相对荧光，在咪唑处理后固定在珠上的his-gfp。随着蛋白质温育时间越长，更多的蛋白质可以固定在珠子上，在3.5小时时开始达到饱和平台。没有观察到蛋白质温育温度对最终配合物的产量的影响。b与缓冲液洗涤相比，咪唑处理后固定在珠子上的his-gfp的百分比。所有产生的配合物都表现出对250mm咪唑处理的高稳定性。误差线： /-sd[0343]图12：使用k3[co(iii)(co3)3]*3h2o的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物形成和稳定性[0344]nta官能化的琼脂糖磁珠与k3[co(iii)(co3)3]*3h2o温育指定时间，然后将his6-gfp与产生的[coiii)(nta)(co3)]2-配合物温育。最终[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性通过用蛋白质缓冲液(“缓冲液”)或在缓冲液中的250mm咪唑(“咪唑”)严格洗涤来测试。基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，确定固定在珠上的蛋白质量。通过k3[co(iii)(co3)3]*3h2o产生的[coiii)(nta)(co3)]2-配合物也可以与his-gfp配位形成稳定的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物。误差线： /-sd；p值：《0.001：***；《0.01：**；《0.05：*；≥0.05：不显著[0345]图13：使用10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育在不同缓冲系统中[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的形成及其配合物稳定性[0346]在10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间后，[(coiii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖磁珠与his6-gfp在不同缓冲系统中温育不同的时间段。最终[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性通过用缓冲溶液(“缓冲液”)和在缓冲液中的250mm咪唑(“咪唑”)严格洗涤来测试。基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，确定固定在珠上的蛋白质量。a咪唑处理后固定在珠子上的蛋白质量；b在15分钟蛋白质温育后在咪唑处理前后固定在珠子上的his-gfp。所有蛋白质结合缓冲系统都可以形成稳定的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物，但结合蛋白质的效率和最终配合物的稳定性百分比各不相同。误差线： /-sd[0347]图14：使用48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育在不同缓冲系统中[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的形成及其配合物稳定性[0348]在48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育后，[coiii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖磁珠与his6-gfp在不同缓冲系统中温育不同的时间段。最终[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性通过使用分析缓冲液(“缓冲液”)或在分析缓冲液中的250mm咪唑(“咪唑”)进行严格洗涤来测试。基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，确定固定在珠上的蛋白质量。a咪唑处理后固定在珠子上的蛋白质量；b-e在1分钟(b)、15分钟(c)、1小时(d)或24小时(e)蛋白质温育后，使用或不使用咪唑处理，固定在珠子上的his-gfp。所有蛋白质结合缓冲系统都可以形成稳定的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物，但结合蛋白质的效率各不相同。误差线： /-sd[0349]图15：在不同ph值下[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的形成及其配合物稳定性[0350]在48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育后，[coiii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖磁珠与his6-gfp在基于bistris-或hepes的缓冲系统中在不同ph值温育不同的时间段。最终[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性通过使用分析缓冲液(“缓冲液”)或在分析缓冲液中的250mm咪唑(“咪唑”)进行严格洗涤来测试。基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，确定固定在珠上的蛋白质量。a咪唑处理后固定在珠子上的蛋白质量；b15分钟蛋白质温育后，使用或不使用咪唑处理，固定在珠子上的his-gfp。在所有ph值下都可以形成稳定的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物，但结合蛋白的效率不同。因此，效率随着蛋白质温育和蛋白质温育期间ph值的降低而增加。误差线： /-sd[0351]图16：通过[co(iii)(nta)(co3)]2-稳定固定具有his标签或富组氨酸区域的不同蛋白质[0352][co(iii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖磁珠与his-gfp、his-蛋白a、his-分选酶、his-人血清白蛋白或抗gfp小鼠igg1一起温育，最终[co(iii)(nta)(蛋白)]配合物的稳定性通过使用蛋白质结合缓冲液或在缓冲液中的250mm咪唑进行严格洗涤来测试。a蛋白质与[co(iii)(nta)(co3)]2-温育后蛋白质上清液的sds-page。分子量标记：200、150、100、75、50、37、25kda。泳道1、4、7、10和13：[co(iii)(nta)(co3)]2-温育后剩余的蛋白质。泳道2、5、8、11和14：[ni(ii)(nta)(h2o)2]-温育后剩余的蛋白质。泳道3、6、9、12和15：nta温育后剩余的蛋白质。泳道1-3：his-gfp，泳道4-6：his-蛋白a，泳道7-9：his-分选酶，泳道10-12：his-hsa，泳道13-15：抗gfp小鼠igg1。除了his-蛋白a(为高百分比)外，所有蛋白质都可以在蛋白质温育后从上清液中清除。b咪唑处理后通过bca测定法测定的珠子上的蛋白质量。所有蛋白质都可以实现稳定的[co(iii)(nta)(蛋白)]配合物形成。c使用520分选酶a活性测定试剂盒，荧光计量测定的咪唑处理前后固定的分选酶的活性。固定后分选酶仍然有活性，形成的[co(iii)(nta)(his-分选酶)]配合物可以抵抗250mm咪唑的处理。d e与固定在nta(d)或ida(e)官能化珠上的抗gfp小鼠igg1结合的gfp，基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)确定。通过gfp结合证明，固定的抗体仍具有功能。[0353]图17：ida和talon作为金属结合域。分别通过[co(iii)(ida)(co3)]-或[co(iii)(talon)(co3)]配合物产生的a[co(iii)(ida)(his-gfp)]和b[co(iii)(talon)(his-gfp)]配合物的形成和化学稳定性。na3[co(iii)(co3)3]*3h2o和之后his6-gfp蛋白的温育时间在括号中给出(na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/蛋白质温育时间)。通过使用基于hepes的缓冲液或在缓冲液中的250mm咪唑进行严格洗涤来测试化学稳定性。基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，测量固定在珠上的蛋白质量。与没有金属处理的珠子相比，使用[co(iii)(ida/talon)(co3)]2-配合物，化学稳定地固定在珠子上的his6-蛋白质显著更多。因此，与四齿talon配合物相比，具有三齿金属结合域ida的配合物的化学稳定性急剧增加。误差线： /-sd；p值：《0.001：***；《0.01：**；《0.05：*；≥0.05：不显著。[0354]图18：[co(iii)(ida)(his-蛋白)]配合物的化学反应性。[0355]用[co(iii)(ida)(his6-gfp)]配合物官能化的珠子在不同条件下温育，所述条件包括螯合剂或还原剂与250mm咪唑的组合，在珠子上保留的his-gfp量通过珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)测量。由于co3 中心的动力学惰性，his6-gfp几乎不被洗脱，表明所产生的[co(iii)(ida)(his-蛋白)]配合物的高稳定性。误差线： /-sd[0356]图19：his6-gfp与[co(iii)(ida)(co3)]-和[co(iii)(ida)(h2o)2] 的固定效率[0357]在a3小时和b24小时his6-gfp温育后，通过磁珠上co(iii)(ida)(co3)]-或[co(iii)(ida)(h2o)2] 配合物产生的[co(iii)(ida)(his-gfp)]的配合物形成效率和化学稳定性。co(iii)(ida)(co3)]-配合物通过将ida官能化的磁珠与na3[co(iii)(co3)3]*3h2o温育指定时间(10分钟或48小时)而产生。通过使用基于hepes的缓冲液或在缓冲液中的250mm咪唑进行严格洗涤来测试化学稳定性。基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，测量固定在珠上的蛋白质量。与用[co(iii)(ida)(h2o)2] 配合物官能化的珠子相比，使用10minna3[co(iii)(co3)3]*3h2o温育制备的[co(iii)(ida)(co3)]-配合物，有显著更多的his6-蛋白化学稳定地固定在珠子上。在24小时蛋白质温育时间后，用48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o温育制备的[co(iii)(ida)(co3)]-配合物优于[co(iii)(ida)(h2o)2] 配合物。所有[co(iii)(ida)(his-gfp)]配合物均表现出对咪唑的高化学稳定性。误差线： /-sd；p值：《0.001：***；《0.01：**；《0.05：*；≥0.05：不显著[0358]图20：相对于氧气处理[co(ii)(金属结合域)(his-gfp)]，通过[co(iii)(ida/nta)(co3)]形成[co(iii)(ida/nta)(his-gfp)]化学稳定配合物。通过[co(iii)(金属结合域)(co3)]2-配合物(na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/蛋白温育时间)，或通过用氧气(8小时)或过氧化氢(20mm，1小时)处理氧化[co(ii)(金属结合域)(his-gfp)]，在磁珠上产生的a[co(iii)(ida)(his-gfp)]或b[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的化学稳定性，用基于hepes的缓冲液或在缓冲液中的250mm咪唑处理，以进行攻击。基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，测量固定在珠上的蛋白质量。与8小时氧气处理[co(ii)(金属结合域)(his-gfp))]相比，使用[co(iii)(金属结合域)(co3)]配合物在珠子上化学稳定地固定了显著更多的his6-蛋白。误差线： /-sd；p值：《0.001：***；《0.01：**；《0.05：*；≥0.05：不显著[0359]图21：在表面上形成[co(iii)(hs-peg-nta)(his-gfp)]配合物[0360]his-gfp通过[co(iii)(hs-peg-nta(co3)]2-配合物固定在金纳米结构的玻璃表面。纳米结构金点通过巯基-peg-nta官能化，然后与na3[co(iii)(co3)3]*3h2o温育以形成[co(iii)(hs-peg-nta(co3)]2-配合物，随后通过形成[co(iii)(hs-peg-nta)(his-gfp)]配合物，将his6-gfp固定在配合物上。金点之间所有表面都用短peg层钝化，以避免与玻璃表面的非特异性蛋白质相互作用。基于表面上的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)确认gfp固定在表面上，确定了固定化的his-gfp量。“仅peg”：钝化的表面；“peg/gfp”：与his-gfp温育的钝化表面；“无金属”：用硫醇-peg-nta和his-gfp温育的钝化表面；“[co(iii)(nta)(his-gfp)]”：用硫醇-peg-nta、na3[co(iii)(co3)3]*3h2o和his-gfp温育的钝化表面。[0361]图22：在溶液中形成[co(iii)(nta-x-生物素)(his-gfp)]配合物[0362]his-gfp通过[(coiii)(nta-x-生物素)(co3)]配合物与生物素部分偶联，其中通过温育na3[co(iii)(co3)3]*3h2o与nta-x-生物素产生[(coiii)(nta-x-生物素)(co3)]配合物，之后his-gfp与所得配合物温育不同的温育时间。最终的配合物通过生物素-链霉亲和素相互作用，固定在用链霉亲和素官能化的珠子上。根据珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，确定固定的蛋白的量作为生物素化蛋白的量度。a[co(iii)(nta-x-生物素)(his-gfp)]配合物在10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta-x-生物素和30分钟[coiii)(nta-x-)(co3)]/his-gfp温育后产生，固定在链霉亲和素珠上。对于所有的na3[co(iii)(co3)3]*3h2o与nta比率，显著量的his-gfp可以被生物素化并固定在珠子上。较高的na3[co(iii)(co3)3]*3h2o比率导致标记率增加。b[co(iii)(nta-x-生物素)(his-gfp)]配合物在10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta-x-生物素和30分钟或48小时[coiii)(nta-x-生物素)(co3)]/his-gfp温育后产生，固定在链霉亲和素珠上，然后用在缓冲液中的250mm咪唑严格洗涤。随着蛋白质温育时间的增加，固定化并因此化学稳定的配合物的量增加。误差线： /-sd；p值：《0.001：***；《0.01：**；《0.05：*；≥0.05：不显著[0363]图23：his6-gfp固定在[pt(iv)(nta)(no3)]官能化珠上[0364]nta官能化的琼脂糖珠与硝酸铂(iv)温育10分钟，然后与his6-gfp温育30分钟。形成的[pt(iv)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性用250mm咪唑攻击，珠子上的固定蛋白通过bca测定来确定。可以证明通过[pt(iv)(nta)(no3)]配合物稳定固定了显著量的蛋白质。此外，金属结合配体硝酸根的使用，允许容易和快速的蛋白质与配合物结合。误差线： /-sd；p值：《0.001：***；《0.01：**；《0.05：*；≥0.05：不显著实施例:[0365]实施例1：比较[co(ii)(nta)(his6-gfp)]和[co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0366]将具有固定的[co(ii)(nta)(his6-gfp)]和[co(iii)(nta)(his6-gfp)]的珠子等分试样，与强螯合剂或与广泛使用的还原剂和250mm咪唑的组合，一起温育，以证明基于co3 的配合物在化学稳定性方面优于常用的基于ni2 或co2 的配合物。[0367]his6-gfp(seqidno:14)使用质粒pethis6gfptevlic(addgene#29663)(pedelacqetal.2006)在大肠杆菌bl21(de3)中表达，并如wegner和spatz(wegnerandspatz,2013)所述，通过ni2 -nta-珠纯化。[0368]ni2 -nta琼脂糖树脂(novagen)，1)用9个珠体积的ddh2o洗涤，2)用3个珠体积的0.1medtaph7.5洗涤，3)用9个珠体积的缓冲液a(50mmtris-hclph7.4，300mmnacl)洗涤三次,4)用1.5个珠体积的0.1mcocl2*6h2o洗涤，5)用9个珠体积的缓冲液b(含250mm咪唑的缓冲液a)洗涤，和6)用9个珠体积的缓冲液a洗涤三次。最后，通过在缓冲液a中的一个珠体积的10μmhis6-gfp中温育，将his6-gfp加载到珠上。在每个步骤之间，珠浆在300g离心1分钟，滗析上清液。为了获得[co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物，将带有固定在co2 -nta上的his6-gfp的珠子，在室温下在含有20mmh2o2的缓冲液a中温育1小时(之后用作含co2 的对照的珠子，在不含h2o2的缓冲液a中温育)。随后，在用缓冲液a洗涤珠子几次后，将珠子重新悬浮在2个珠体积的缓冲液a中，并分配为150μl等分试样用于稳定性实验。最后，将50μl每种测试试剂(最终浓度：螯合剂：250mm咪唑、25mmnta、25mmedta；还原剂(半胱胺、dtt、tcep、抗坏血酸盐)：1mm补充有250mm咪唑)加入等分试样。在室温下温育1小时后，使用读板器(tecan，infinite2000)分析100μl上清液的gfp荧光(λex＝480nm,λem＝510nm)。所有实验一式两份进行。[0369]如图1所示，当his6-gfp与co3 中心结合时，在与测试的螯合剂或还原剂一起温育后，仅观察到非常少量的洗脱蛋白质。相比之下，与co2 珠子结合的his6-gfp在相同条件下被完全洗脱。因此，[co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物对强螯合剂的破坏和还原为co2 都是惰性的。[0370]实施例2：过氧化氢氧化荧光团[0371]如在实施例1描述的方法中以及如先前在现有技术中描述(参见wegner和spatz，2013),使用h2o2将co2 氧化成co3 ，不仅损害所连接的蛋白质，而且也对nta-缀合物例如标记物或载体的功能性产生负面影响。例如，几种荧光团的荧光在h2o2氧化后降低，如下所示。[0372]荧光团缀合物在磷酸盐缓冲盐水(pbs)(thermo；18912014)中稀释(最终浓度：5μg/ml荧光素(riedeldehaen；28802)；185μg/mlalexa488偶联的抗体(invitrogen；a11039/ml)；9μg/mlfitc偶联的抗体(thermo；ma1-81891)；5μmatto488偶联的ni2 -nta(sigma；39625))，在黑色96孔板中100μl每种荧光团溶液与0.05％h2o2温育约21小时，然后在1％h2o2中再温育22小时。在读板器(tecan；spark)上每15分钟(0.05％h2o2)或30分钟(1％h2o2)测量一次荧光强度(λex＝490nm,λem＝535nm)。[0373]图3中描绘的荧光测量值表明，所有分析的荧光团在与h2o2温育后都显示了荧光强度的明显降低。[0374]实施例3：在h2o2氧化钴期间的蛋白质降解和his标签断裂[0375]如实施例1描述的方法中以及wegner和spatz(wegner和spatz2013)先前描述的，使用h2o2将co2 氧化成co3 ，这可自发地引发芬顿样反应(hanna,kadiiska等，1992)，导致蛋白质降解和组氨酸残基的断裂(davies1987,stadtman1990)，如在抗his标签的蛋白质印迹中所证实。[0376]使用质粒prsetb-percevalhr(addgene#49081)(tantamaetal.2013)在大肠杆菌dh5α中表达荧光蛋白percevalhr(seqidno:15)，并通过ni2 -nta柱纯化，如(tantama等人，2013年)中描述。[0377]3.3μm带his7标签的percevalhr蛋白与33μmcocl2*6h2o在蛋白质缓冲液(50mmtrisph7.4，150mmnacl)中混合，并在室温下温育2分钟。随后，加入20mmh2o2并将混合物在21℃温育1.5小时。对于不含钴和/或h2o2的对照样品，使用等体积的蛋白质缓冲液。最后，用33mmedtaph8.0淬灭反应。[0378]对于蛋白质印迹分析，将蛋白质样品与sds样品缓冲液(25mmtris-hclph6.8、192mm甘氨酸、0.1％(w/v)sds、0.002％(w/v)溴酚蓝、100mmdtt(最终浓度))混合，在70℃变性10分钟，然后将84pmol蛋白质加载到sds-page凝胶上(7％(w/v)丙烯酰胺-双丙烯酰胺(37.5:1)，375mmtris-hclph8.8，0.1％(w/v)sds，0.1(w/v)过硫酸铵，0.1％(v/v)temed；运行条件：120v恒定，laemmli运行缓冲液(25mmtris-hclph8.8，192mm甘氨酸，0.1％(w/v)sds))。蛋白质分离后，将蛋白质印迹在硝酸纤维素膜(whatman,10401196)上，并在室温下用tbs-t(20mmtris-hclph7.5，150mmnacl，0.1％(v/v)tween20)洗涤膜5分钟，然后在室温下用tbs-t中的5％(w/v)牛血清白蛋白封闭1小时。最后，将膜与200ng/ml辣根过氧化物酶标记的抗his-标签抗体(克隆h-3)(santacruz，sc-8036hrp)一起温育，用tbs-t洗涤三次10分钟，并在基于鲁米诺的增强型化学发光辣根过氧化物酶(hrp)底物溶液(thermo,34076)中室温温育5分钟。使用las3000系统(fujifilm)检测来自带有his标签的蛋白质的化学发光信号。[0379]图4中的蛋白质印迹表明，蛋白质与钴以及h2o2组合温育后，可发生蛋白质降解以及自发的his标签断裂，如弥散性的低强度蛋白质条带所示。[0380]实施例4：[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物的合成[0381]为了完全避免使用h2o2，开发了一种使用co(iii)碳酸盐(例如na3[co(iii)(co3)3]*3h2o和k3[co(iii)(co3)3]*3h2o)的新方法，用于形成[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物。该配合物形成过程如图2c示意性显示。在第一步中，所述co(iii)盐与nta一起温育以形成[co(iii)(nta)co3]2-。应用质子核磁共振谱(1h-nmr)来证明[co(iii)(nta)co3]2-配合物的成功形成。[0382]三(碳酸根)合钴(iii)酸钠三水合物的合成[0383]三(碳酸根)合钴(iii)酸钠三水合物(na3[co(iii)(co3)3]*3h2o)，如bauer和drinkard(baueranddrinkard1960)所述合成。简而言之，将在50mlddh2o中的0.1摩尔(29.1克)co(ii)(no3)*6h2o(sigma；1.02554)和10ml30％过氧化氢(riedel-dehaen；18312)的混合物，在搅拌下逐滴加入0.5摩尔(＝42.0克)碳酸氢钠(merck；1.06329)在50mlddh2o中的冰冷浆液。将混合物在冰上温育并持续搅拌1小时。随后，将橄榄色产物过滤并分别用冷水、无水乙醇和无水乙醚洗涤三次。最后，将产物在真空下干燥过夜并在-20℃氮气气氛中储存。[0384]三(碳酸根)合钴(iii)酸钾三水合物的合成[0385]按照shibata的描述(shibata1983；改编自mori等人，1956)，在溶液中合成了三(碳酸根)合钴(iii)酸钾三水合物(k3[co(iii)(co3)3]*3h2o)。简而言之，将在24mlddh2o中的0.1摩尔(24g)co(ii)cl2*6h2o(honeywell；255599)和40ml30％过氧化氢的混合物，在搅拌下逐滴加入到0.7摩尔(70g)碳酸氢钾(honeywell；237205)在70mlddh2o中的冰冷浆液中。随后，将所得绿色溶液抽滤并直接用于后续实验。[0386]制备[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物[0387]为了从钠盐产生[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物，将580μmole(210mg)na3[co(iii)(co3)3]*3h2o添加到2ml在ddh2o中的1m碳酸氢钠和2m次氮基三乙酸三钠盐(sigma；n0253)中，将浆液超声处理30分钟。在70℃温育72小时后，将3ml的1m碳酸氢钠添加到现在呈粉红色的浆液中，并将混合物在70℃超声处理2小时。随后，将紫色上清液进行nmr分析。对于由钾盐制备的配合物，k3[co(iii)(co3)3]*3h2o在溶液中由0.1摩尔cocl2*6h2o合成(见上文)，随后加入0.1摩尔次氮基三乙酸三钠盐(25.7克)和60mlddh2o，如(shibata1983)中所述。在60℃连续搅拌温育3小时后，过滤所得紫色溶液，并用乙酸水溶液将ph值调节至7.3。最后，将溶液在4℃温育过夜，澄清除去白色沉淀并进行nmr分析。为了获得配合物[co(ii)(nta)(d2o)]-，在d2o中从储备溶液制备5mm次氮基三乙酸(sigma；72559)和5mmcocl2*6h2o的混合物，并在室温下温育15分钟，之后进行nmr测量。为了将次氮基三乙酸溶解在d2o(carlroth；hn81.3)中，将少量10mnaoh添加到相应的储备溶液中。对于纯nta的测量，如上所述从储备溶液制备d2o中的5mm溶液。在室温下在jeolecz400s光谱仪上以400mhz的共振频率测量1h-nmr谱。为了改善信噪比，在傅立叶变换之前加入了多达32个信号。所得光谱的强度在7ppm标化，所有ppm值都相对于4.70ppm处的水峰进行了调整。[0388]通过测量纯nta及其与钴和水或碳酸根配体的配合物的h1-nmr光谱，证实了[co(iii)(nta)co3]2-配合物的形成(图5)。纯nta的氢谱显示，除了4.70ppm处普遍存在的水峰之外，还在～3.6ppm处有一个峰，这与使用软件nmrpredict进行的模拟(3.57ppm计算值)相符(https://www.nmrdb.org/new_predictor/index.shtml？v＝v2.103.0)(banfi和patiny，2008年；castillo等人，2011年；aires-de-sousa等人，2002年)。当nta与钴和水(此处由于h1-nmr测量，故使用重水(d2o))([co(ii)(nta)(d2o)2]-；图5b)或碳酸根([co(iii)(nta)(co3)]2-；图c d)形成配合物时，～3.6ppm处的原始峰分别位移至～3.8ppm(对于d2o作为配体)和位移至～1.9ppm(对于碳酸根作为配体)。无论使用钴(iii)碳酸钠或钾盐来制备配合物，都观察到了类似的峰位移。nta峰的移动表明，在配合过程中，随着其他原子靠近氢原子，nta中氢原子的磁性环境发生了变化。因此，对于用钴(iii)碳酸盐生成的配合物，观察到不同的峰位移，强烈表明在最终的钴-nta配合物中存在碳酸根配体而不是水配体。[0389]实施例5：通过[co(iii)(nta)co3]形成的[co(iii)(nta)(his6-percevalhr)]配合物的化学稳定性[0390]将具有连接到琼脂糖珠的nta的配合物[co(iii)(nta)(co3)]2-，与带有his标签的蛋白质percevalhr一起温育，以形成固定在琼脂糖珠上的[co(iii)(nta)(his6-percevalhr)]。随后，评估了[co(iii)(nta)(his6-percevalhr)]配合物的化学稳定性。作为对照，采用常规的基于ni2 -nta的基质。[0391]使用质粒prsetb-percevalhr(addgene#49081)(tantama,martinez-francoisetal.2013)，在大肠杆菌dh5α中表达荧光蛋白percevalhr(seqidno:15)，并如(tantama,martinez-francoisetal.2013)所述，通过ni2 -nta柱纯化。[0392]nta琼脂糖树脂(qiagen,1022963)，1)用10个珠体积的ddh2o洗涤，2)用3个珠体积的100mmedtaph7.5洗涤，3)用10个珠体积的ddh2o洗涤三次，并随后加入10个珠体积的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o或1mmni(ii)so4在1mnahco3中的溶液。在23℃以1100rpm在恒温振荡器中振荡温育48小时后，用10个珠体积的ddh2o洗涤珠子两次，用10个珠体积的蛋白质缓冲液(50mmtrisph7.4，150mmnacl)洗涤一次。最后，加入1个珠体积的在蛋白质缓冲液中的10μmhis6-percevalhr(seqidno:15)，并在4℃在恒温振荡器上以1100rpm振荡温育48小时，以使蛋白质结合到基质上。用10个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤两次后，加入3个珠体积的蛋白质缓冲液，并使用读板器(tecan，infinite2000)分析10μl珠浆的percevalhr荧光(λex＝500nm,λem＝545nm)。为了测试配合物的稳定性，加入10个珠体积的在蛋白质缓冲液中的250mm咪唑或单独的蛋白质缓冲液，然后通过用10个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤珠子来移除。最后，将珠子重新悬浮在3个珠体积的蛋白质缓冲液中，并分析10μl珠浆的剩余荧光。所有实验一式三份进行。[0393]如图6所示，用作对照的[ni(ii)(nta)(his6-percevalhr)]配合物对螯合剂咪唑处理显示出低稳定性。与此形成鲜明对比的是，通过钴(iii)碳酸盐形成的[co(iii)(nta)(his6-percevalhr)]配合物和[co(iii)(nta)(co3)]预配合物对咪唑表现出强稳定性。这些配合物的测量稳定性类似于用间接氧化方法(如实施例1中使用的)产生的[co(iii)(nta)(his6-percevalhr)]配合物。因此，该数据证实，令人惊奇地，通过使用[co(iii)(nta)(co3)]2-预配合物，可以高效地无需氧化步骤而形成[co(iii)(nta)(his6-percevalhr)]。[0394]实施例6：his6-gfp与[co(iii)(nta)co3]2-的结合动力学[0395]实施例4证明，可以形成[co(iii)(nta)co3]2-配合物。此外，实施例5表明，通过nta连接到珠子上的[co(iii)(nta)co3]2-配合物可以合成并令人惊讶地用于在珠子上形成[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物。我们推测，在钴(iii)中心作为配体的碳酸根可能促进[coiii(nta)(his-蛋白)]配合物的形成。为了证实这一发现，直接比较了his6-gfp对[co(iii)(nta)(h2o)2]和对[co(iii)(nta)(co3)]2-的结合效率。[0396]nta琼脂糖珠的官能化[0397]nta琼脂糖树脂(qiagen,1022963)，1)用10个珠体积的ddh2o洗涤,2)用10个珠体积的100mmedtaph7.5洗涤,3)用10个珠体积的ddh2o洗涤两次并用6.7个珠体积的ddh2o洗涤一次(对于[co(ii)(nta)(h2o)2]-和[co(iii)(nta)(h2o)2]配合物)或用10个珠体积的ddh2o洗涤两次并用6.7个珠体积的1mnahco3洗涤一次(对于[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物)。随后加入8.7个珠体积的在ddh2o中的1mmco(ii)cl2*6h2o(对于[co(ii)(nta)(h2o)2]-和[co(iii)(nta)(h2o)2]配合物)或在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o(对于[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物)。在25℃以1100rpm在恒温振荡器中温育18小时后，珠子分别用6.7个珠体积的蛋白质缓冲液(50mmtris-hclph7.4，300mmnacl)(对于[co(ii)(nta)(h2o)2]-,[co(iii)(nta)(h2o)2]配合物以及一个[co(iii)(nta)(co3)]2配合物样品)或1mnahco3(对于一个[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物样品，在图7中称作“[co(iii)(nta)(co3)]在1mnahco3中”)洗涤。对于具有最终[co(iii)(nta)(h2o)2]配合物的样品，使用6.7个珠体积的在ddh2o中的20mmh2o2进行第二次洗涤，并在25℃在恒温振荡器(1100rpm)上温育1小时。[0398]his6-gfp与官能化的nta琼脂糖珠的结合动力学[0399]将产生的珠子与3.3个珠体积的在蛋白质缓冲液(50mmtris-hclph7.4，300mmnacl)中的20μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并在4℃以1100rpm在恒温振荡器中温育。对于一个[co(iii)(nta)(co3)]2-样品(在图7中称为“[co(iii)(nta)(co3)]在1mnahco3中”)，使用1mnahco3代替蛋白质缓冲液。通过在不同时间点在读板器(tecan，spark)中测量100μl上清液的荧光强度(λex＝490nm,λem＝535nm)，分析了未结合蛋白质的分数。[0400][co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0401]如上所述，在官能化珠与his6-gfp(seqidno:14)的温育终止后，分析与珠结合的蛋白质的量。为此，珠子用6.7个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤三次，重悬在6.7个珠体积的蛋白质缓冲液中，最后使用读板器(tecan,spark)分析100μl珠浆的gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)。为了测试配合物的稳定性，加入1.7个珠体积的在蛋白质缓冲液中的1.25m咪唑(最终浓度250mm)，在25℃以1100rpm在恒温振荡器上温育10分钟，之后用6.7个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤珠子三次。最后，将珠子重新悬浮在6.7个珠体积的蛋白质缓冲液中，并分析100μl珠浆的剩余荧光。所有实验一式三份进行。[0402]这些实验的结果清楚地表明，结合碳酸根分子的co3 配合物与蛋白质结合的速度，显著快于其中水分子与co3 结合的配合物(图7a)。一致地，用[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物官能化的珠子比预装[co(iii)(nta)(h2o)2]的珠子结合显著更多的蛋白质(图7b)。此外，图7b再次证实[co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物对螯合剂(此处为咪唑)显示出强稳定性。[0403]这些实验进一步表明，在蛋白质结合之前，用1mnahco3洗涤与珠子连接的[co(iii)(nta)(co3)]2-，可以进一步促进his6-gfp的结合。不受理论的束缚，据信缓冲液中hco3-和/或co32-的存在可以阻止[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物转化为较慢的增强性[co(iii)(nta)(h2o)2]配合物。尽管在本实验中对于“[co(iii)(nta)(co3)]在1mnahco3中”的样品(见上文)也在1mnahco3存在下进行了his-蛋白质结合，但可以想到，在蛋白质结合过程中存在1mnahco3，如果有作用的话，也只有非常小程度的促进作用。这是因为在蛋白质结合过程中期望从co3 配合物中释放出碳酸根配体，而这可能因1mnahco3的存在被阻碍而不是促进。[0404]实施例7：his标签蛋白在不同缓冲系统中与[co(iii)(nta)(co3)]2-的结合动力学[0405]确定是否可以通过改变反应缓冲液的组成来改善[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物的形成。[0406]用[co(iii)(nta)(co3)]2-官能化的珠子，采用具有如下小修改的如实施例6中所述的方式制备：用5个珠体积的相应溶液进行珠子洗涤步骤1)至3)。在3)中，第二和第三洗涤步骤用1mnahco3进行。金属在6.5个珠体积中加载。在金属结合之后，珠子用5个珠体积的1mnahco3洗涤。[0407]除了以下变动外，也如实施例6中所述进行了带his标签的gfp(seqidno:14)的温育：使用5个珠体积的10μm蛋白质溶液，并且通过将50mmtrisph7.4替换为50mmbis-trisph6.0,50mmhepesph7.0,50mmmesph6.0或50mmtris-hclph7.5来适应性调整该蛋白质缓冲液。此外，蛋白质温育的前24小时在室温而不是4℃下进行。[0408]这些实验表明，当基于tris的缓冲液被hepes或特别是非配位缓冲液(例如基于mes或bistris的缓冲液)替代时，反应速度和效率可以得到显著提高。温育24小时后，使用基于mes和bistris的缓冲液时，所有蛋白质中95％被固定在珠子上，而使用基于tris的缓冲液时则为75％(图8a)。此外，比较图7a和8a的结果表明，增加用于前24小时蛋白质温育的温度和/或使用1mnahco3进行洗涤，可以促进his-蛋白质配位。当使用基于mes或bistris的缓冲液时，经过三个小时的温育后，大约80％的蛋白质可以与珠子结合。相比之下，在基于tris的缓冲液中，少于50％的蛋白质被固定在珠子上。这证明，可以在合理的时间尺度内以非常高的效率使带有his标签的蛋白质与[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物配位。[0409]值得注意的是，针对不同蛋白质缓冲液所示的ph值，是指将溶液添加到珠子之前的ph值。由于自第二洗涤步骤而留在珠子上的残留nahco3，在与蛋白质温育期间所有样品的ph值都为8.5至9(通过ph测量验证)。因此，由于所有缓冲溶液的ph值非常相似，这些实验清楚地证明，缓冲物质本身对his-蛋白质结合产生影响。所观察到的good氏缓冲剂mes和bistris相对于tris缓冲剂的更好性能，表明使用不能与co3 形成配合物的good氏缓冲剂，相对于使用可形成这种配合物的缓冲剂(例如tris缓冲剂)，是有利的。[0410]实施例8：[co(iii)(nta)(co3)]2-的uv-vis分析[0411]通过nmr，实施例4证明[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物可以形成。在以下实施例中，[co(iii)(nta)co3]2-配合物的形成由另一种技术证明，即通过uv-vis的吸光度测量来证明。[0412]制备co(iii)(nta)(co3)]2-配合物[0413]为了产生[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物，如下制备1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o在1mnahco3中的溶液：以1小时的超声处理，将该盐溶解在所述溶液中，然后通过0,22μm过滤器进行过滤。随后，在1mnahco3中制备0.95mm的该na3[co(iii)(co3)3]*3h2o在1mnahco3中的溶液和溶解在ddh2o中的0.95mmnta三钠盐(sigma；no253)的混合物。在25℃温育1小时后，在uv-vis-nir分光光度计(cary5000)上在1cm比色杯(brand；759150)中测量淡紫色溶液的可见吸光度。[0414]制备[co(iii)(nta)(h2o)2]配合物[0415]为了产生[co(iii)(nta)(h2o)2]配合物，在ddh2o中制备0.95mmco(ii)cl2*6h2o、0,95mmnta三钠盐(sigma；n0253)和20mmh2o2的混合物。在25℃下温育24小时后，在uv-vis-nir分光光度计(cary5000)上，在1cm比色杯(brand；759150)中，相对于具有ddh2o的空白，测量淡紫色溶液的可见吸光度。[0416]通过两个峰的位移，从402nm(对于[co(iii)(nta)(h2o)2]配合物)位移至390nm(对于[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物)或者从567nm位移至573nm，图9中的结果清楚地表明，[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物中碳酸根作为金属结合配体的配位。[0417]实施例9：在na3[co(iii)(co3)3]*3h2o与nta的不同温育时间和温度后his6-gfp与[co(iii)(nta)(co3)]2-的配位以及形成的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性[0418]实施例4证明[co(iii)(nta)co3]2-配合物可以通过将nta与na3[co(iii)(co3)3]*3h2o温育而形成。在下面的实施例中，研究na3[co(iii)(co3)3]*3h2o与nta的不同温育时间和温度，对his6-gfp配位到所产生的[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物上的影响、以及对最终co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的咪唑化学稳定性的影响。[0419]nta琼脂糖珠的官能化[0420]nta官能化的琼脂糖珠(qiagen；1022963)，1)用27个珠体积的ddh2o洗涤，2)用27个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用27个珠体积的ddh2o洗涤一次并用27个珠体积的1mnahco3洗涤两次。随后，加入16个珠体积的在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o，并以1400rpm在恒温振荡器中，将珠子在4℃、25℃或70℃温育所示的1分钟、10分钟、30分钟、1小时、24小时或48小时。温育后，珠子用16个珠体积的1mnahco3洗涤两次。[0421]his6-gfp固定到官能化的[coiii)(nta)(co3)]2-琼脂糖珠上[0422]将产生的珠子与12个珠体积的在蛋白质缓冲液(50mmhepesph7.2,150mmnacl)中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并在25℃以1400rpm在恒温振荡器上振荡温育48小时。在官能化的珠子与his6-gfp(seqidno:14)温育后，珠子用16个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次，并重悬于16个珠体积的蛋白质缓冲液中。[0423][co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0424]在实施所述的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物形成过程后，分析了在有和没有化学胁迫的情况下与珠子结合的蛋白质的量。为此，将珠子分成两部分(每份7.2个珠体积)，并分别用17.8个珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。用17.8个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重悬于17.8个珠体积的蛋白质缓冲液中。根据制造商的指南，在微孔板中通过bca测定(thermo,23227)确定25μl珠浆上的固定蛋白量。该实验一式三份进行。[0425]图10中显示的这些实验的结果清楚地表明，当蛋白质温育长达48小时时，na3[co(iii)(co3)3]*3h2o和nta的温育时间，与缓冲液以及咪唑处理后琼脂糖珠上固定的his-gfp量，呈正相关。对于70℃的温育，反应似乎在1分钟后已经达到其饱和点，因为不令人惊奇地na3[co(iii)(co3)3]*3h2o与nta的配位在较高的温度下被加速。此外，对于在4℃和25℃下进行的温育，如图10a和b所示，温育时间与配合物稳定性呈正相关。对于25℃温育，在10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时已经达到高配合物稳定性，而对于4℃温育，这种稳定性仅在24小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育后才达到。预计稳定的配合物形成会随着温度的升高而加速。[0426]实施例10：在不同温度下[co(iii)(nta)(co3)]2-官能化的珠子与his-蛋白结合的动力学[0427]在以下实施例中，检测在不同的his-蛋白质温育时间和三种不同温度下蛋白质与[co(iii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖磁珠的结合、以及所得[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物对咪唑的稳定性。[0428]nta琼脂糖磁珠的官能化[0429]nta官能化的琼脂糖珠(thermo；78605)，1)用26个珠体积的ddh2o洗涤，2)用26个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用26个珠体积的ddh2o洗涤两次并用26个珠体积的1mnahco3洗涤一次。随后，添加160个珠体积的在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o或1mnahco3(对于不含金属的样品)，珠子在恒温振荡器上1400rpm于25℃温育48小时。温育后，珠子用160个珠体积的1mnahco3洗涤三次。[0430]his6-gfp在官能化[coiii)(nta)(co3)]2-琼脂糖磁珠上的固定[0431]将产生的珠子与120个珠体积的在50mmhepesph7.2,150mmnacl中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并如所示，在4、25或37℃，在恒温振荡器上1400rpm振荡温育所示的1分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、3.5小时或24小时。在官能化珠与his6-gfp(seqidno:14)温育后，珠子用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次，最后重新悬浮在160个珠体积的相应洗涤缓冲液中。[0432][co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0433]在实施了所述的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物形成过程后，分析了在有和没有化学胁迫的情况下与珠子结合的蛋白质的量。为此，将珠子分成两部分，并分别用珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。用178个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重悬于178个珠体积的蛋白质缓冲液中。最后，通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，使用读板器(tecan、spark)，分析10μl珠浆的固定蛋白量。实验一式三份进行。[0434]如图11a所示，咪唑处理的珠子上固定的蛋白量，随着his-gfp与[co(iii)(nta)(co3)]2-官能化珠的温育时间而增加。温育期间的温度不影响形成的[co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物的最终产量。对于所有蛋白质温育时间和温度，可以观察到所得配合物对咪唑的高稳定性(图11b)。[0435]实施例11：使用k3[co(iii)(co3)3]*3h2o形成[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物时[co(iii)(nta)(his-gfp)]的形成和稳定性[0436]实施例4证明，通过将k3[co(iii)(co3)3]*3h2o与nta一起温育可以形成[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物。在以下实施例中，研究his-gfp与使用k3[co(iii)(co3)3]*3h2o产生的co(iii)(nta)(co3)]2-配合物的配位以及所得[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物对咪唑的化学稳定性。[0437]nta琼脂糖磁珠的官能化[0438]nta官能化的琼脂糖磁珠(thermo；78605)，1)用600个珠体积的ddh2o洗涤，2)用600个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用600个珠体积的ddh2o洗涤一次并用600个珠体积的1mnahco3洗涤两次。随后，添加160个珠体积的在1mnahco3中的1mmk3[co(iii)(co3)3]*3h2o或仅1mnahco3(对于不含金属的样品)。k3[co(iii)(co3)3]*3h2o如实施例4中所述产生。基于合成过程的100％反应效率的假设，进行浓度计算。如所示将样品在25℃以1400rpm在恒温振荡器中温育10分钟或48小时后，用160个珠体积的1mnahco3将珠子洗涤三次。[0439]his6-gfp固定到官能化的nta磁珠上[0440]将产生的珠子与120个珠体积的在蛋白质缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并在25℃在恒温振荡器上以1400rpm振荡温育如所示的1小时或48小时。在官能化珠与his6-gfp(seqidno：14)温育后，珠子用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次并重悬于160个珠体积的蛋白质缓冲液中。[0441][co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0442]在实施了所述的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物形成过程后，分析了在有和没有化学胁迫的情况下与珠子结合的蛋白质的量。为此，将珠分成两部分(每份72个珠体积)，并分别用178个珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。用178个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重悬于178个珠体积的蛋白质缓冲液中，并通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，使用读板器(tecan、spark)，分析了10μl珠浆的固定蛋白量。实验一式三份进行。[0443]图12中描绘的结果清楚地表明，his-gfp可以与由k3[co(iii)(co3)3]*3h2o与nta温育形成的co(iii)(nta)(co3)]2-配合物配位。所得的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物对咪唑处理显示出高化学稳定性。因为k3[co(iii)(co3)3]*3h2o在较高浓度是可溶的，因此，与使用na3[co(iii)(co3)3]*3h2o相比，使用k3[co(iii)(co3)3]*3h2o可以在较高浓度实施与金属结合域的温育。[0444]实施例12：在不同蛋白质结合缓冲液中his6-gfp与[co(iii)(nta)(co3)]2-的配位以及形成的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性[0445]实施例7展示了不同缓冲物质对his标签蛋白质与[co(iii)(nta)(co3)]2-的结合动力学的影响。在以下实施例中，研究在多种不同的缓冲系统中，蛋白质与两种不同na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的[co(iii)(nta)(co3)]2-官能化琼脂糖磁珠的结合，以及所得[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物对咪唑的稳定性。[0446]nta琼脂糖磁珠的官能化[0447]nta官能化的琼脂糖珠(thermo；78605)，1)用182个珠体积的ddh2o洗涤，2)用182个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用182个珠体积的ddh2o洗涤一次并用182个珠体积的1mnahco3洗涤两次(对于采用10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品)，或用182个珠体积的ddh2o洗涤两次并用182个珠体积的1mnahco3洗涤一次(对于具有48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品)。随后，添加160个珠体积的在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o或1mnahco3(对于不含金属的样品)，并将珠子在25℃和1400rpm在恒温振荡器上温育所示的10分钟或48小时。温育后，用160个珠体积的1mnahco3，对于10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品，将珠子洗涤两次，或对于48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品，将珠子洗涤三次。[0448]his6-gfp固定到官能化的[coiii)(nta)(co3)]2-琼脂糖磁珠上[0449]将产生的珠子与120个珠体积的在基于tris-、hepes-、mes-、mops-、bistris-、aces-、pipes-、bes-、caps-或taps-的蛋白质缓冲液(50mm缓冲液ph7.2,150mmnacl)或pbs中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并在25℃在恒温振荡器上以1400rpm振荡温育所示的1分钟、15分钟、1小时或24小时。在将官能化珠与his6-gfp(seqidno:14)温育后，对于具有10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品，用160个珠体积的蛋白质缓冲液，或对于具有48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品，用分析缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)，将珠子洗涤一次，并最后重新悬浮在160个珠体积的相应洗涤缓冲液中。[0450][co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0451]在实施了所述的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物形成过程后，分析了在有和没有化学胁迫的情况下与珠子结合的蛋白质的量。为此，对于具有48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品，珠子被分成两部分(每份72个珠体积)，并分别用178个珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。用178个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重悬于178个珠体积的蛋白质缓冲液中。使用读板器(tecan，spark)通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，分析10μl珠浆的固定蛋白量。对于具有10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品，在进行如下洗涤处理之前和之后分析珠子，所述洗涤处理包括：首先用160个珠体积的在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑，然后用160个珠体积的蛋白质结合缓冲液进行洗涤。实验一式三份进行。[0452]结果清楚地表明，在所有缓冲系统中，带his标签的蛋白质都可以以化学稳定的方式固定在珠子上。与具有10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品(图13)相比，在具有48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品中稳定配合物的比例更高(图14)。对于所有缓冲系统和na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间，咪唑处理后固定蛋白的量随着蛋白质温育时间的增加而增加。因此，与10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间相比，在具有48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品中不同的缓冲系统对反应动力学的影响更大。预计，在48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品上，使用hepes、mes、mops和pipes缓冲剂，在短的蛋白质温育时间，导致珠子上增加量的稳定固定的蛋白质(图14b-d)。对于较长的温育时间，预计(图14e)，hepes、mes、mops或aces是首选的good氏缓冲剂。[0453]实施例13：ph对his6-gfp与[co(iii)(nta)(co3)]2-的配位和形成的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性的影响[0454]实施例7表明，蛋白质结合缓冲液的ph对带his标签的蛋白质与[co(iii)(nta)(co3)]2-的结合动力学的影响。在以下实施例中，在两种蛋白质结合缓冲系统中，各使用5种不同的ph值，检测蛋白质与[co(iii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖磁珠的结合以及所得[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物对咪唑的稳定性。[0455]nta琼脂糖磁珠的官能化[0456]nta官能化的琼脂糖珠(thermo；78605)，1)用26个珠体积的ddh2o洗涤，2)用26个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用26个珠体积的ddh2o洗涤两次并用26个珠体积的1mnahco3洗涤一次。随后，添加160个珠体积的在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o或1mnahco3(对于不含金属的样品)，然后将珠子在25℃下在恒温振荡器中以1400rpm温育48小时。温育后，对于48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品，用160个珠体积的1mnahco3将珠子清洗三次。[0457]his-gfp固定到官能化的[coiii)(nta)(co3)]2-琼脂糖磁珠上[0458]将产生的珠子与120个珠体积的在基于bistris或hepes的蛋白质缓冲液(50mm缓冲液，150mmnacl)中的10μmhis6-gfp(seqidno：14)混合，对于基于bistris的系统，ph为5.5、6.0、6.5、7.0或7.5，对于基于hepes的系统，ph为ph7.5、8.0、8.5、9.0或9.5，并在25℃下在恒温振荡器上以1400rpm振荡温育所示的1分钟、15分钟、1小时或24小时。在官能化珠与his6-gfp(seqidno:14)温育后，珠子用160个珠体积的分析缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)洗涤一次，最后重悬于160个珠体积的分析缓冲液中。[0459][co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0460]在实施所述的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物形成过程后，分析了在有和没有化学胁迫的情况下与珠子结合的蛋白质的量。为此，将珠子分成两部分(每份72个珠体积)，并分别用178个珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。在用178个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重悬于178个珠体积的蛋白质缓冲液中。使用读板器(tecan，spark)通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)分析10μl珠浆的固定蛋白量。实验一式三份进行。[0461]结果清楚地表明，在所有ph值下，带his标签的蛋白质都可以以化学稳定的方式固定在珠子上。因此，可以以化学稳定的方式固定高百分比的his-gfp，并且咪唑处理前后的固定蛋白量随着蛋白质温育时间的增加而增加(图15a)。使用在较低ph值的蛋白质结合缓冲液，最终[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的配合物形成效率得到急剧的增加(图15b)。不仅可以观察到基于ph值的效率差异，还可以观察到源自缓冲系统的效率差异(ph7.5bistrisvs.hepes)。[0462]实施例14：不同蛋白质通过其his标签或富含组氨酸的区域固定到[co(iii)(nta)(co)3]2-或[co(iii)(ida)(co)3]-官能化珠上[0463]几个实施例证明his6-gfp可以通过[co(iii)(nta)(co)3]2-或[co(iii)(ida)(co)3]-固定到珠子上。在以下实施例中，测试不同的his标签蛋白以及抗体(通过其fc部分的富含组氨酸区域配位)在珠子上的固定。此外，还研究了固定的酶(分选酶)和抗体(gfp与固定的抗gfpigg1的结合)的功能。[0464]nta官能化的琼脂糖磁珠(thermo；78605)或ida官能化的磁珠(cubebiotech；30805)，1)用33个珠体积的ddh2o洗涤，2)用33个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用33个珠体积的ddh2o洗涤一次并用33个珠体积的1mnahco3洗涤两次(对于不具有金属和具有钴中心的样品)，或用33个珠体积的ddh2o洗涤三次(对于具有镍中心的样品)。随后，添加160个珠体积的在1mnahco3中的na3[co(iii)(co3)3]*3h2o或1mnahco3(对于不含金属的样品)或在ddh2o中的1mmniso4(对于具有镍中心的样品)，珠子在25℃和1400rpm在恒温振荡器中温育10分钟。温育后，珠子用160个珠体积的1mnahco3或ddh2o(对于具有镍中心的样品)洗涤三次。[0465]蛋白质在官能化的[coiii)(nta/ida)(co3)]2-琼脂糖磁珠上的固定[0466]将产生的珠子与120个珠体积的蛋白质(10μmhis-gfp(seqidno：14)；10μmhis-蛋白a(abcam；ab52953)；10μmhis-分选酶a(seqidno：16)；1μmhis-人血清白蛋白(antikoerperonline；abin2181228)；0.2μm抗gfp小鼠igg1(biolegend；902605))在蛋白质结合缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)中的溶液混合，并在25℃下以1400rpm在恒温振荡器上振荡温育48小时或30分钟(对于ida样品)。在官能化珠与蛋白质温育后，保存蛋白质上清液样品用于之后通过sds-page分析，珠子用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次，最后重悬在160个珠体积的分析缓冲液中，或者对于抗体样品，继续进行gfp温育，如单独部分所述。[0467][co(iii)(nta/ida)(蛋白)]配合物的化学稳定性[0468]在实施了所述的[co(iii)(nta/ida)(蛋白)]配合物形成过程后，分析化学胁迫后与珠子结合的蛋白量。为此，将珠子用178个珠体积的在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。用178个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重悬于178个珠体积的蛋白质缓冲液中。根据制造商的指南，在微孔板上通过bca测定法(thermo，23227)确定25μl珠浆上的蛋白量。[0469]确定固定在珠子上的分选酶a的功能性[0470]按照制造商的说明，使用来自anaspec的520分选酶a活性测定试剂盒(#72228)，测定在20μl珠浆上固定的分选酶a的活性。[0471]gfp结合固定的α-gfp抗体[0472]为了评估固定的抗体的功能，用[co(iii)(nta/ida)(igg1)]官能化的珠子在25℃与120个珠体积的在蛋白质结合缓冲液中的0.54μmgfp(无his标签)(abcam；ab84191)一起温育1小时。温育后，珠子用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次，最后重新悬浮在160个珠体积的分析缓冲液中，并且对于具有ida的样品，进行如上所述的化学稳定性测定。最后，使用读板器(tecan，spark)基于10μl珠浆的gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，确定与固定的抗体结合的gfp。[0473]蛋白质上清液的sds-page[0474]除了使用12％(w/v)丙烯酰胺-双丙烯酰胺(37.5:1)凝胶并且每孔加载6μl蛋白质上清液之外，如实施例3中所述进行蛋白质温育后蛋白质上清液的sds-page。使用instantbluecoomassie染色剂(expedion；isb1l)进行条带可视化。[0475]his-分选酶的纯化[0476]使用质粒pet29_esrta(addgene#75144)(chen,dorretal.2011)在大肠杆菌bl21(de3)中表达酶分选酶a(seqidno:16)，并如(chen,dorretal.2011)所述，通过ni2 -nta柱纯化。[0477]图16中显示的结果清楚地表明，除了his6-gfp之外，其他带有his标签的蛋白质或甚至抗体通过其富含组氨酸的区域也可以在蛋白质结合期间从上清液中清除(图16a)，并最终稳定地固定在[co(iii)(nta)(co)3]2-或[co(iii)(ida)(co)3]-官能化的珠子上(图16b)。此外，可以证明，固定的蛋白仍然具有功能，例如酶分选酶a仍然有活性(图16c)或固定在nta或ida珠上的抗gfp抗体仍然可以结合其抗原gfp。[0478]实施例15：使用非nta的其他金属结合域的配合物形成和稳定性[0479]实施例4证明，可以形成[co(iii)(nta)co3]2-配合物。此外，实施例5表明，可以合成通过nta连接到珠子上的[co(iii)(nta)co3]2-配合物，并令人惊讶地用于在珠子上形成[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物。我们推测，除nta之外的其他金属结合结构域也可用于形成[co(iii)(金属结合域)(his-蛋白)]配合物。为了测试方法的通用性，检查了使用亚氨基二乙酸(ida)(一种三齿金属结合域)和talon(一种商业四齿金属结合域)的配合物形成。[0480]ida/talon磁珠的官能化[0481]ida官能化的磁珠(cubebiotech；30805)或talon官能化的磁性琼脂糖树脂(takara,635636)，1)用20个珠体积的ddh2o洗涤,2)用20个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤,3)用20个珠体积的ddh2o洗涤两次并用20个珠体积的1mnahco3洗涤一次。随后加入160个珠体积的在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o或仅1mnahco3(对于不含金属的样品)。在25℃和1400rpm下将样品按所示在恒温振荡器中温育10分钟或48小时后，用160个珠体积的1mnahco3将珠子洗涤三次。[0482]his6-gfp固定在官能化的ida/talon磁珠上[0483]将产生的珠子与160个珠体积的在蛋白质缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并在25℃在恒定振荡器上以1400rpm振荡温育所示的30分钟、1小时或48小时。在官能化珠与his6-gfp(seqidno：14)温育后，珠子用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次，并重悬于160个珠体积的蛋白质缓冲液中。[0484][co(iii)(ida/talon)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0485]在实施了所述的[co(iii)(ida)(his-gfp)]或[co(ii)(talon)(his-gfp)]配合物形成过程后，在有和没有化学胁迫的情况下分析结合到珠子上的蛋白质的量。为此，将珠子分成两部分(每份72个珠体积)，并分别用178个珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。用178个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重新悬浮在178个珠体积的蛋白质缓冲液中，并使用读板器(tecan、spark)通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)分析了10μl珠浆的固定蛋白量。两个实验均一式三份进行。[0486]实验清楚地证明了，用ida(图17a)和talon(图17b)作为金属结合域的蛋白质固定化。因此，通过钴(iii)碳酸根配合物进行的钴(iii)介导的蛋白质固定，不限于使用nta作为金属结合域。此外，三齿金属结合结构域ida显示出甚至改进的特性，例如与(参见图20b)相比，短温育时间的改进稳定性。四齿金属结合域talon也展示出了蛋白质的固定化。[0487]实施例16：研究[co(iii)(ida)(his-gfp)]配合物的化学稳定性[0488]实施例1证明[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的化学稳定性。在实施例15中，证明了[co(iii)(ida)(his-gfp)]的形成及其对咪唑的稳定性。在以下实施例中，将[co(iii)(ida)(his-gfp)]官能化珠，与强螯合剂或与广泛使用的还原剂和250mm咪唑的组合一起温育，以证明ida与co3 金属中心的配合可以形成化学稳定的配合物，就如(实施例1中所证明的)由nta和co3 组成的配合物。[0489]ida磁珠的官能化[0490]ida官能化的磁珠(cubebiotech；30805)，1)用20个珠体积的ddh2o洗涤，2)用20个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用20个珠体积的ddh2o洗涤两次并用20个珠体积的1mnahco3洗涤一次。随后，加入160个珠体积的在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o或1mnahco3(对于不含金属的样品)，珠子在恒温振荡器中1400rpm于25℃温育10分钟。温育后，珠子用20个珠体积的1mnahco3洗涤三次。将产生的珠子与160个珠体积的在50mmhepesph7.2、150mmnacl中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并在25℃在恒温振荡器上以1400rpm振荡温育30分钟。在与his6-gfp(seqidno:14)温育后，用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤珠子三次。[0491][co(iii)(ida)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0492]随后，160个珠体积的每种测试试剂(最终浓度：250mm咪唑、25mmnta或25mmedta在蛋白质缓冲液中，或补充有250mm咪唑的1mmdtt、tcep或抗坏血酸在蛋白质缓冲液中，或50mm甘氨酸ph10.0)如所示添加到相应的样品中。在25℃和1400rpm振荡温育1小时后，去除上清液，用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤珠子三次，并溶解在160个珠体积的蛋白质缓冲液中。最后，使用读板器(tecan，spark)通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，分析了10μl珠浆的剩余固定蛋白量。实验一式三份。[0493]实验清楚地证明了，[co(iii)(ida)(his6-gfp)]配合物对不同化学物质(包括螯合剂和还原剂)的高化学稳定性。如图18所示，当his6-gfp与[co(iii)(ida)(co3)]配合物结合时，与用缓冲液处理的珠子相比，在与测试的螯合剂或还原剂温育后，仅观察到非常小的固定化减少。因此，[co(iii)(ida)(his6-gfp)]配合物对强螯合剂的破坏以及还原为co2 都是惰性的。[0494]实施例17：比较通过[co(iii)(ida)(co3)]-与通过[co(iii)(ida)(h2o)2] 的[co(iii)(ida)(his-gfp)]配合物形成[0495]实施例4证明，可以形成[co(iii)(nta)co3]2-配合物。此外，实施例5表明，可以合成通过nta连接到珠子上的[co(iii)(nta)co3]2-配合物，并令人惊讶地用于在珠子上形成[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物。在实施例6中表明，与使用[co(iii)(nta)(h2o)2]的配合物形成动力学相比，his-gfp与[co(iii)(nta)(co3)]2-的结合动力学得到改善。在实施例15中证明，ida可以作为金属结合域通过[co(iii)(ida)co3]-用于形成[co(iii)(ida)(his-gfp)]配合物。我们推测，碳酸根作为钴(iii)中心的配体也可能促进[co(iii)(ida)(his-蛋白)]配合物的形成。为了证实这一发现，直接比较了his6-gfp与[co(iii)(ida)(h2o)2]以及与[co(iii)(ida)(co3)]-的配合物形成效率以及最终的[co(iii)(ida)(his-gfp)]配合物的化学稳定性。[0496]ida磁珠的官能化[0497]ida官能化的磁珠(cubebiotech；30805)，1)用80个珠体积的ddh2o洗涤，2)用80个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用80个珠体积的ddh2o洗涤两次并用80个珠体积的1mnahco3(对于[co(iii)(ida)(co3)]2-配合物)或ddh2o(对于[co(ii)(ida)(h2o)2]-配合物或无金属样品)洗涤一次。[0498]随后加入160个珠体积的在脱气的ddh2o中的1mmco(ii)cl2*6h2o(对于[co(ii)(ida)(h2o)2]和[co(iii)(ida)(h2o)2] 样品)或在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o(对于[co(iii)(ida)(co3)]-配合物)。向不含金属的样品中加入160个珠体积的ddh2o。在25℃以1400rpm在恒温振荡器中温育10分钟(或对于具有[co(iii)(ida)(co3)]-配合物的指定样品，温育48小时)后，将珠子用160个珠体积的1mnahco3(对于具有[co(iii)(ida)(co3)]2-配合物的样品)或ddh2o(对于[co(ii)(ida)(h2o)2]样品或无金属样品)洗涤三次。[co(iii)(ida)(h2o)2] 用160个珠体积洗涤一次，在160个珠体积的20mmh2o2中在恒温振荡器上1400rpm于25℃温育1小时，最后用160个珠体积的ddh2o洗涤一次。[0499]his6-gfp固定到官能化的ida磁珠上[0500]将产生的珠子与160个珠体积的在蛋白质缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)或pbs中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，如所示在25℃以1400rpm在恒温振荡器上振荡温育3小时或24小时。在官能化珠与his6-gfp(seqidno：14)温育后，珠子用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次并重悬于160个珠体积的蛋白质缓冲液中。[0501][co(iii)(ida)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0502]在实施了所述的co(iii)(ida)(his-gfp)]配合物形成过程后，分析了在有和没有化学胁迫的情况下与珠子结合的蛋白质的量。为此，将珠子分成两部分(每份72个珠体积)并分别用178个珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。用178个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重新悬浮在178个珠体积的蛋白质缓冲液中，并使用读板器(tecan、spark)通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)分析了10μl珠浆的固定蛋白量。实验一式三份进行。[0503]这些实验的结果清楚地表明，通过将nta和na3[co(iii)(co3)3]*3h2o温育10分钟获得的[co(iii)(ida)(co3)]-配合物官能化的珠子，比预装[co(iii)(ida)(h2o)2] 的珠子结合显著更多的蛋白质(图19)。对于用48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o温育获得的[co(iii)(ida)(co3)]-配合物官能化的珠子，仅在24小时蛋白质温育后可见超过co(iii)(ida)(h2o)2] 配合物的显著优势。需要强调的是，对于ida，优选温育时间为10分钟的na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育以及30分钟至3小时的随后蛋白质温育。通过这些温育时间组合，与[co(iii)(ida)(h2o)2] 相比，[co(iii)(ida)(co3)]-配合物可以实现显著改善的固定效率。此外，图19再次证实[co(iii)(ida)(his6-gfp)]配合物对螯合剂(此处为咪唑)的强稳定性。[0504]实施例18：比较通过[co(iii)(金属结合域)(co3)]2-与通过氧气处理[co(ii)(金属结合域)(his-gfp)]的[co(iii)(金属结合域)(his-gfp)]化学稳定配合物的形成[0505]实施例5证明，通过[co(iii)(nta)(co3)]2-形成的[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物的高百分比是化学稳定的。我们推测，与用氧气处理[co(ii)(金属结合域)(his-蛋白)]相比，始于[co(iii)(金属结合域)co3]2-的[co(iii)(金属结合域)(his-蛋白)]配合物形成，可以导致增加量的化学稳定的[co(iii)(金属结域)(his-蛋白)]配合物。为了证实这一发现，分别使用nta或ida作为金属结合域，直接比较了通过[co(iii)(金属结合域)(co3)]或通过8小时氧气处理[co(ii)(金属结合域)(his-蛋白)]所形成的化学稳定[co(iii)(金属结合域)(his-蛋白)]配合物的量。[0506]ida/nta琼脂糖磁珠的官能化[0507]ida官能化磁珠(cubebiotech；30805)或nta官能化磁性琼脂糖树脂(thermo，78605)，1)用80个珠体积的ddh2o洗涤，2)用80个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用80个珠体积的ddh2o洗涤两次并用160个珠体积的ddh2o(对于[co(ii)(ida/nta)(h2o)2]配合物)或1mnahco3(对于[co(iii)(ida/nta)(co3)]配合物或无金属样品)洗涤一次。对于具有[co(ii)(ida/nta)(h2o)2]配合物的样品，所有洗涤均使用脱气的20分钟氮气充气的溶液以及在覆盖有氮气的管子中进行。[0508]随后加入160个珠体积的在脱气、20分钟氮气充气的ddh2o中的1mmco(ii)cl2*6h2o(对于[co(ii)(ida/nta)(h2o)2])或在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o(对于[co(iii)(ida/nta)(co3)]配合物)。向不含金属的样品中加入1mnahco3。在25℃以1400rpm在恒定振荡器中温育10分钟(或对于具有[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物的指定样品，温育48小时)后，珠子用160个珠体积的ddh2o(对于[co(ii)(ida/nta)(h2o)2]样品)或1mnahco3(对于具有[co(iii)(ida/nta)(co3)]配合物的样品或无金属样品)洗涤三次。[0509]his6-gfp固定到官能化的ida/nta磁珠上[0510]将产生的珠子与120个珠体积的在蛋白质缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并在25℃下在恒温振荡器上以1400rpm振荡温育30分钟或48小时(对于无金属样品)或如图9所示。在官能化珠与his6-gfp(seqidno:14)温育后，将珠子用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤两次(样品“[co(iii)(ida/nta)(his-gfp)]通过h2o2”仅一次)，最后加入160个珠体积的蛋白质缓冲液。[co(ii)(ida/nta)(his-gfp)]的一个样品(在图20中称为“[co(iii)(ida/nta)(his-gfp)]通过o2”)用o2通气8小时，而在另一个[co(ii)(ida/nta)(his-gfp)]样品(在图9中称为“[co(iii)(ida/nta)(his-gfp)]通过h2o2”)中加入6,4个珠体积的500mmh2o2(最终20mm)，并在25℃以1400rpm在恒温振荡器上温育1小时，然后用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤。[0511][co(iii)(ida/nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0512]在实施了所述的co(iii)(ida)(his-gfp)]或co(ii)(nta)(his-gfp)]配合物形成过程后，在有和没有化学胁迫的情况下，分析了结合到珠子上的蛋白质的量。为此，珠子用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次，重新悬浮在160个珠体积的蛋白质缓冲液中，分成两部分(每份72个珠体积)，并用178个珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。用178个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重新悬浮在178个珠体积的蛋白质缓冲液中，并使用读板器(tecan、spark)通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)分析了10μl珠浆的固定蛋白量。ida实验一式三份进行；nta实验单个地在三个独立实验中进行。[0513]图20中记录的这些实验的结果清楚地表明，使用[co(iii)(ida)(co3)]2-配合物(图20a)和[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物(图20b)，与用氧气对[co(ii)(金属结合域)(his-蛋白)]]配合物官能化的珠子通气8小时相比，可以在珠子上化学稳定地固定显著更多的his6-gfp蛋白。除了更高百分比的稳定配合物外，使用[co(iii)(金属结合域)(co3)]2-也比氧化方法更快。[0514]实施例19：通过[co(iii)(hs-peg-nta)(co3)]2-配合物在表面固定蛋白质[0515]本发明的数个实施例证明了通过[co(iii)(nta)(co3)]2-形成[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物。在本实施例中，在具有纳米结构金点的玻璃表面上测试了采用该原理的蛋白质固定。[0516]纳米结构玻璃表面的产生和钝化[0517]纳米结构表面，如前(spatz,etal.2000,roman,martinetal.2003,lohmuller,aydinetal.2011)所述，通过二嵌段共聚物胶束纳米光刻法生产，通过扫描电子显微镜测定，具有平均颗粒间距58nm。简而言之，分别将5mg/ml的聚苯乙烯(501)-b-聚-2-乙烯基吡啶(323)(polymersource,canada)溶解在邻二甲苯中。随后，将0.5比例的四氯金酸与乙烯基吡啶单体加入到溶液中并搅拌24小时。将溶液旋涂在20x20mmn°1玻璃盖玻片(carlroth，德国)上。之后，对基板进行等离子体处理(10％h2/90％ar，350w，0.4mbar，45分钟)。[0518]为了防止任何蛋白质非特异性粘附到金纳米结构之间的玻璃基板上，根据之前描述的程序(blummel，perschmann等人，2007)钝化玻璃表面。因此，在氧等离子体中激活纳米图案表面(150w，0.4mbar，10分钟)，并在80℃在含有0.25mmα-甲氧基-ω-三甲氧基甲硅烷基聚(乙二醇)(分子量2000g/mol)(irisbiotech，德国)、5.5μm水和20mm无水三甲胺(acrosorganics，美国)的无水甲苯p.a.(acrosorganics，美国)中在氮气气氛下温育过夜。最后，将基板用乙酸乙酯(acrosorganics，美国)洗涤三次，用甲醇(vwr化学品，美国)洗涤一次，并在n2流下干燥。[0519]用巯基-peg-nta对表面进行官能化[0520]钝化后，将100μl具有0,5mmhs-(ch2)11-eg3-nta(prochimia；th007)的99,8％乙醇或乙醇(仅用于“仅peg”和“peg/gfp”样品)移液到每个表面。在室温下温育1小时后，将表面在ddh2o浴中或(对于样品“[co(iii)(nta)(his-gfp)]”)在1mnahco3中洗涤三次。[0521][co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的形成[0522]官能化后，表面覆盖400μl在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o(对于样品“[co(iii)(nta)(his-gfp)]”)或ddh2o(对于其他样品)，并在室温下温育10分钟。随后，对于样品“[co(iii)(nta)(his-gfp)]”在1mnahco3浴中，或对于其他样品在ddh2o浴中，将表面清洗三次。最后，将300μl在蛋白质结合缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)中的10μmhis6-gfp，加到表面上，并在室温下温育30分钟。在蛋白结合缓冲液浴中洗涤3次后，将表面置于透明的6孔板中，覆盖上蛋白结合缓冲液，使用读板器(tecan，spark)分析gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)作为表面上固定蛋白的量度。[0523]实验结果如图21所示。与其他对照样品相比，在使用硫醇-peg-nta、na3[co(iii)(co3)3]*3h2o和his-gfp处理的表面上可以测量到高得多的荧光信号，表明在该表面上成功地形成[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物。[0524]实施例20：用[co(iii)(生物素-x-nta)(co3)]配合物对his-gfp进行位点特异性的生物素化[0525]在几个实施例中，证明了带his标签的蛋白质通过[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物固定到珠子上和在实施例19中固定到用nta官能化的表面上。在以下实施例中，测试了通过[co(iii)(生物素-x-nta)(co3)]配合物在溶液中对his-gfp在其his标签处的生物素化。[0526]his-gfp的生物素化[0527]60μm生物素-x-nta(sigma-aldrich；51410)与在1mnahco3中的30μm(样品1:2)、60μm(样品1:1)或600μm(样品10:1)na3[co(iii)(co3)3]*3h2o或仅1mnahco3(对于具有金属的样品)混合，并在室温下在旋转轮上温育10分钟。所得[co(iii)(生物素-x-nta)(co3)]配合物随后在室温下与6μmhis6-gfp(seqidno:14)在蛋白质结合缓冲液(50mmhepesph7.2,150mmnacl)中的溶液在旋转轮上温育30分钟或48小时。[0528][co(iii)(生物素-x-nta)(his-gfp)]固定到链霉亲和素官能化的琼脂糖上[0529]温育后，使所得的[co(iii)(生物素-x-nta)(his-gfp)]配合物，在所示的30分钟或48小时温育步骤中在室温和转动下，结合到链霉亲和素官能化的琼脂糖凝胶(gehealthcare，17-5113-01)上(所述琼脂糖凝胶通过用166个珠体积的蛋白质结合缓冲液洗涤3次制备)。温育后，珠子用16个珠体积的蛋白质结合缓冲液洗涤三次，并重新悬浮在16个珠体积的蛋白质缓冲液中。[0530][co(iii)(生物素-x-nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0531]在将[co(iii)(生物素-x-nta)(his-gfp)]配合物与珠子固定的程序后，分析了在有或没有化学胁迫的情况下与珠子结合的蛋白质量。为此，将珠子分成两部分，并分别用17个珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。在用17个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重新悬浮在17个珠体积的蛋白质缓冲液中。最后，使用读板器(tecan，spark)通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)分析10μl珠浆的固定蛋白量。实验一式三份进行。[0532]如图22a所示，在所有co/nta比率下，均证实了带his标签的gfp在溶液中的生物素化。然而，使用生物素-x-nta与na3[co(iii)(co3)3]*3h2o的较高比例，可以实现更好的标记效率，如基于固定在链霉亲和素珠上的生物素化蛋白质的荧光而量度的。在图22b中证明，与10分钟蛋白质温育的样品相比，48小时蛋白质温育后有更多配合物可以在严格咪唑洗涤后固定在链霉亲和素珠上，因此，更长时间的蛋白质温育将产生更多量的稳定形成的配合物。[0533]实施例21：使用硝酸铂(iv)形成[pt(iv)(nta)(his6-gfp)]配合物及其化学稳定性[0534]我们推测，不仅碳酸根作为配体，而且硝酸根在金属中心也可促进[(金属)(nta)(his-蛋白)]配合物的形成。此外，我们推测，除了co3 之外，其他具有低配体交换速率的过渡金属也可形成化学稳定的[(金属)(nta)(his-蛋白)]配合物。为了证实这一发现，检查了his6-gfp与[pt(iv)(nta)(no3)]的结合效率。[0535]nta琼脂糖珠的官能化[0536]nta官能化的琼脂糖珠(qiagen；1022963)，1)用10个珠体积的ddh2o洗涤，2)用10个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用10个珠体积的ddh2o洗涤两次并用10个珠体积的1m硝酸洗涤一次。随后加入16个珠体积的硝酸铂(iv)(44mg/lpt(iv))(fisherscientific；15407817)在1m硝酸中的溶液或仅1m硝酸(对于不含金属的样品)。在25℃下以1400rpm将样品在恒温振荡器中温育10分钟后，用16个珠体积的1m硝酸将珠子洗涤三次。[0537]his6-gfp固定到[pt(iv)(nta)(no3)]琼脂糖珠上[0538]将产生的珠子与16个珠体积的在蛋白质缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并在25℃下以1400rpm在恒温振荡器上振荡温育30分钟。在官能化珠与his6-gfp(seqidno：14)温育后，珠子用16个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次，并重悬于16个珠体积的蛋白质缓冲液中。[0539][pt(iv)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性covalentlyattachedpegcoatingsonnanostructuredsio(2)-basedinterfaces."biomaterials28(32):4739-4747.[0554]border,w.a.,c.b.wilsonando.gotze(1976)."nephriticfactor:descriptionofanewquantitativeassayandfindingsinglomerulonephritis."kidneyint10(4):311-318.[0555]cal,p.m.,g.j.bernardesandp.m.gois(2014)."cysteine-selectivereactionsforantibodyconjugation."angewchemintedengl53(40):10585-10587.[0556]caravan,p.,c.comuzzi,w.crooks,t.j.mcmurry,g.r.choppinands.r.woulfe(2001)."thermodynamicstabilityandkineticinertnessofms-325,anewbloodpoolagentformagneticresonanceimaging."inorganicchemistry40(9):2170-2176.[0557]castillo,a.m.,l.patinyandj.wist(2011)."fastandaccuratealgorithmforthesimulationofnmrspectraoflargespinsystems."jmagnreson209(2):123-130.[0558]chappell,l.l.,d.ma,d.e.milenic,k.garmestani,v.venditto,m.p.beitzelandm.w.brechbiel(2003)."synthesisandevaluationofnovelbifunctionalchelatingagentsbasedon1,4,7,10-tetraazacyclododecane-n,n',n",n"'-tetraaceticacidforradiolabelingproteins."nuclmedbiol30(6):581-595.[0559]chen,x.andy.w.wu(2016)."selectivechemicallabelingofproteins."orgbiomolchem14(24):5417-5439.[0560]chen,i.,b.m.dorrandd.r.liu(2011)."ageneralstrategyfortheevolutionofbond-formingenzymesusingyeastdisplay."procnatlacadsciusa108(28):11399-11404.[0561]chin,j.,s.s.lee,k.j.lee,s.parkandd.h.kim(1999)."ametalcomplexthatbindsalpha-aminoacidswithhighandpredictablestereospecificity."nature401(6750):254-257.[0562]cini,r.andg.giogi(1987)."purinenucleotide-metalcomplexes."inorganicachimicaacta137(1-2):87-90.[0563]clerac,r.,f.a.cotton,k.r.dunbar,t.lu,c.a.murilloandx.wang(2000)."newlineartricobaltcomplexofdi(2-pyridyl)amide(dpa),[co3(dpa)4(ch3cn)2][pf6]2."inorgchem39(14):3065-3070.[0564]cusanelli,a.,u.frey,d.t.richensanda.e.merbach(1996)."theslowestwaterexchangeatahomolepticmononuclearmetalcenter:variable-temperatureandvariable-pressure17onmrstudyon[ir(h2o)6]3 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技术领域：
：1.本发明涉及用于将靶分子如蛋白质缀合/连接至标记物和/或载体的手段和方法。具体地，本发明提供了配合物(complex)，其包含与(i)金属阳离子配体co32-或hco3-和(ii)包含螯合配体和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域配位的金属阳离子。该配合物可用于将标记物和/或载体连接至靶分子，优选蛋白质。通过本发明配合物连接标记物或载体涉及，用靶分子的配位基团置换金属阳离子配体，由此形成在金属阳离子的配位层中以靶分子作为主要配体的产物配合物。因此，本发明还提供了包括将标记物和/或载体连接至靶分子的用途和方法。还提供了通过本发明的标记和/或载体连接方法获得的产品及其用途。本发明还涉及生产本发明配合物的方法和包含用于生产本发明配合物的组分的试剂盒。
背景技术：
：：2.近年来，化学修饰的蛋白质成为许多生物学应用中非常重要的工具。生命科学研究中的多种生化和细胞技术，例如基于荧光的测定、蛋白质印迹和蛋白质纯化，都依赖于标记的或固定化的蛋白质。而且对于生物制药(例如抗体-药物偶联物、聚乙二醇化和脂化)、医学诊断，包括生物传感器、生物成像和甚至医学工程的发展而言，蛋白质的缀合是关键的生产步骤。因此，在所有应用领域中，都需要一种简单、稳定、位点特异性、且不妨碍蛋白质功能的修饰方法。此外，其他生物分子如核酸也经常被标记或连接到载体上。3.在经典的标记/固定程序中，小分子通过例如n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)衍生试剂或马来酰亚胺，以快速有效的方式，共价连接到未修饰的目标蛋白质中的反应基团(例如赖氨酸中的伯胺或半胱氨酸中的硫醇)上(chenandwu,2016)。然而，由于蛋白质中这些反应位点的遍在可得性，所有这些方法都具有内在的缺点。因此，对这些标记反应的控制是有限的，导致巨大的批次间差异，缺乏位点特异性、不均一的固定/标记化学计量，甚至是蛋白质功能的失稳定和丢失(lindhoud等，2012)。为了解决这个问题，近年来开发了几种位点特异性蛋白质缀合的新技术。4.最突出的是avi标签系统，其中生物素部分通过生物素连接酶bira的酶催化作用定点地连接到短肽标签上(tirat等，2006)。此外，在其他方法中，诸如分选酶(popp等，2007)、转谷氨酰胺酶(lin和ting，2006)、硫辛酸连接酶(fernandez-suarez，m.等，2007)和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phospho-pantheinyl-transferases)(yinetal.,2005)等酶，也用于催化蛋白质通过短识别肽标签的定向缀合。5.另一种方法是，借助非天然氨基酸，通过核糖体并入生物正交官能团(例如tetratines、炔烃、叠氮化物或降冰片烯)，来扩展遗传密码(ou等人，2011年；deiters等人，2003年；lang等人，2012年)。使用特定的连接化学，可以非常精确地在并入的基团上修饰靶蛋白质。6.作为非天然氨基酸的替代，在蛋白质表面具有独特反应性和低丰度的常规氨基酸可用于位点特异性标记。在这种情况下，大多数方法都使用工程化的半胱氨酸取代，这些取al.,2007)。12.使用涉及氧化步骤的该间接多步骤制备方法产生的基于co3 的his标签蛋白配合物，也已经被用于将蛋白质固定在表面上(wegner等人，2016年；dirusso等人，2018年)。然而，在表面固定的情况下，该方法会使用强氧化剂h2o2，这可能会对蛋白质功能产生负面影响，也可能会干扰某些表面结构。13.与上述文献类似，ep0497585a2也仅是在[co(ii)(ida)(his-蛋白质)]配合物形成后将co2 氧化成co3 。该[co(ii)(ida)(his-蛋白)]配合物与o2气体接触数小时以促进co2 氧化为co3 。然而，本领域已知，不稳定蛋白质可能因暴露于高浓度氧气数小时而受到损害。此外，本发明人无法重现所述方法，即，在[co(ii)(nta)(his-蛋白)]配合物与o2气体接触后，没有观察到稳定的配合物。[0014]zatloukalová和kucerová提出了一种形成[co(iii)(ida)(his-tag)(h2o)]配合物的方法，其中可以避开在蛋白质存在时进行氧化(zatloukalová和kucerová，2006)。在此过程中，co2 中心在与ida的预配合物中被过氧化氢氧化为co3 ，随后生成的[co(iii)(ida)(h2o)3] 与带有his标签的蛋白质配位形成最终的[co(iii)(ida)(his-tag)(h2o)]配合物(参见图2b的反应示意图；zatloukalová和kucerová，2006)。然而，该方法仍然具有主要缺点。与具有水配体的基于co2 的预配合物相比，具有水配体的基于co3 的预配合物配位明显更慢，并且如本发明人在所附实施例中所证明的，最终的配合物形成效率也低，尤其是在大多数蛋白质所需的低温下时。此外，在存在ida-缀合物的情况下使用过氧化氢仍会由于氧化作用而对缀合物(即连接到ida缀合物上的标记物和/或载体)的功能产生负面影响。例如，荧光团的荧光会因氧化而降低。此外，该方案需要从过氧化氢中纯化经氧化的预配合物，以用于进一步的下游应用。这些纯化过程既费时又费物，并且存在残留氧化剂的风险，这些残留氧化剂可能会氧化和破坏在下游应用中待修饰的蛋白质。[0015]因此，本发明的技术问题是提供改进的手段和方法，允许以简单有效并防止干扰标记物/载体和靶分子的功能和/或稳定性的方式，通过配合物形成，将标记物和/或载体连接到靶分子，例如蛋白质。[0016]该技术问题通过提供权利要求中表征的并且如下文提供的实施方案得以解决。[0017]发明概述[0018]在第一方面，本发明提供配合物形式的化合物，其包含：[0019]a)金属阳离子；[0020]b)金属阳离子配体，其为选自co32-和hco3-的碳酸根；和[0021]c)包含螯合配体和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0022]本发明人惊奇地发现，本发明的配合物是用于将标记物和/或载体连接到靶分子例如带his标签的蛋白质的有利工具。标记通过在配合物的主要配位层(primarycoordinationsphere)中使配合物的金属阳离子配体与靶分子交换而实现。通过这种交换，形成新配合物，所述新配合物具有(包含螯合配体和标记物和/或载体的)金属阳离子螯合域作为第一配体以及靶分子作为第二配体。如使用包含过渡金属阳离子co3 或pt4 的本发明配合物的所附实施例中举例说明的，本发明的配合物允许以动力学惰性方式将标记物和/或载体连接至靶分子。因为组氨酸残基是可以参与金属配合物形成的配体，尤其是与过渡金属如co3 形成配合物，因此，优选的靶分子是带有his标签的蛋白质或具有富含组氨酸区域的蛋白质。组氨酸标签可作为双齿和/或多齿配体发挥作用。[0023]本发明配合物的一个优点是，使用h2o2的氧化反应对于其中存在标记物和/或载体的配合物的生产步骤来说不是必需的，对于将标记物和/或载体连接到靶分子也不是必需的。避免氧化步骤如h2o2处理具有优点，即，可以实现标记物和/或载体的连接而不会因氧化作用而干扰靶分子、标记物和/或载体的功能。这使得由该金属配合物介导的标记和/或载体连接具有更广泛的适用性，尤其是适用于对氧化敏感的靶分子，如蛋白质。此外，它还消除了采用繁琐和耗时的洗涤步骤来去除氧化剂的必要性。[0024]对于具有低的配体交换速率的co(iii)或其他过渡金属配合物，没有任何中间步骤的直接配合物形成极其缓慢且效率低下。因此，目前用于形成这些动力学惰性配合物的现有技术方法集中在两步骤方法上。首先形成具有处于动力学不稳定的氧化状态的金属中心(例如co(ii))的配合物，然后是通常使用过氧化氢的氧化过程。这种氧化过程可导致蛋白质、金属结合域和/或载体的不可预见的功能破坏。[0025]为了克服这些局限性，本发明描述了一种直接形成动力学惰性的配合物的方法。直接以处于所需氧化状态的金属开始，可以避免在蛋白质、金属结合域或蛋白质存在下使用氧化试剂。选择的金属被引入金属结合域，与三个金属阳离子配体(碳酸根或硝酸根)预配位。第一步，两个金属阳离子配体被金属阳离子螯合域替换，之后，最后一个金属阳离子配体通过蛋白质的配位而被替换。金属与碳酸根或硝酸根的预配位可以促进最终配合物的形成，导致配合物形成速度显著更快，且配合物形成效率更高。该改进的直接配合物形成方法，使用具有配位的碳酸根或硝酸根配体的预配合物进行，这源于这些金属阳离子配体在从预配合物释放后质子化的能力。在碳酸根的情况下，配体释放后的质子化会导致气体形成，这可进一步增强该形成过程。因此，如本发明人所证明的，与使用其他配体(包括水)相比，使用碳酸根或硝酸根预配合物，可以显著更快和更有效地直接形成动力学惰性的金属配合物。如所附实施例中所示，本发明的手段和方法尤其涉及，包含和/或由金属阳离子、碳酸根(作为金属阳离子配体；co32-或hco3-)和金属阳离子螯合域组成的新型富有创造性的配合物，其中金属螯合域包含螯合配体以及标记物和/或载体。从本文的公开内容以及从所附实施例中显而易见的是，也可以使用采用“硝酸根”替代“碳酸根”(co32-或hco3-)的相应配合物。因此，本发明也可以基于相应的“硝酸根配合物”。因此，本文描述的是相应的“碳酸根配合物”以及“硝酸根配合物”。在本发明的上下文中，碳酸根和硝酸根可以被认为是等同物，因为这两种金属阳离子配体在从相应的预配合物释放后都可以被质子化。在本发明的上下文中，碳酸根配合物对于本文提供的手段和方法是优选方案。进一步的细节在下文中提供。[0026]在上述wegner和spatz(loc.cit)以及zatloukalová和kucerová(loc.cit)的现有技术中，描述了通过形成co3 介导的配合物来标记蛋白质的方法。然而，与本发明相反，这些方法都涉及使用h2o2的氧化步骤(见图2a和b)。该氧化步骤是有害的处理，会对标记物(例如荧光团)和/或载体和待标记蛋白质的稳定性和功能产生负面影响(参见所附实施例)。本发明的配合物允许规避这些现有技术方案中的氧化步骤。此外，本发明的配合物可以快速有效地配位金属结合性靶分子，优选带有his标签的蛋白质或具有富组氨酸区域的蛋白质，从而使标记物和/或载体可以通过金属阳离子介导的相互作用而连接到靶分子上。在终产物中标记物和/或载体以类似于wegner和spatz以及zatloukalová和kucerová所述的动力学惰性方式连接到靶分子上。靶分子的结合是通过金属阳离子配位配体与靶分子交换以形成新的配合物(在此称为“产物配合物”)来实现的。通过将金属配位配体选择为选自co32-和hco3-的碳酸根或硝酸根，本发明人发现，可以非常有效和快速地形成“产物配合物”，其中所述产物配合物包含含标记物/载体的金属阳离子螯合域以及与金属阳离子配位的靶分子。尤其是，本发明人发现，与采用水作为金属阳离子配体的配合物(如zatloukalová和kucerová的方法中所述)相比，尤其是在低温下，靶分子的结合更完全和更快。因此，本发明的配合物可以更快且更完全地将标记物和/或载体连接至靶分子(例如，带his-标签的蛋白质)。总之，本发明配合物的一个主要优点是，该配合物允许快速有效的连接，同时不需要在存在标记物和/或载体的情况下使用氧化剂。[0027]本发明的配合物或包含其的组合物在许多应用中特别有用，包括但不限于，用荧光团、毒素、诊断部分、靶向部分、稳定结构域和/或反应基团标记蛋白质。使用本发明配合物，特别是还可以制造生物药物，例如毒素标记的抗体和诊断剂。该标记在动力学上是惰性的(即配体交换速率为10-1s-1或更低)，因此可以防止配体交换，这样的配体交换是基于ni2 或co2 的配合物的常见问题。此外，与基于ni2 或co2 的配合物相比，该标记在热力学上更稳定。[0028]本发明的配合物还可用于实现靶分子，优选蛋白质，与载体的稳定连接。例如，载体可以是表面、珠子、纳米颗粒、辅基(prosthetic)、量子点、聚合物、水凝胶、微粒、球体(例如纳米球体和/或微球体)或其组合。例如，实施例19证明，带his标签的gfp可以连接到金纳米结构的玻璃表面。首先，金纳米结构的玻璃表面通过偶联nta-接头-硫醇试剂，借助于金颗粒与该硫醇基团的相互作用，从而被nta官能化。随后，在表面上产生本发明的配合物并连接his-gfp(图21)。此外，在非限制性实施例20中显示，带his标签的gfp可与通过接头偶联本发明配合物的生物素基团连接。包含生物素基团、接头、本发明的配合物和带his标签的gfp的产物，随后与包含链霉亲和素基团的珠子偶联(图22)。[0029]所附实施例表明，使用本发明的配合物可以将广泛多种(带his标签的)蛋白质偶联到珠子上。对于一种测试的蛋白质(分选酶a)，已经证明，酶活性在固定化后被保留(实施例14，图16c)。还证明，抗体可以使用抗体fc区的富含组氨酸区域，通过本发明的配合物，偶联到珠子上。如图16d所证实，固定化的抗体可以保留结合其抗原的能力。[0030]本发明的配合物可以实现快速有效的金属阳离子介导的靶分子标记或载体与靶分子的连接，而无需如wegner和spatz以及zatloukalová和kucerová描述的在待标记的靶分子和/或所述标记物和/或载体存在下进行氧化步骤，这使其特别适用于上述应用，在这些应用中，避免靶蛋白和/或标记物和/或载体的氧化通常是至关重要的。[0031]本发明的配合物可以在溶液中提供或以固体形式提供。本发明的配合物可以带有电荷，尤其是当在溶液中提供时。电荷将取决于金属阳离子、金属阳离子配体和金属阳离子螯合域的电荷。例如，如果配合物包含co3 作为金属阳离子、co32-作为金属阳离子配体、以及由螯合配体nta和不带电荷的标记物组成的金属阳离子螯合域，则该配合物具有电荷“2‑”(即二价负电荷)。也可以提供具有抗衡离子的配合物。当配合物进一步包含一个或多个抗衡离子时，配合物也可以作为固体提供。所述(一个或多个)抗衡离子优选为一价离子。特别优选的是来自碱金属的一价离子。当配合物带负电荷时，最优选na 和k 作为抗衡离子。[0032]本发明配合物的金属阳离子螯合域(其可替代地称为第一配体或螯合剂)包含螯合配体。所述螯合配体通过提供至少两个可以与配合物的金属阳离子配位的结合位点(即，1984)。[0036]因此，c)的金属阳离子螯合域中包含的螯合配体可以例如选自以下非限制性列表：次氮基三乙酸(nta)、亚氨基二乙酸(ida)、三(羧甲基)乙二胺(ted)、螯合肽，例如具有共有氨基酸序列(ghhph)ng的肽，其中g是甘氨酸，h是组氨酸，p是脯氨酸，n是1至3的整数；也参见seqidno：1至3)或cadystin、三氮杂环壬烷(tacn)、二亚乙基三胺-五乙酸(dtpa)、植物螯合素(phytochelatin)、羧甲基天冬氨酸(cma)、膦酸盐、单宁酸(ta)、卟啉、联吡啶胺(dpa)、植酸，次氮基丙酸二乙酸(npda),次氮基异丙酸二乙酸(nipda),n-(羟乙基)乙二胺三乙酸(hedta),1,4,7,10-四氮杂环十二烷-n,n',n",n"'-四乙酸(dota),1,4,7-三(羧甲基)-10-(2'-羟丙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷,1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(nota),1-(1,3-羧基-丙基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-4,7-二乙酸(nodaga),1,4,8,11-四氮杂环十四烷-n,n',n",n"'-四乙酸(teta)、乙二半胱氨酸、乙二胺四乙酸(edta)、1,2-二氨基环己烷-n,n,n',n'-四乙酸(dact)、双(氨基乙硫醇)羧酸、亚乙基双(氧亚乙基-次氮基)四乙酸(egta)、三亚乙基四胺-六乙酸(ttha)、1,4,7-三氮杂环壬烷次膦酸(trap)、脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)、嘌呤、嘧啶及其衍生物。[0037]所有这些螯合配体的共同点是，它们提供至少两个配位位点，可以充当路易斯碱供体，从而与金属阳离子形成配位螯合物(即螯合剂)。因此，在一个实施方案中，螯合配体可具有至少2、3、4、5或更多个可与金属阳离子配位的化学基团，即它们可充当路易斯碱。[0038]在一个优选的实施方案中，c)的金属阳离子螯合域的螯合配体选自：次氮基三乙酸(nta)、亚氨基二乙酸(ida)、具有共有序列(ghhph)ng的螯合肽，其中n为1至3；也参见seqidno：1至3)、二亚乙基三胺-五乙酸(dtpa)、次氮基丙酸二乙酸(npda)、次氮基异丙酸二乙酸(nipda)、乙二胺四乙酸(edta)、亚乙基双(氧亚乙基-次氮基)四乙酸(egta)、羧甲基天冬氨酸(cma)及其衍生物。[0039]在另一优选的实施方案中，螯合配体可以是氨基多羧酸。优选地，氨基多羧酸选自乙二胺-四乙酸(edta)、次氮基三乙酸(nta)、亚氨基二乙酸(ida)、亚乙基双(氧亚乙基-次氮基)四乙酸(egta)、二亚乙基三胺-五乙酸(dtpa)、和三亚乙基四胺-六乙酸(ttha)、三(羧甲基)乙二胺(ted)、三氮杂环壬烷(tacn)或其衍生物。[0040]在一个特别优选的实施方案中，c)的金属阳离子螯合域的螯合配体包含或选自nta、ida、talon及其衍生物。最优选nta和ida作为螯合配体，特别最优选ida。nta是四齿配体，因此与金属阳离子的结合特别强。ida是三齿的，也能强烈地结合金属阳离子，但比nta弱。与金属阳离子的强结合防止金属阳离子的释放，所述释放将导致配合物的不希望的解体或标记物和/或载体从靶分子的释放。在某些实施方案中，ida是优选的，因为具有高稳定性百分比的配合物可以比具有nta的配合物更快地形成。推测对于三齿金属结合域，蛋白质的配位得到进一步促进，因为第二金属阳离子配体可仍然保持与金属的半配位，而在使用四齿金属结合域时它被完全置换掉。由于部分配位，该配体可以容易地被蛋白质的一个组氨酸残基置换。而随着此刻的靠近，一个或两个另外的组氨酸残基也可以释放出最后的配体并形成稳定的配合物。[0041]在螯合配体的上下文中，术语“衍生物”是指具有相同先导结构但可以被其他化学反应性基团取代的化合物。优选地，本文中的术语“衍生物”包括被一个或多个选自羧基、胺、叠氮化物、丙烯酸酯、马来酰亚胺、羟基、硫醇、芳族、脂族、二硫酸酯和乙烯基砜基团的 ,la3 ,eu3 ,os2 ,pd4 ,mo3 ,fe3 ,ru2 ,gd3 ,tc3 ,re3 ,sm3 ,tb3 ,ce3 ,pr3 ,nd3 ,pm3 ,dy3 ,ho3 ,er3 ,tm3 ,yb3 ,lu3 ,v2 ,mn4 和fe2 。本领域技术人员知晓，这些金属阳离子具有非常低的水配体交换速率的特征。本发明人发现，特别是这种具有低水配体交换速率的金属阳离子是有用的金属阳离子，可用于在通过温育本发明配合物与靶分子形成的产物配合物中介导含有标记物和/或载体的金属阳离子螯合域与靶分子之间的相互作用。这是因为这些金属有利于热力学稳定且动力学惰性的产物配合物中非常稳定的相互作用。[0051]在一个优选的实施方案中，金属阳离子选自：co3 ,pt4 ,cr3 ,rh3 ,ir3 ,ir4 ,pt2 ,pd4 ,mo3 ,fe3 ,gd3 ,tb3 ,eu3 ,ru2 ,la3 ,ru3 ,re3 ,re4 ,os2 ,v2 ,mn4 ,fe2 。这些金属阳离子已在文献中描述，具有10-1s-1或更低的水配体交换速率和/或为动力学惰性金属阳离子：co3 (lippard和berg1994),cr3 (helm和merbach2002；helm和merbach,1999),rh3 (aebischeretal.1993；helm和merbach,1999),ir3 (cusanellietal.1996；helm和merbach,1999),ir4 (saitoetal.1990),pt2 (helmetal.1984；helm和merbach,1999),pt4 (giandomenicoetal.1995),pd4 (saitoetal.1990),mo3 (saitoetal.1990),fe3 (harringtonetal.2018),gd3 (caravanetal.2001),tb3 (junkeretal.2018),eu3 (morrow和chin1993),ru2 (hugi-clearyetal.1987；helm和merbach,1999),la3 (morrow和chin1993),ru3 (hugi-clearyetal.1987；helm和merbach,1999),re3 (house和house,2015),re4 (saitoetal.1990)和os2 (livingstone,1973),v2 (house和house,2015),mn4 (house和house,2015),fe2 (house和house,2015)。因此，这是合理的，这些金属阳离子可以与靶分子形成类似稳定的产物配合物，从而使标记物和/或载体稳定地连接到靶分子上。[0052]在本发明的上下文中，“动力学惰性金属阳离子”是指具有10-1s-1或更低的水配体交换速率的金属阳离子。这个定义和截断值也符合文献中对这种表述的普遍理解(taube，1952；lutheriii，2016)。用于测量水交换速率的优选方法在本文别处提及。[0053]当在金属配合物中配体(例如“产物配合物”中的靶分子)结合的上下文中使用时，“动力学惰性”，如本文所用，优选是指水溶液中的配体交换速率为10-1s-1或更低，甚至更优选10-2s-1或更低。测量配体交换速率的方法是本领域已知的。例如，可以比照使用如本文别处描述的用于测量水交换速率的方法。根据本发明，用于确定配体交换速率和/或评估在“产物配合物”中靶分子结合的动力学惰性的测定试验，可以包括测量与竞争性配体(例如咪唑或edta)和/或与还原剂(例如dtt)的竞争，如所附实施例和附图(参见例如图1、6和7b)中所述。用于评估靶分子与配合物(即“产物配合物)结合的“动力学惰性”的优选测定试验，可以通过如实施例5中示例性描述的方法来评估。具体地，以nta连接到琼脂糖珠的[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物可以如本文和所附实施例和附图中所述产生。随后，该珠子结合的[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物可以与靶分子一起温育，以形成固定在琼脂糖珠上的[co(iii)(nta)(靶蛋白)]“产物配合物”。随后，[co(iii)(nta)(靶蛋白)]配合物的化学稳定性，可以通过用pbs(＝对照)或咪唑溶液(补充250mm咪唑的pbs)(＝样品)洗涤等量的产生的琼脂糖珠来评估。可选地，可以采用基于ni2 -nta的常规基质作为比较。然后可以针对所有样品评估结合的靶分子的量(可选地在洗涤之前和之后)。确定靶分子存在(即读出)的方法取决于靶分子的特性并且是本领域已知的。例如，该测定可涉及荧光测量(例如，当靶分子具有荧光时)。对于非荧光靶分子，检测靶分子的荧光抗体可用于读出。读出的另一个例子是，当靶分子是酶或当使用针对靶分子的酶标记的抗体时，使用酶学反应。在本发明的上下文中，当相对于结合在pbs洗涤的珠粒上的靶分子的量(＝对照)，250mm咪唑洗涤的珠粒(＝样品)在洗涤后含有至少约30％、至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，优选约85％，甚至更优选至少约90％，甚至更优选约95％，最优选至少约99％的靶分子时，优选地，靶分子配体被认为在“产物配合物”中是“动力学惰性”结合的。[0054]在一个实施方案中，金属阳离子可以是co3 或cr3 。在一个特别优选的实施方案中，金属是co3 。如所附实施例中所证明的，co3 特别适合并且允许快速且容易地产生本发明的配合物并确保与靶分子的动力学惰性结合。[0055]在另一个优选的实施方案中，金属是pt4 。如所附实施例中所证明的，pt4 特别适合并且允许快速且容易地产生本发明的配合物并确保与靶分子的动力学惰性结合。[0056]本发明还涉及一种配合物，其中金属阳离子为co3 ，金属阳离子螯合域的螯合配体为nta(或其衍生物)。[0057]本发明还涉及一种配合物，其中金属阳离子为co3 ，金属阳离子螯合域的螯合配体为ida(或其衍生物)。[0058]本发明还涉及一种配合物，其中金属阳离子为co3 ，金属阳离子螯合域的螯合配体为talon(或其衍生物)。[0059]本发明还涉及一种螯合物，其中金属阳离子为pt4 ，金属阳离子螯合域的螯合配体为nta(或其衍生物)。[0060]本发明还涉及一种配合物，其中金属阳离子为pt4 ，金属阳离子螯合域的螯合配体为talon(或其衍生物)。[0061]本发明还涉及一种配合物，其中金属阳离子为pt4 ，金属阳离子螯合域的螯合配体为ida(或其衍生物)。[0062]因此，本发明涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0063]a)co3 ；[0064]b)金属阳离子配体，其为选自co32-和hco3-的碳酸根或硝酸根；和[0065]c)包含nta和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0066]本发明还涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0067]a)co3 ；[0068]b)co32-或hco3-配体；和[0069]c)包含nta和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0070]本发明还涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0071]a)co3 ；[0072]b)co32-或hco3-配体；和[0073]c)包含talon和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0074]本发明还涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0075]a)co3 ；[0076]b)co32-或hco3-配体；和[0077]c)包含ida和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0078]本发明还涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0079]a)pt4 ；[0080]b)co32-或hco3-配体；和[0081]c)包含nta和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0082]本发明还涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0083]a)pt4 ；[0084]b)co32-或hco3-配体；和[0085]c)包含ida和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0086]本发明还涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0087]a)pt4 ；[0088]b)co32-或hco3-配体；和[0089]c)包含talon和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0090]在一个实施方案中，金属阳离子螯合域的螯合配体是二亚乙基三胺-五乙酸(dtpa)并且金属阳离子选自gd3 ,in3 ,和fe3 。在一个实施方案中，金属阳离子螯合域的螯合配体是单宁酸(ta)并且金属阳离子是co3 。在一个实施方案中，金属阳离子螯合域的螯合配体是联吡啶胺(dpa)并且金属阳离子是co3 。在一个实施方案中，金属阳离子螯合域的螯合配体是1,4,7-三氮杂环壬烷次膦酸(trap)并且金属阳离子是ga3 。在一个实施方案中，金属阳离子螯合域的螯合配体是乙二半胱氨酸并且金属阳离子是re3 或tc3 。在一个实施方案中，金属阳离子螯合域的螯合配体是三亚乙基四胺-六乙酸(ttha)并且金属阳离子选自gd3 ,in3 和fe3 。在一个实施方案中，金属阳离子螯合域的螯合配体是1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(nota)并且金属阳离子是in3 。在一个实施方案中，金属阳离子螯合域的螯合配体是1-(1,3-羧基-丙基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-4,7-二乙酸(nodaga)并且金属阳离子是in3 。[0091]本发明配合物的金属阳离子配体(也可称为第二配体)选自碳酸根co32-和hco3-或硝酸根。本发明人已经发现，使用这些金属阳离子配体有利于靶分子的配位。这是通过从配合物中更快、更容易地将碳酸根或硝酸根交换为靶分子来实现的。从配合物释放后，碳酸根和硝酸根都可以质子化。这种质子化促进自配合物的释放。在碳酸根的情况下，co32-和hco3-的质子化甚至会导致气体形成。不受理论的束缚，据信气体形成进一步增加碳酸根配体与靶分子交换的交换动力学和热力学。因此，碳酸根co32-和hco3-是特别优选的金属阳离子配体。硝酸根也可用作金属阳离子配体，但这是不同的发明。[0092]在一个优选的实施方案中，金属阳离子配体是选自co32-和hco3-的碳酸根。在所附实施例中证明，这些碳酸根促进具有靶分子的产物配合物形成。换言之，本发明的配合物在将标记物和/或载体连接到靶分子方面更具反应性。[0093]在一个具体实施方案中，本发明的配合物包含[co(iii)(nta)co3]2-配合物、[co(iii)(nta)hco3]-配合物或其水合物。标记物和/或载体连接在nta上。在这些配合物中，nta占据了四个配位点，碳酸根占据了两个配位点。碳酸根是双齿配体，即有两个原子可以作为供体(即路易斯碱)与配合物中的金属阳离子配位，其促进靶分子的结合。nta是一种螯合剂，由于其四齿结合，与金属阳离子的结合特别强。因此，nta可以阻止由不希望的金属阳离子释放导致的不期望的配合物和产物配合物分解。[0094]在一个优选的实施方案中，本发明的配合物包含[co(iii)(ida)co3]-配合物、[co(iii)(ida)hco3]配合物或其水合物。标记物和/或载体连接在ida上。在这些配合物中，ida占据了三个配位点，碳酸根占据了两个配位点。碳酸根是双齿配体，即有两个原子可以作为供体(即路易斯碱)与配合物中的金属阳离子配位，其促进靶分子的结合。推测对于三齿金属结合域，蛋白质的配位可以得到额外促进，因为第二金属阳离子配体可以仍然与金属保持半配位，而在使用四齿金属结合域时其会被完全置换下来。由于部分配位，该配体可以容易地被蛋白质的一个组氨酸残基置换。由于此刻的靠近，另外的一个或两个组氨酸残基可以释放出最后的配体并形成稳定的配合物。[0095]本发明配合物的金属阳离子螯合域包含标记物和/或载体。换言之，本发明的配合物包含功能性部分。优选标记物和/或载体不同于螯合配体的配位基团，即不共享相同的原子。然而，在一些实施方案中，螯合配体和标记物和/或载体也可以共享一个或多个原子。[0096]本发明配合物的金属阳离子螯合域可包含螯合配体和标记物，但不含载体。或者，本发明配合物的金属阳离子螯合域可包含螯合配体和载体，但不包含标记物。在另一个实施方案中，本发明配合物的金属阳离子螯合域可包含载体和标记物。[0097]在一个具体实施方案中，金属阳离子螯合域还可在螯合配体与标记物和/或载体之间包含接头。这种接头可以促进配合物的形成和/或在标记物和/或载体与螯合配体之间建立限定的距离。接头原则上可以是任何适合以所需距离将标记物/载体与螯合配体共价连接的化学连接。本领域技术人员可以根据该键对预期用途的环境和条件的耐受性，依据需要来选择接头。接头可以例如包括抗体-药物偶联物(adc)接头、带负电荷的砜基团、聚乙二醇(peg)、焦磷酸二酯、基于肽的接头(例如组织蛋白酶b-反应性接头，例如val-cit-pabc或val-ala-pabc；其中cit是指l-瓜氨酸，pabc是指对氨基苄氧羰基)、腙、含二硫化物的接头、含硫醚的接头、β-葡糖苷酸或其组合。在一个实施方案中，接头可是抗体-药物偶联物(adc)接头、带负电荷的砜基团、焦磷酸二酯、基于肽的接头(例如组织蛋白酶b-反应性接头，例如val-cit-pabc或val-ala-pabc)、腙、含二硫化物的接头、含硫醚的接头、β-葡糖苷酸、核酸接头(优选dna)或其组合。抗体-药物偶联物(adc)接头是本领域已知的。可以在本发明的上下文中使用的示例性adc接头例如描述于tsuchikama和an；2018，adc_review2019；和/或jain等人，2015年，所有这些通过引用整体并入本文。基于带负电荷的砜基团的接头也是本领域已知的。可以在本发明的上下文中使用的具有带负电荷的砜基团的示例性接头在zhao等人，2011中进行了描述，该文献通过引用整体并入本文。peg接头是本领域已知的。可以在本发明的上下文中使用的示例性peg接头在lyon等人，2015中进行了描述，其通过引用整体并入本文。焦磷酸二酯接头是本领域已知的。可以在本发明的上下文中使用的示例性焦磷酸二酯接头描述于kern等人，2016年，其通过引用整体并入本文。基于肽的接头(例如组织蛋白酶b反应性接头，例如val-cit-pabc或val-ala-pabc)是本领域已知的。dubowchik等人，2002和/或hartley,2011中描述了可用于本发明上下文中的示例性基于肽的接头(例如组织蛋白酶b反应性接头，例如val-cit-pabc或val-ala-pabc)，所述文献的全部内容以引用方式并入本文。腙接头是本领域已知的。可用于本发明上下文中的示例性腙在tolcher等人，1999中进行了描述，该文献通过引用整体并入本文。含有二硫化物的接头是本领域已知的。可以在本发明的上下文中使用的示例性含二硫化物的接头在saito等人，2003中进行了描述，该文献通过引用整体并入本文。含有硫醚的接头是本领域已知的。可以在本发明的上下文中使用的示例性含硫醚的接头描述于stenton等人，2018年，其通过引用整体并入本文。β-葡糖苷酸接头是本领域已知的。可以在本发明的上下文中使用的示例性β-葡糖苷酸接头在jeffrey等人，2010中进行了描述，其通过引用整体并入本文。核酸接头，例如dna接头是本领域已知的。[0098]金属阳离子螯合域的标记物可以包含或由以下组成：荧光团、诊断剂、靶向部分、治疗剂、聚乙二醇(peg)分子、脂质、生物素(和/或其衍生物，例如,光敏生物素(photobiotin)：n-(4-叠氮基-2-硝基苯基)-氨基丙基-n'-(n-d-生物素酰基-3-氨基丙基)-n'-甲基-1,3-丙二胺(forsteretal.,1985),蛋白质(例如抗体)、肽或毒素。标记物还可以包含反应基团或由反应基团组成，优选选自硫醇基团或适用于点击化学(clickchemistry)的反应基团。适用于点击化学的反应基团的非限制性实例是叠氮化物、炔烃、硝酮、四嗪和四唑。本文别处提到的术语“衍生物”的定义在此比照适用。[0099]标记物可包括可直接检测的功能性部分(例如荧光、生色、电子致密、化学发光和放射性标记物)，以及可间接检测的部分，例如酶或配体，例如通过酶促反应或分子相互作用检测。[0100]示例性标记物包括但不限于，放射性同位素32p,14c,125i,3h,和131i(优选这些原子不形成螯合配体的一部分)、荧光团、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(与使用过氧化氢来氧化染料前体如hrp的酶结合使用)、乳过氧化物酶(lactoperoxidase)或微过氧化物酶(microperoxidase)、生物素/亲和素、自旋标记、噬菌体标记、稳定的自由基等。在另一个实施方案中，标记物是正电子发射体。正电子发射体包括但不限于，68ga,18f,64cu,86y,76br,89zr,和1241。在一个特定实施方案中，正电子发射体是89zr。[0101]在一个实施方案中，所述标记物是对氧化剂(优选h2o2)处理敏感的标记物。“对氧化剂敏感”在本文中是指在氧化剂处理后，标记物显示出降低的功能/活性(例如，在荧光团的情况下，荧光)和/或稳定性。优选地，氧化剂处理是用20mmh2o2溶液处理并且标记物在至少0.5h、1h、2h或24h的处理之后是敏感的。在优选的氧化剂敏感性测试中，温育可以在20mmh2o2溶液中进行至少1小时，例如恰好1小时，正如wegner和spatz，2013年中对氧化步骤所描述的。或者，该测试可以在0.05％(v/v)h2o2溶液中进行至少90分钟，例如恰好90分钟，如zatloukalová和kucerová的氧化步骤所述。为了缩短测试时间，还可以使用具有更高h2o2浓度的溶液，例如1％(v/v)h2o2。优选的h2o2浓度和温育时间，包括可用于评估h2o2敏感性的时间过程实验，在所附实施例中描述。用于测量氧化剂敏感性的测定试验包括，用包含氧化剂(例如h2o2)的溶液(在所需的氧化剂浓度下，优选在水溶液中，甚至更优选在水中)温育，并在处理之前和处理期间的不同时间点，测量指示标记物功能/活性和/或稳定性的读出(例如，对于荧光团，测量发射的荧光)。当读出测量值表明标记物功能/活性和/或稳定性丧失时，标记物被认为是“氧化敏感的”。评估标记物功能/活性和/或稳定性丧失的优选时间点是，在如上所述所使用的氧化剂存在下将co2 氧化为co3 所需的时间。在评估h2o2敏感性时，优选的h2o2浓度和温育时间是在本段落中上面指出的。在所附实施例中描述了用于测试荧光团标记物的氧化敏感性的示例性方法。本领域技术人员可以根据所使用的标记物来修改该测定，并适应性地调整参数如h2o2浓度和温育时间。[0102]在一个实施方案中，标记物可以包括荧光团或可以由荧光团组成。荧光团是本领域已知的并且是公众可获得和/或商业可得的。将荧光团偶联到金属阳离子螯合域的螯合配体的方法也是本领域已知的。如所附实施例所示，许多荧光团(例如荧光素、fitc、atto488和alexa488)对h2o2处理敏感。这种敏感性使得本发明的配合物特别适合在荧光团作为标记物的情况下使用。然而，这种优势并不限于荧光团。在一个实施方案中，金属结合域可以包含荧光团作为标记物并且螯合配体可以是nta。在一个实施方案中，金属结合域可以包含荧光团作为标记物并且螯合配体可以是ida。[0103]在一个实施方案中，荧光团可以是荧光素、fitc、atto488和alexa488。如所附实施例中所证明的，这些荧光团对h2o2处理敏感。[0104]在一个实施方案中，本发明的配合物，更具体地标记物和/或载体，可以不是或不包含如shao等人所述的卟啉-磷脂(邵等人，2015年)。[0105]在本发明上下文中，术语“标记物”不包括作为金属阳离子螯合域的螯合配体的一部分的单原子，例如氢原子。优选地，标记物涉及包含至少两个原子、至少三个或至少10个原子的结构。[0106]优选地，标记物是功能性部分和/或可以用本领域已知的方法(例如nmr、荧光测量、酶学测定法等)检测的部分。[0107]如上所述，金属结合域可包含载体(任选地还有标记物)。根据本发明的载体的非限制性实例是聚合物、水凝胶、微粒、纳米颗粒、球体(例如纳米球或微球)、珠子(例如微珠)、量子点、辅基和固体表面。在一个实施方案中，载体可以包括或者是纳米图案化的金表面。这种纳米图案化的金表面可以用硫醇残基进行官能化。[0108]本领域技术人员知晓，将螯合配体连接/固定在载体上以形成包含螯合配体和载体的金属结合域的技术。例如，如果螯合配体是氨基多羧酸(例如nta)，则螯合配体可以例如通过羧酸基团或氨基基团中的至少一个与固相共价结合。在另一个实施方案中，螯合配体可以通过酰胺键或酯键连接到载体上。[0109]在一个优选的实施方案中，载体是珠子(例如微珠)，例如琼脂糖珠。因此，本发明涉及，具有连接在其上的本发明配合物(没有标记物和/或载体)的珠子(例如微珠)。这些珠子也可以称为亲和基质。这种具有本发明配合物的珠子是一种即用型试剂，可以用于将靶分子连接到珠子上(即，将靶分子固定到珠子上)。[0110]因此，本发明涉及一种配合物(例如用于将靶分子连接到珠子的配合物)，其包含：[0111]a)co3 ；[0112]b)金属阳离子配体，其为选自co32-和hco3-的碳酸根或硝酸根；和[0113]c)包含nta和珠子的金属阳离子螯合域。[0114]优选地，本发明涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0115]a)co3 ；[0116]b)co32-或hco3-配体；和[0117]c)包含nta和珠子的金属阳离子螯合域。[0118]更优选地，本发明涉及一种配合物(例如用于将标记物和/或载体连接到靶分子的配合物)，其包含：[0119]a)co3 ；[0120]b)co32-或hco3-配体；和[0121]c)包含ida和珠子的金属阳离子螯合域。[0122]此类配合物可如所附实施例中所述产生。例如，nta琼脂糖树脂(qiagen,1022963)可以用10个珠体积的ddh2o洗涤一次，用3个珠体积的100mmedtaph7.5洗涤一次，用10个珠体积的ddh2o洗涤三次。随后可将在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o或k3[co(iii)(co3)3]*3h2o以10个珠体积加入珠子中。在23℃以1100rpm在恒温振荡器中振荡温育48小时后，可以用10个珠体积的ddh2o洗涤珠子两次，用10个珠体积的蛋白质缓冲液(50mmtrisph7.4，150mmnacl)洗涤一次。最后可以收集珠子(例如通过离心)以获得连接在珠子(作为载体)上的配合物。[0123]如所附实施例所示但不受理论束缚，金属阳离子、金属阳离子配体和金属阳离子螯合域温育以形成本发明配合物的温育时间，可以影响本发明配合物与靶分子的之后缔合。用于形成本发明配合物的温育时间在本发明的上下文中是“配合物形成时间”。本发明配合物与靶分子的温育时间在本发明的上下文中是“配合物-靶温育时间”。非限制性实施例18显示，例如，当配合物形成时间为10分钟时，在30分钟的配合物-靶温育时间后，相比于具有相同的配合物-靶温育时间但具有48小时的配合物形成时间的情况，有显著更多的靶分子(即his6-gfp)结合到本发明的配合物上(图20b)。然而，当配合物-靶温育时间延长(例如至48小时)时，his6-gfp与本发明配合物的有效结合可以被恢复(参见例如图10)。本领域技术人员可以容易地，根据需要，适应性地调整相应的温育时间。[0124]此外，所附实施例表明，配合物形成时间和配合物-靶温育时间两者均影响所得产物配合物的稳定性，即本发明配合物与靶分子之间的稳定性。实施例18证明，当配合物形成时间为10分钟且配合物-靶温育时间为30分钟时，靶分子与本发明的配合物有效结合，但只有一小部分产物配合物是动力学惰性的，即对咪唑处理具有抗性(图20b)。当一个温育时间，即配合物形成时间或配合物-靶温育时间被延长(例如至48小时)时，动力学惰性产物配合物的比例将增加。[0125]也如非限制性实施例18所示，10分钟的配合物形成时间和48小时的配合物-靶温育时间的组合可以导致高比例的稳定产物配合物。此外，48小时的配合物形成时间和30分钟的配合物-靶温育时间的组合也可以导致稳定的产物配合物(参见例如实施例10，图11)。如上所述，48小时的配合物形成时间可导致靶分子与本发明配合物的结合效率降低。[0126]因此，根据靶分子的性质，本领域技术人员知晓如何选择合适的温育时间。可能的情况是，靶分子非常倾向于例如在温育过程中发生变性或聚集，但需要动力学惰性的产物配合物。因此，当需要时，本领域技术人员可以选择延长的配合物形成时间(例如48小时)和较短的配合物-靶温育时间(例如30分钟)，尽管可能减少所得产物配合物的量。应注意，所附实施例18是用nta作为金属螯合配体进行的。[0127]不希望受理论束缚，值得注意的是，上述温育时间的影响可能取决于所使用的金属螯合配体。例如，在所附非限制性实施例15中，ida用作金属螯合配体，并且所述实施例证明，即使在两个短的温育时间(即10分钟的配合物形成时间和30分钟的配合物-靶温育时间),也可以形成高比例的动力学惰性的产物配合物。[0128]因此，本领域技术人员明了，可能需要，针对每个单独的金属螯合配体，确定温育时间可对产物配合物稳定性造成的影响。然而，相应温育时间的这种适应性调整完全在相关技术人员的技能范围内，并且可以通过本发明的教导和其中提供的实验部分的说明和科学细节来容易地实现。类似地，本领域技术人员也能够容易地适应性调整其他参数，如ph、温度和缓冲系统，以获得动力学惰性的产物配合物。[0129]表1可以帮助本领域技术人员确定温育时间对产物配合物稳定性的影响以及对稳定的，即动力学惰性的产物配合物的产率的影响。[0130]例如，中等稳定性是指，与导致高稳定性(即高比例的动力学惰性产物配合物)的温育时间相比，较小比例的产物配合物是动力学惰性的。应注意的是，中等稳定性也可导致在某些应用和
技术领域：
：中有用的稳定产物配合物产率。当无限制量的靶分子可得且短期内需要稳定的产物配合物时，本领域技术人员可参考以下方案，尤其是当nta用作金属阳离子螯合配体时：[0131]-选择两个较短的温育时间；[0132]-用咪唑处理生成的产物配合物(例如结合在珠子上)以去除非动力学惰性的产物配合物；[0133]-(例如通过回收珠子)回收抗咪唑处理的产物配合物，即动力学惰性的产物配合物；[0134]本领域技术人员非常清楚如何根据应用来适应性调整所述方案。[0135]很明显，表1可以进一步用于选择配合物形成时间和配合物-靶温育时间。[0136]因此，表1中公开的时间可以与本文所述的本发明配合物、方法和用途组合。[0137]因此，本发明涉及例如配合物，其包含：[0138]a)金属阳离子；[0139]b)金属阳离子配体co32-或hco3-；和[0140]c)包含螯合配体和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域；[0141]其中配合物形成时间约为48小时。[0142]本发明还涉及一种配合物，其包含：[0143]a)金属阳离子；[0144]b)金属阳离子配体co32-或hco3-；和[0145]c)包含螯合配体和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域；[0146]其中配合物形成时间约为10分钟。[0147]应注意的是，表1仅用于举例说明目的，并不以任何方式限制本发明的范围。[0148]表1：配合物形成时间和配合物-靶温育时间对产物配合物稳定性和稳定的产物配合物的产率的影响。[0149]如果没有另外说明，所有温育步骤均在25℃进行。[0150][0151][0152]可以通过在温育过程中向系统中引入能量/暴露于能量来增强nta与co3 的结合。这种将能量引入系统/暴露于能量的方式可以是在不同频率的电磁共振技术(如与nmr、x射线、uv-vis一起使用)、热、超声或等离子体共振技术。[0153]本发明的载体或其表面可以进一步用氨基基团、羧酸基团和/或活化酯如nhs酯官能化。[0154]包含载体的金属结合域的进一步非限制性实例描述于wo2014/072525a1和wo2003/072143中，所述文献通过引用整体并入本文。[0155]在第二个方面，本发明涉及包含本发明配合物的组合物。本文其他地方对配合物所描述的内容在此比照适用。[0156]除了配合物之外，组合物可以包含另外的化合物。此类化合物也可以是用于产生本发明配合物的化学化合物，如本文别处所描述。组合物还可包含其他配合物，例如具有相同金属阳离子但不同配体的配合物。组合物可以是溶液或固体的形式。[0157]在一个实施方案中，本发明的组合物可以是包含本发明配合物和hco3-或co32-的溶液。hco3-或co32-的存在可以阻止配合物的金属阳离子配体的释放，即促进配合物的稳定性。当金属阳离子配体也是碳酸根时，优选在溶液中使用hco3-或co32-。如果使用硝酸根作为金属阳离子配体，则溶液可以包含硝酸根而不是hco3-或co32-。[0158]组合物溶液中hco3-或co32-的浓度可以是至少1mm，优选至少10mm，最优选1m。组合物溶液中硝酸根的浓度可以是至少1mm，优选至少10mm，最优选1m。[0159]本发明人发现，本发明的配合物也可以作为在其他成分存在的情况下，例如，在合成后未纯化时，将标记物和/或载体连接到靶分子的试剂，来实现其功能。因此，本文所述的本发明配合物的用途以及本文所述的使用本发明配合物的方法可以使用本发明的组合物来比照实施。本领域技术人员可以避免组合物中可能对相应用途或方法的效率和/或动力学产生负面影响的组分。[0160]在第三方面，本发明提供了一种生产本发明配合物的方法。该生产方法包括一起温育：(i)金属阳离子；(ii)金属阳离子配体，和(iii)金属阳离子螯合域。在溶液中(即，在溶剂存在下，优选水溶液)温育这些组分期间，本发明的配合物将容易地形成。如上所述，在本发明的上下文中，所述温育的时间是“配合物形成时间”。表1和所附实施例可以帮助本领域技术人员选择合适的配合物形成时间。因此，本发明还涉及一种生产方法，包括一起温育(i)金属阳离子；(ii)金属阳离子配体和(iii)金属阳离子螯合域，其中温育时间，即配合物形成时间为约48小时。本发明还涉及生产方法，其包括一起温育(i)金属阳离子；(ii)金属阳离子配体和(iii)金属阳离子螯合域，其中温育时间，即配合物形成时间为约1小时。本发明进一步涉及生产方法，包括一起温育(i)金属阳离子；(ii)金属阳离子配体和(iii)金属阳离子螯合域，其中温育时间，即配合物形成时间为约3.5小时。此外，本发明涉及生产方法，包括一起温育(i)金属阳离子；(ii)金属阳离子配体和(iii)金属阳离子螯合域，其中温育时间，即配合物形成时间为约30分钟。同样，其他温育时间在本领域技术人员的常规技能中。[0161]在本文其他地方关于金属阳离子、金属阳离子配体和金属阳离子螯合域的描述，在此比照适用。[0162]在一个优选的实施方案中，金属阳离子和金属阳离子配体可以以中性配合物，优选盐的形式提供(例如作为固体或作为溶液)。中性配合物(例如盐)也可以包含其他组分。在该实施方案中，温育意味着将中性配合物(例如盐)与金属阳离子螯合域在溶液中混合并将该混合物保持规定的时间。当使用中性配合物(例如盐)时，该方法可以进一步包括产生中性配合物(例如盐)的步骤。任选地，盐可以作为固体得到并且可以被过滤和/或洗涤。[0163]温育可以进行至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少8小时、至少10小时、至少12小时、至少15小时、至少18小时、至少24小时或至少48小时。换言之，配合物形成时间可以是至少约1分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约8小时、至少约10小时、至少约12小时、至少约15小时、至少约18小时、至少约24小时或至少约48小时(也参见表1)。温育时间越长，形成的配合物就越多。在某个反应时间点，可以观察到配合物形成的饱和。观察到这种饱和的时间点和形成的配合物的产率取决于，例如，温度和所用组分的浓度以及组分本身(例如选择的缓冲液)。对于该生产过程，达到饱和不是必需的，但可以提高生产产量。[0164]温育原则上可以在用于反应的溶剂处于液态的任何温度下进行。当使用水溶液或水作为溶剂时，温度可以从0℃到99℃之间选择。优选地，根据所使用的标记物和/或载体的热稳定性来选择温度。因此，优选的温度范围是例如2℃至42℃、4℃至37℃和4℃至25℃。不受理论的束缚，更高的温度可以促进配合物的形成，因此优选更高的温度，只要对标记物和/或载体稳定性没有负面影响即可。本领域技术人员可以根据标记物和/或载体的热稳定性的知识来选择温度。[0165]金属阳离子、金属阳离子配体和金属阳离子螯合域可以各自单独地选择，如本文别处所述。本文别处描述的关于这些组分或其子集之组合的优选方式，在此比照适用。[0166]本发明配合物的生产方法可以进一步包括收集和/或纯化配合物。如上所述，本发明配合物在其他化合物存在下，特别是还包括通过本发明生产方法的温育步骤生成的反应混合物时，也发挥其功能。然而，在某些情况下，可能期望纯化和/或分离配合物。洗涤优选用包含1mm、优选10mm、甚至更优选100mm并且最优选1m的co32-或hco3-的溶液进行。如所附实施例和附图所示，当本发明的配合物用于将标记物和/或载体连接到靶分子(例如蛋白质)时，用这种溶液洗涤本发明的配合物可以导致标记物和/或载体的连接得到改进。不受理论束缚，用包含1mco32-或hco3-的溶液进行洗涤步骤，可防止co32-或hco3-配体在洗涤过程中从本发明的配合物释放。[0167]如果该方法包括载体，则纯化和/或分离可涉及一个或多个洗涤步骤。然后可以通过在最后的洗涤步骤之后从载体去除洗涤缓冲液来分离载体。例如，如果使用珠子，可以通过离心使珠子沉淀并且可以去除上清液。备选地，可以使用允许液体流过但保留附着载体的配合物的过滤柱。过滤柱的优点是，与使用沉淀和吸出上清液相比，在洗涤步骤中损失较少的载体(例如珠子)。[0168]当使用标记物时，纯化方法可涉及使用特异性识别标记物的亲和基质。在与亲和基质结合后，可以将配合物洗涤一次或多次以去除游离试剂。在最后一步中，可以洗脱配合物。配合物的纯化和分离可另外或可选地包括色谱，例如尺寸排阻色谱或阴离子或阳离子交换色谱。或者，可以通过ni2 -nta树脂将标记与未标记的蛋白分开，因为与带有游离his标签的未标记蛋白质相比，标记蛋白质与ni2 -nta将显示减少的相互作用至没有相互作用，如wegner和spatz，2013年所示。[0169]纯化本发明配合物的方法，尤其是当配合物不包含载体并且使用co3 作为金属阳离子时，也可以通过本领域中描述的方法进行(参见，例如shibatam.，1983)。[0170]本发明的优选配合物包含co3 作为金属阳离子和选自co32-或hco3-的碳酸根作为金属阳离子配体。用于生产本发明的这种优选配合物的方法可以包括，以具有抗衡离子的中性配合物形式，例如盐的形式，提供co3 和co32-或hco3-。或者，可以在溶液中提供包含co3 和co32-或hco3-的带电荷配合物。在一个优选的实施方案中，中性配合物(和盐)选自三(碳酸根)合钴(iii)酸钠三水合物(na3[co(iii)(co3)3]*3h2o)或三(碳酸根)合钴(iii)酸钾三水合物(k3[co(iii)(co3)3]*3h2o)。[0171]三(碳酸根)合钴(iii)酸钠三水合物(na3[co(iii)(co3)3]*3h2o)可以如bauer和drinkard(baueranddrinkard1960)所述合成。简而言之，可以边搅拌，边将在50mlddh2o中的0.1摩尔(29.1克)co(ii)(no3)*6h2o(sigma；1.02554)与10ml30％过氧化氢(riedel-dehaen；18312)的混合物逐滴加入0.5摩尔(＝42.0克)碳酸氢钠(merck；1.06329)在50mlddh2o中的冰冷浆液。然后可以在连续搅拌下在冰上温育混合物1小时。随后，可以过滤该橄榄色产物并用冷水、无水乙醇和无水乙醚分别洗涤三次。最后，产物可以在真空下干燥过夜，并且可以可选地在-20℃的氮气气氛中储存。本领域技术人员可以适应性地调整使用的浓度和量。可以通过nmr来确认生产成功，例如如所附实施例中所用。[0172]三(碳酸根)合钴(iii)酸钾三水合物(k3[co(iii)(co3)3]*3h2o)可以在溶液中合成，如shibata(shibata1983；morietal.1956的调整)所述。简而言之，可以在搅拌下将在24mlddh2o中的0.1摩尔(24克)co(ii)cl2*6h2o(honeywell；255599)和40ml30％过氧化氢的混合物逐滴加入到0.7摩尔(70克)碳酸氢钾(honeywell；237205)在70mlddh2o中的冰冷浆液。随后，所得绿色溶液可被过滤(例如通过抽吸)并直接用于后续实验。本领域技术人员可以适应性调整使用的浓度和量。可以通过nmr来确认生产成功，例如如所附实施例中所用。[0173]当要形成的配合物的金属阳离子配体是hco3-或co32-时，温育在包含hco3-或co32-的溶液(优选缓冲溶液)中进行。优选地，hco3-或co32-以至少1mm、优选至少10mm和最优选1m的浓度提供。[0174]特别优选的是，本发明配合物的生产方法不包括，在标记物和/或载体存在下，例如通过h2o2处理，氧化形成本发明配合物中心的金属阳离子的氧化步骤。[0175]一方面，本发明进一步涉及一种试剂盒，其包括：[0176]a)金属阳离子；[0177]b)金属阳离子配体，其为选自co32-和hco3-的碳酸根或硝酸根，优选co32-和hco3-；和[0178]c)包含螯合配体和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0179]在本文别处关于金属阳离子、金属阳离子配体和金属阳离子螯合域、螯合配体和标记物和/或载体所描述的内容，在此比照适用。[0180]试剂盒可以是用于生产本发明配合物的试剂盒，即可以包含可以反应形成本发明配合物的组分。在另一个实施方案中，在该试剂盒中可包含已组装的配合物。[0181]在一个特别优选的实施方案中，金属阳离子是co3 ，并且该试剂盒以三(碳酸根)合钴(iii)酸钠三水合物(na3[co(iii)(co3)3]*3h2o)或三(碳酸根)合钴(iii)酸钾三水合物(k3[co(iii)(co3)3]*3h2o)形式包含金属阳离子和金属阳离子配体。优选地，金属阳离子螯合域包含与配体和/或载体偶联的talon、nta或ida，优选nta或ida，最优选ida。使用该试剂盒可以产生根据本发明的优选co3 配合物。[0182]在一方面，试剂盒的组分a)至c)可以不作为一个实体，即，以本发明配合物的形式提供。[0183]在另一方面，试剂盒还可以包含组装成本发明配合物的金属阳离子、金属阳离子配体和金属阳离子螯合域，例如，以盐的形式(例如，具有本文别处指出的抗衡离子；或在溶液中，例如在包含co32-或hco3-的溶液中，例如，如在本发明组合物的上下文中所定义的)。此类试剂盒还可包含试剂，例如合适的反应缓冲液(优选如本文别处针对使用本发明配合物的方法和用途时所描述的任何缓冲液)。任选地，该试剂盒还可包括纯化材料(例如珠子、琼脂糖珠)和/或过滤柱。在一个优选的实施方案中，试剂盒可以包含本发明的配合物，其中载体是珠子(例如微珠)。在该实施方案中，配合物作为即用型亲和树脂提供用于靶分子结合。[0184]如上所述，本发明的配合物特别适用于通过金属阳离子介导的相互作用将标记物或载体连接到靶分子上。本发明人惊奇地发现，相对于先前使用的涉及水作为金属阳离子配体的配合物，使用选自co32-或hco3-的碳酸根或硝酸根可以利于具有靶分子的配合物形成。在本领域中，仅描述了不具有标记物和/或载体的[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物(davies和hung，1976；visser等，2001)。然而，这些现有技术文献既没有提供用标记物修饰该配合物的动机，也没有提供使用该配合物来标记靶分子例如蛋白质(例如带his标签的蛋白质)的动机。特别是，这些现有技术文献也没有提示本发明人发现的在将标记物和/或载体连接到靶分子方面的有利特征(参见所附实施例)。[0185]在第四方面，本发明涉及本发明配合物用于将配合物中包含的标记物和/或载体连接到靶分子上的用途。金属阳离子介导的与标记物和/或载体之间的连接，由此通过使本发明的配合物与靶分子接触，从而使得靶分子可以置换配合物的主要配位层中的金属阳离子配体，来实现。因为金属阳离子配体选自co32-,hco3-和硝酸根，所以使用本发明的配合物可以以特别高的速率来实现该连接。正如所附实施例中以碳酸根co32-进行的举例说明，配位层中这些金属阳离子配体可以容易地被靶分子置换，尤其是被包含两个作为路易斯碱起作用的基团的靶分子(例如，带his标签的蛋白质)置换。不受理论的束缚，据信本发明配合物的金属阳离子配体在从配合物中释放后质子化，这反过来促进了它们从配合物中的释放和与靶分子的交换。在碳酸根作为金属阳离子配体的情况下，碳酸根的质子化导致气体形成，其通过促进金属阳离子配体释放，甚至进一步促进靶分子结合。因此，碳酸根co32-和hco3-是本发明上下文中特别优选的金属阳离子配体。[0186]因此，本发明提供了本发明的配合物或组合物用于将标记物和/或载体连接至靶分子的用途。本发明的靶分子包含核酸(例如dna、rna，或由核苷酸类似物制成的dna或rna类似物)、肽或蛋白质。特别地，根据本发明的靶分子可以是核酸(例如dna、rna，或由核苷酸类似物制成的dna或rna类似物)、肽或蛋白质。特别优选的是，本发明上下文中的靶分子包含蛋白质或肽。类似地，还特别优选靶分子是蛋白质或肽。包含在靶分子中的蛋白质或肽、或形成靶分子的蛋白质或肽，必须被配置为使得它们可以在金属配合物中充当配体(路易斯碱)。这意味着该分子必须包含一个或多个部分；特别是(一个或多个)氨基酸，所述部分可以作为配体/路易斯碱起作用并可以与配合物的金属阳离子配位。换言之，靶分子必须被配置为使得其可以交换本发明配合物中的金属阳离子配体从而形成包含靶分子作为配体的新配合物。例如，可以如下测试靶分子的配体是否可以交换本发明配合物中的金属阳离子配体：(i)使用以本发明配合物官能化的珠子(可以如所附实施例中所述进行此类珠子的制备)；(ii)添加靶分子(例如根据所附实施例中描述的方案)；(iii)温育珠子与靶分子(优选，在4℃，至少30分钟，至少1小时，至少3小时，至少3.5小时，至少24小时，优选48小时)；(iv)分离珠子和上清液；(v)通过靶特异性方法(例如基于荧光、抗体检测、酶学测试、定量质谱等)分析上清液和/或珠子中的靶分子。应包括无配合物的阴性对照。然后可以通过测量上清液中靶分子量的减少和/或与珠子结合的靶分子量的增加来检测交换。[0187]在一个优选的实施方案中，靶分子的蛋白质或肽(即包含在靶分子中或形成靶分子)包含在序列[xnsm]k中具有至少四个氨基酸残基的“金属阳离子配体氨基酸基序”，其中x在每个位置上独立地选自可以与本发明配合物的金属阳离子配位，即作为路易斯碱起作用的一组氨基酸；s是不包含在第一组氨基酸中的氨基酸(s在每个位置独立地选自该列氨基酸)；n在每种情况下独立地为1-4；m在每种情况下独立地为0-6；并且k是2-6(参见seqidnos：4至8)，优选2-5(参见seqidnos：4至7)，并且其中“金属阳离子配体氨基酸基序”包含至少4个，优选至少6个，最优选至少8个，选自能够与本发明配合物的金属阳离子配位的氨基酸。“金属阳离子配体氨基酸基序”可以具有规则的序列，即n和m在每次出现时具有相同的值，或不规则的序列，即n和m可以具有不同的值。因此，在一个实施方案中，靶分子可以包含“金属阳离子配体氨基酸基序”，该“金属阳离子配体氨基酸基序”包含如seqidno:4至8中定义的任何氨基酸序列或由其组成，其中“金属阳离子配体氨基酸基序”包括至少4个，优选至少6个，最优选至少8个，选自能够与本发明配合物的金属阳离子配位的氨基酸。氨基酸基序内具有数目更多的能与本发明配合物的金属阳离子配位的第一组氨基酸，可以增加对金属配合物的结合强度和/或特异性，即可以促进与标记物和/或载体的连接。[0188]“能够与本发明配合物的金属阳离子配位的氨基酸组”可以由甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、精氨酸、硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸组成。优选地，能够与本发明配合物的金属阳离子配位的氨基酸组由甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸组成。甚至更优选地，能够与本发明配合物的金属阳离子配位的氨基酸组由甘氨酸、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸组成。已知这些氨基酸适合作为金属配体，能与金属阳离子形成配合物。(chinetal.,1999；mcauliffetal.1966；sugimorietal.1993；sajadi,2010；bellandsheldrick2014)。最优选地，“能够与本发明配合物的金属阳离子配位的氨基酸组”由组氨酸组成；即“x”是组氨酸。[0189]本文所用的“金属阳离子配体氨基酸基序”优选被配置为使得其可以交换本发明配合物中的金属阳离子配体，以形成包含“金属阳离子配体氨基酸基序”作为配体的新配合物。与金属阳离子配体交换以形成新的配合物,可以如上文针对靶分子所述进行测试。[0190]组氨酸是一种经过充分研究的金属阳离子配合物配体，使用金属离子和组氨酸标签形成配合物被广泛地应用于蛋白质生物化学领域中，例如，用于纯化蛋白质或将其附着到表面。在本发明的上下文中，靶分子(例如形成靶分子或包含在其中的蛋白质或肽)可包含“间隔组氨酸标签”，其在序列[hnsm]k中包含至少四个组氨酸残基，其中h是组氨酸，s在每个位置独立地选自不同于组氨酸的氨基酸残基，优选地选自甘氨酸和/或丝氨酸和/或苏氨酸的氨基酸残基，n在每种情况下独立地为1-4，m在每种情况下独立地为0-6，并且k是2-6(参见seqidno：9至13)，优选2-5(参见seqidno：10至13)。间隔组氨酸标签可以具有规则序列，即n和m在每次出现时具有相同的值，或不规则序列，即n和m可以具有不同的值。因此，在一个实施方案中，靶分子可包含间隔组氨酸标签，其包含如seqidno:9至13中定义的任何氨基酸序列或由其组成，其中“金属阳离子配体氨基酸基序”包含至少4个，优选至少6个，最优选至少8个组氨酸残基。多组氨酸标签中更多数量的组氨酸，可以增加对金属阳离子(例如co3 )的结合强度和特异性。然而，过多的连续组氨酸在某些情况下会降低重组蛋白(例如在大肠杆菌中重组表达的蛋白)的表达水平和溶解度。这些问题可以通过用包含甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸的短间隔，即，使用间隔组氨酸标签，中断组氨酸的连续出现来克服。[0191]在一个特别优选的实施方案中，靶分子可以包含his-标签。his-标签可以包含或由2至14个，优选3至10个，甚至更优选4至8个连续的组氨酸或组氨酸样残基组成。在一个实施方案中，his标签可以包括至少2个，优选至少3个，优选至少4个，优选至少5个，最优选至少6个(例如2、3、4、5、6、7或8个)连续的组氨酸或组氨酸样残基。“组氨酸样”是指含有咪唑基团的非天然氨基酸衍生物。在一个特别优选的实施方案中，his-标签由至少4个，优选至少5个，最优选至少6个(例如4、5、6、7或8个)连续的组氨酸残基组成。[0192]his-标签可以是在天然蛋白质中出现的序列段或可以是重组组氨酸标签。“重组”在本文中是指，通过基因工程人工生成的his标签，例如通过改变编码核酸序列使得包含his标签的融合蛋白得以表达。[0193]his-标签可以包含在靶分子的n-末端或c-末端，或者可以作为内部序列段提供。在一些实施方案中，his-标签可以在n-末端和c-末端。[0194]在一个实施方案中，本发明的靶分子可以具有三维结构，其中至少2个，优选至少3个，优选至少4个，优选至少5个，最优选至少6个组氨酸或组氨酸样残基在空间上接近。在此上下文中，“空间接近”优选意指每个残基之间的距离为0至5埃。两个残基之间的“距离”是，两个独立的相邻组氨酸侧链或组氨酸样侧链的两个最近的氮原子之间的最短距离。[0195]本发明靶分子的非限制性优选实例是药物、诊断剂、研究剂、化妆品和/或用于环境处理的蛋白质(例如用于水处理的蛋白质)。[0196]靶分子的其他非限制性优选实例是包含以下的分子或由以下组成的分子：酶、靶向蛋白(例如抗体、纳米抗体等)、细胞因子、转运蛋白(例如用于脂肪酸转运的fabs)、储存蛋白(例如铁蛋白)、机械支持蛋白(例如胶原蛋白)、生长因子、激素(例如胰岛素或tsh)、干扰素、糖蛋白、合成工程化的蛋白或其片段。[0197]本发明上下文中使用的靶分子也可以是核酸。核酸包括嘌呤和嘧啶碱基。已知两者都能够与本发明的金属阳离子形成配合物。优选地，核酸包含至少2个，优选地至少5个并且甚至更优选地至少10个碱基。核酸包括dna、rna、lna和本领域已知的其他核酸衍生物。最优选的是dna。特别地，设想靶分子是折纸结构(origamistructure)，即具有三维折叠的核酸结构。通常通过包括支架链(scaffoldstrand)和u形环链(staplestrand)的几个核酸链的碱基配对，形成这种折纸结构。[0198]本发明的配合物或组合物用于标记靶分子的用途涉及，通过将本发明配合物的金属阳离子配体交换为靶分子，将标记物和/或载体连接至靶分子。所述交换通过使本发明的配合物与靶分子接触来实现。因此，该用途优选包括使本发明的配合物与靶分子在溶液中接触。[0199]因此，一方面，本发明涉及将标记物和/或载体连接到靶分子的方法，包括将本发明配合物或包含本发明配合物的组合物与靶分子一起温育的步骤。靶分子是如本文别处定义的靶分子。[0200]“温育”是指将配合物和靶分子混合在溶液中，并允许混合物反应规定的时间。如上所述，在本发明的上下文中，配合物与靶分子温育的时间是“配合物-靶温育时间”。表1和所附实施例可以帮助本领域技术人员选择配合物-靶温育时间。因此，本发明例如涉及，本发明配合物用于将配合物中包含的标记物和/或载体连接到靶分子上的用途，其中配合物-靶温育时间可为约48小时。如本文所述，配合物形成时间也可以影响产物配合物的形成。也如本文所述，配合物形成时间可以基于表1或所附实施例来选择。因此，本发明涉及例如，本发明配合物用于将配合物中包含的标记物和/或载体连接至靶分子的用途，其中配合物形成时间为约48小时并且配合物-靶温育时间是大约3.5小时。在另一个示例性实例中，本发明还涉及，本发明配合物用于将配合物中包含的标记物和/或载体连接至靶分子的用途，其中配合物形成时间为约10分钟并且配合物-靶温育时间约为48小时。本发明进一步涉及，本发明配合物用于将包含在配合物中的标记和/或载体与靶分子连接的用途，其中配合物形成时间为约10分钟且配合物-靶温育时间为约30分钟。本发明还涉及，本发明配合物用于将配合物中包含的标记物和/或载体连接到靶分子上的用途，其中配合物形成时间为约10分钟且配合物-靶温育时间为约3小时。本发明还涉及，本发明配合物用于将配合物中包含的标记物和/或载体连接到靶分子上的用途，其中配合物形成时间为约48小时且配合物-靶温育时间为约1小时。[0201]在本发明配合物用于将配合物中包含的标记物和/或载体连接到靶分子的用途的一个具体实施方案中，金属螯合配体是ida并且配合物形成时间是10分钟并且配合物-靶温育时间为约30分钟。[0202]在本发明配合物用于将配合物中包含的标记物和/或载体连接到靶分子的用途的另一个优选实施方案中，金属螯合配体是ida并且配合物形成时间是10分钟并且配合物-靶温育时间为约3小时。[0203]将标记物和/或载体连接到靶分子的方法可以包括，回收和/或纯化其上连接有标记物和/或载体的靶分子的步骤。这将提供其上连接有标记物和/或载体的分离靶分子。[0204]如果方法包括连接载体，则可以通过分离载体来实现载体所连接的靶分子的纯化和/或分离。例如，如果使用固体载体，可以通过离心将珠子沉淀并且可以去除上清液。或者，可以使用允许液体流过但保留附着载体的配合物的过滤柱。任选地，可以用缓冲溶液洗涤载体以去除杂质。[0205]通常，无论使用载体或标记物，分离和/或纯化都可以通过色谱进行。所述色谱可以包括或由大小排阻层析组成，其利用连接到载体和/或标记物的靶分子与游离靶分子和本发明配合物之间的分子大小和形状差异。[0206]可以用于纯化根据本发明的带有标记物和/或载体的靶分子的方法也描述在wo2014/072525中，该文献通过引用整体并入本文。[0207]在一个实施方式中，还可以使用wo2014/072525中描述的常规ni-nta柱进行纯化。[0208]本发明配合物或包含其的组合物的温育可以在具有不同ph值的溶液中进行。而标记物和/或载体与靶分子的连接可以在多种ph值下发生。ph值越低，越有利于金属阳离子配体(即碳酸根或硝酸根)的释放。这是因为释放的配体可以被质子化。当质子化时，碳酸根co32-和hco3-甚至可以形成气体释放出来。[0209]虽然原则上较低的ph值有利于交换反应，但温育期间的ph通常选择在与所用靶分子相容的范围内。特别是蛋白质在许多情况下对过低或过高的ph值敏感。优选选择ph以使得靶分子的稳定性(例如蛋白质的三维折叠和/或蛋白质的生物学功能)得以维持。然而，也优选将ph选择在靶分子的ph稳定性范围的下限以促进配体交换，即标记物和/或载体与靶分子的连接。本领域技术人员知晓，测试在不同ph值下蛋白质的稳定性和功能的测定法。[0210]在一个优选的实施方案中，本发明配合物与靶分子温育期间的ph在4.0和9.5之间，优选在5.5和8.0之间。在这些ph范围内，大多数靶分子，特别是大多数蛋白质，是稳定的和/或功能性的。[0211]金属阳离子配体和靶分子的交换通常在短时间内发生。因此，根据所需的连接效率和所用的靶分子，根据本发明用于连接标记物和/或载体的方法的温育步骤，可以进行短至仅至少约10秒，优选至少约1分钟，最优选至少约10分钟的时间。在优选的实施方案中，温育进行至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约7小时、至少约9小时、至少约12小时、至少约24小时或至少约48小时。不受理论的8.5；tea:7.0-8.5；tes:6.5-8.5；tris:6.8-9.5；碳酸盐缓冲剂:8.5-11.0。[0220]原则上，其他ph值也可以与上述每种缓冲液一起使用，因为反应可以在宽泛的ph值范围内进行，因此缓冲能力不是绝对必需的。然而，为了保持ph恒定并更好地控制反应，优选在上述ph范围内的ph，其中缓冲剂具有缓冲能力。[0221]缓冲剂可以以不同浓度使用，例如1mm至1m，优选1mm至250mm，最优选1mm至100mm(例如50mm)。本领域技术人员可以通过评估连接效率和使用不同的缓冲剂浓度来测试理想的缓冲剂浓度。[0222]如所附实施例中所证明的，缓冲物质/试剂的选择可影响标记物和/或载体对靶分子的连接效率。不受理论束缚，具有低金属结合常数的缓冲剂显示出增加的连接效率。低金属阳离子结合常数可防止缓冲剂与金属配位并封闭在主要配位层中的配体位置。[0223]因此，在一个实施方案中，本发明上下文中使用的缓冲物质/试剂可以是具有低金属结合常数的缓冲物质/试剂。ferreira等人2015公开了对“低金属结合常数”的理解和此类缓冲物质/试剂的优选实例，其全部内容以引用方式并入本文。[0224]此外，在一个优选的实施方案中，温育步骤在包含一个或更少(优选零个)选自胺基和羰基的基团的缓冲物质/试剂的存在下进行。这些基团包括路易斯碱，可以介导与配合物中金属阳离子的结合。因此，不存在这些基团可以降低或阻止缓冲物质与金属阳离子的结合，从而促进靶分子的结合。[0225]如所附实施例所证实，以下缓冲剂可有利地促进标记物和/或载体连接：mes、hepes、bis-tris和pipes。实施例说明，这些缓冲剂导致比基于tris的缓冲剂更高的连接效率。因此，在一个特别优选的实施方案中，温育期间存在于溶液中的缓冲物质可以选自mes、hepes、bis-tris和pipes。这些缓冲物质特别有利于标记物和/或载体连接。非限制性实施例13说明，可能需要根据用于温育的ph来选择缓冲剂。当在约7.5的ph下进行本发明配合物和靶分子的温育时，可以使用hepes而不是bistris。当在约5.5的ph下进行本发明配合物和靶分子的温育时，可以使用bistris。最合适的缓冲液和ph值的确定完全在相关技术人员的技能范围内，并且可以通过本发明的教导和其中提供的实验部分的说明和科学细节来容易地实现。[0226]鉴于这些结果并基于保持缓冲剂与金属阳离子结合尽可能低的理论考虑，缓冲物质可优选选自：bistris、caps、capso、hepes、hepbs、heppso、mes、mops、mopso、pipes、taps和tes。[0227]在一个优选的实施方案中，可以在溶液中存在ca2 离子的情况下进行本发明配合物或包含该配合物的组合物与靶分子的温育。当本发明配合物的金属阳离子配体是选自hco3-或co32-的碳酸根时，ca2 离子的存在是特别优选的。这是因为ca2 离子可以形成不溶性caco3，caco3从溶液中沉淀出来，从而促进碳酸根从配合物中释放出来。这又促进了靶分子作为配体的结合，从而有利于标记物和/或载体与靶分子的连接。优选地，通过溶解cacl2在反应溶液中来提供ca2 离子。ca2 离子可以在反应开始时加入，即可以在本发明配合物与靶分子接触时直接加入。或者，较不优选地，可以在反应期间以盐(优选cacl2)的形式加入ca2 离子。ca2 离子(优选以cacl2的形式)优选以0.1至50mm、甚至更优选0.1-10mm并且最优选1mm的浓度添加。[0228]根据本发明将标记物和/或载体连接到靶分子的方法不需要例如通过h2o2处理，氧化本发明配合物的金属阳离子的氧化步骤。在一个优选的实施方案中，根据本发明将标记物和/或载体连接到靶分子的方法不包括氧化步骤，例如用h2o2处理。这在形成co3 介导的标记物和/或载体连接的情况下是特别优选的。在先前报道的方法(例如wegner和spatz，2013)中，co3 介导的功能性部分的连接是通过形成his标签靶蛋白作为配体的co2 配合物、并仅在之后氧化co2 为co3 来实现的。如所附实施例所证实，在co阳离子存在下的这种氧化步骤会导致自发的芬顿反应，从而导致蛋白质降解。此外，蛋白质的氧化可干扰蛋白质折叠和功能。因此，本发明方法的一个特别优势是不需要氧化步骤。[0229]用于将标记物和/或载体连接到靶分子的方法，还可以包括产生如本文别处所述的本发明配合物(以及任选地中性配合物，例如其盐)。[0230]根据本发明将标记物和/或载体连接到靶分子的方法，导致产生标记的和/或载体连接的靶分子。因此，该方法也可称为用于产生连接有标记物和/或载体的靶分子的方法。在本文别处指出的关于靶分子的优选方案，在此比照适用。因此，在一个实施方案中，本发明的方法可以是一种将标记物和/或载体连接到蛋白质，例如带有his标签的蛋白质、抗体、其衍生物(例如包括scfv片段和纳米抗体)或其结构域的方法。[0231]将标记物和/或载体连接到靶分子的方法的一个优选实施方案是，靶分子是带his标签的蛋白质并且带his标签的蛋白质连接到载体，所述载体是表面(例如芯片)。在这种优选使用co3 作为金属阳离子、如本文定义的碳酸根作为金属阳离子配体、以及nta、talon或ida作为螯合配体的方法中，his-标签蛋白质被连接到所述表面上。由于靶分子的高稳定性和动力学惰性结合，蛋白质可以以近乎共价的方式结合到表面，并对于咪唑和其他螯合物(例如edta)以及还原等效处理，呈惰性。[0232]在又一方面，本发明涉及通过根据本发明将标记物和/或载体连接到靶分子的方法可获得的或获得的具有连接到其上的标记物和/或载体的靶分子。通过本发明方法获得的、标记的和/或载体连接的靶分子具有如下特征：靶分子和标记物和/或载体都不经历氧化步骤(例如h2o2处理)。相比之下，先前报道的产生此类结构的方法涉及，在i)靶分子和ii)标记物和/或载体中的至少一者或两者存在下的氧化步骤。因此，本发明方法的产物具有未被氧化且不含氧化剂如h2o2的优点。对于产生的标记和/或载体连接的靶分子的医学用途，这也具有关键优势。[0233]在本文别处关于根据本发明的配合物、其组分、靶分子和将标记物和/或载体连接到靶分子的方法所描述的内容，在此比照适用。[0234]通过本发明方法可获得的其上连接了标记物和/或载体的靶分子也是配合物。该获得的“产物配合物”包含本发明配合物的金属阳离子以及与其配位的i)本发明配合物的金属结合域和ii)靶分子。[0235]本发明还提供了一种组合物，其包含通过将标记物和/或载体连接到靶分子的方法可获得或获得的标记的和/或连接有载体的靶分子。[0236]通过本发明方法可获得或获得的标记的和/或载体连接的靶分子、或包含其的组合物，可用作研究试剂。因此，本发明还涉及，通过本发明方法可获得的或获得的标记的或载体连接的靶分子作为研究试剂的用途。类似地，提供了方法，所述方法包括步骤：使用通过本发明方法产生的标记的或载体连接的靶分子作为研究试剂。例如，靶分子可以是固定在固相载体上用于细胞培养的细胞外基质蛋白。[0237]在一个实施方案中，通过本发明方法可获得的或获得的标记的和/或载体连接的靶分子、或包含其的组合物，可用作体外诊断剂。例如，靶分子可以是特异性识别分析物的检测性蛋白(例如，可以识别分析物抗原的抗体)，并且可以配置标记物和/或载体以符合本领域已知的测量方法。[0238]本发明涉及，通过本发明方法可获得的或获得的标记的和/或载体连接的靶分子或包含其的组合物用作药物。类似地，提供了一种治疗方法，其包括向患者施用有效量的通过本发明方法可获得或获得的标记的和/或载体连接的靶分子或包含其的组合物。优选地，靶分子选自酶、靶向蛋白例如抗体、细胞因子(例如g-csf)、转运蛋白例如用于脂肪酸转运的fabs、储存蛋白例如铁蛋白、机械支持蛋白如胶原蛋白、生长因子、激素如胰岛素或tsh、干扰素、糖蛋白、合成的工程化蛋白或其片段。[0239]本发明尤其还包括，当用作体内药物时，靶分子和/或标记物可以从包含靶分子的“产物配合物”中释放出来的实施方案，例如，在配合物与体内靶结构结合后释放。因此，通过本发明方法可获得的其上连接了标记物和/或载体的靶分子，可以被配置成允许标记物和/或靶分子可以被释放，优选在体内释放的形式。释放可通过产物配合物中金属阳离子的还原、ph值变化和/或通过靶分子和/或标记物与靶结构(例如受体或细胞表面蛋白，例如癌细胞特异性表面蛋白)的结合而触发。[0240]本发明尤其提供以下实施方案：[0241]1.一种配合物，其包含：[0242]a)金属阳离子；[0243]b)金属阳离子配体co32-或hco3-；和[0244]c)包含螯合配体和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域。[0245]2.项目1的配合物，其中金属阳离子螯合域的螯合配体是包含一个或多个羧酸基团和/或一个或多个胺基团和/或一个多个芳族胺和/或磷酸根的多齿配体。[0246]3.项目1的配合物，其中c)的金属阳离子螯合域的螯合配体选自：[0247]次氮基三乙酸(nta)、亚氨基二乙酸(ida)、三(羧甲基)乙二胺(ted)、螯合肽如具有共有序列(ghhph)ng的肽，其中n＝1-3(参见seqidno：1至3)或cadystin、三氮杂环壬烷(tacn)、二亚乙基三胺-五乙酸盐(dtpa)、植物螯合素、羧甲基天冬氨酸(cma)、膦酸盐、单宁酸(ta)、卟啉、联吡啶胺(dpa)、植酸、次氮基丙酸二乙酸(npda),次氮基异丙酸二乙酸(nipda),n-(羟乙基)乙二胺三乙酸(hedta),1,4,7,10-四氮杂环十二烷-n,n',n",n"'-四乙酸(dota)、1,4,7-三(羧甲基)-10-(2'-羟丙基)-1,4,7,10-四氮杂环癸烷，1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(nota),1-(1,3-羧基-丙基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-4,7-二乙酸(nodaga),1,4,8,11-四氮杂环十四烷-n,n',n",n"'-四乙酸(teta)、乙二半胱氨酸、乙二胺四乙酸(edta)、1,2-二氨基环己烷-n,n,n',n'-四乙酸(dact)、双(氨基乙硫醇)羧酸、亚乙基双(氧亚乙基-次氮基)四乙酸(egta)、三亚乙基四胺-六乙酸(ttha)、1,4,7-三氮杂环壬烷次膦酸(trap)、脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)、嘌呤、嘧啶及其衍生物。[0248]4.项目1的配合物，其中c)的金属阳离子螯合域的螯合配体选自：次氮基三乙酸(nta)、亚氨基二乙酸(ida)、具有共有序列(ghhph)ng的螯合肽、二亚乙基三胺-五乙酸盐(dtpa)、次氮基丙酸二乙酸(npda)、次氮基异丙酸二乙酸(nipda)、乙二胺-四乙酸(edta)、亚乙基双(氧亚乙基-次氮基)四乙酸(egta)、羧甲基天冬氨酸(cma)及其衍生物。[0249]5.项目1的配合物，其中c)的金属阳离子螯合域的螯合配体包含或选自nta,ida及其衍生物。[0250]6.项目1至4中任一项的配合物，其中所述金属阳离子是过渡金属阳离子。[0251]7.项目1至5中任一项的配合物，其中所述配合物的金属阳离子是二价、三价或四价金属阳离子。[0252]8.项目1至6中任一项的配合物，其中所述金属阳离子是水配体交换速率为10-1s-1或更低，优选10-2s-1或更低的金属阳离子。[0253]9.项目1至7中任一项的配合物，其中金属阳离子选自：co3 ,cr3 ,rh3 ,ir3 ,pt2 ,pt4 ,ru2 ,ru3 ,la3 ,eu3 ,os2 ,pd4 ,mo3 ,fe3 ,ru3 ,gd3 ,tc3 ,re3 ,sm3 ,tb3 ,ce3 ,pr3 ,nd3 ,pm3 ,dy3 ,ho3 ,er3 ,tm3 ,yb3 ,v2 ,mn4 ,fe2 和lu3 。[0254]10.项目1至7中任一项的配合物，其中金属阳离子选自：co3 ,cr3 ,rh3 ,ir3 ,ir4 ,pt2 ,pt4 ,pd4 ,mo3 ,fe3 ,gd3 ,tb3 ,eu3 ,ru2 ,la3 ,ru3 ,re3 ,re4 ,v2 ,mn4 ,fe2 和os2 。[0255]11.项目1至7中任一项的配合物，其中金属阳离子是co3 。[0256]12.项目1至11中任一项的配合物，其中b)的金属阳离子配体是碳酸根co32-或碳酸氢根hco3-。[0257]13.项目1至12中任一项的配合物，其中所述配合物包含[co(iii)(nta)co3]2-,[co(iii)(nta)hco3]-配合物或其水合物，其中标记物和/或载体连接在nta上。[0258]14.项目1至13中任一项的配合物，其中所述标记物包含荧光团、诊断剂、靶向部分、治疗剂、peg分子、脂质、生物素和/或其衍生物、蛋白质、肽、毒素和/或选自硫醇、叠氮化物、炔烃、硝酮、四嗪和四唑的反应性基团。[0259]15.项目1至13中任一项的配合物，其中所述标记物包含或为荧光团。[0260]16.项目1至13中任一项的配合物，其中所述标记物包含或为生物素或其衍生物。[0261]17.项目1至13中任一项的配合物，其中所述载体是聚合物、水凝胶、微粒、纳米颗粒、球体(包括纳米球和微球)、珠子、量子点、辅基、或固体表面。[0262]18.项目1至17的配合物，其中金属阳离子螯合域包含螯合配体与标记物和/或载体之间的接头。[0263]19.一种组合物，其包含项目1至18中任一项所定义的配合物。[0264]20.项目1至18中任一项的配合物或项目19的组合物用于标记靶分子的用途，其中所述靶分子包含可交换配合物中的金属阳离子配体的蛋白质、肽或核酸，优选蛋白质或dna，甚至更优选地，其中所述靶分子在序列[hnsm]k中包含至少4个组氨酸残基或组氨酸样残基，其中h是组氨酸残基或组氨酸样残基，其中s是间隔氨基酸残基，其中n在每种情况下独立地为1至4，其中m在每种情况下独立地为0至6，并且其中k为2至6。[0265]21.项目1至18中任一项的配合物或项目19的组合物用于标记靶分子的用途，其中所述靶分子含有包含至少两个组氨酸残基的富含组氨酸的区域，其中所述富含组氨酸的区域由靶分子的三维折叠形成，该折叠使所述的至少两个组氨酸残基在空间上接近，其中所述的至少两个组氨酸残基具有0至5埃的距离并且在氨基酸序列中不连续。[0266]22a.项目21的用途，其中所述富含组氨酸的区域是抗体的fc区。[0267]22b.项目1至18中任一项的配合物或项目19的组合物用于将标记物和/或载体连接至抗体、其结构域(例如fc区)或其片段的用途。[0268]22c.项目22b的用途，其中所述标记物是毒素。[0269]23.项目1至18中任一项的配合物或项目19的组合物用于标记靶分子的用途，所述靶分子含有富含组氨酸样残基的区域，该区域在所述靶分子的三维折叠过程中当所述组氨酸样残基在空间上接近时产生，其中所述的至少两个组氨酸样残基具有0至5埃的距离并且在氨基酸序列中不连续。[0270]24.项目20、21或23的用途，其中所述靶分子是药物、诊断剂、研究剂、化妆品和/或用于环境处理(例如水处理)的蛋白质。[0271]25.项目20、21或23的用途，其中所述靶分子包含或者是肽或蛋白质。[0272]26.项目20、21、23、24或25的用途，其中所述靶分子包含或是酶、靶向蛋白例如抗体、细胞因子、转运蛋白例如用于脂肪酸转运的fabs、储存蛋白质如铁蛋白、机械支持蛋白如胶原蛋白、生长因子、激素如胰岛素或tsh、干扰素、糖蛋白、合成的工程化蛋白或其片段。[0273]27.项目20至26中任一项的用途，其中所述靶分子在n-末端、c-末端或在内部序列区域包含组氨酸残基或组氨酸样残基。[0274]28.项目20至26中任一项的用途，其中以his标签的形式包含所述组氨酸残基或组氨酸样残基，优选其中所述his标签由2至10个，优选4至8个，并且最优选6至8个连续残基组成。[0275]29.项目1至18中任一项的配合物或项目19的组合物用于生产药物、诊断剂和/或化妆品的用途。[0276]30.一种试剂盒，其包含：[0277]a)金属阳离子，优选项目5至11中任一项所定义的金属阳离子；[0278]b)金属阳离子配体co32-或hco3；和[0279]c)包含螯合配体和标记物和/或载体的金属阳离子螯合域，优选项目2至4和14至18中任一项所定义的金属阳离子螯合域。[0280]31.生产项目1至18中任一项的配合物的方法，包括在溶液中温育：(i)金属阳离子；(ii)项目1b)中所定义的金属阳离子配体；(iii)项目1c)中所定义的金属阳离子螯合域。[0281]32.项目31的方法，还包括收集和/或纯化项目1至18中任一项的配合物。[0282]33.项目31或32的方法，其中金属阳离子螯合域是项目2至18中任一项所定义的金属阳离子螯合域。[0283]34.项目31至33中任一项所述的方法，其中所述金属阳离子为项目5至11中任一项所定义的金属阳离子。[0284]35.项目31至34中任一项所述的方法，其中所述金属阳离子为co3 ，其中所述金属阳离子结合配体为co32-或hco3-，且其中co3 和co32-或hco3-以具有抗衡离子的中性配合物的形式提供，例如以盐的形式提供，或以包含co3 和co32-或hco3-的带电荷配合物的形式提供。[0285]36.项目35的方法，其中所述中性配合物是三(碳酸根)合钴(iii)酸钠三水合物(na3[co(iii)(co3)3]*3h2o)或三(碳酸根)合钴(iii)酸钾三水合物(k3[co(iii)(co3)3]*3h2o)。[0286]37.项目31至36中任一项的方法，其中，在包含hco3-或co32-的缓冲液中进行温育，优选hco3-或co32-的浓度为至少1mm，优选至少10mm，最优选1m。[0287]38.一种将标记物和/或载体连接到靶分子的方法，包括将项目1至18中任一项的配合物或项目19的组合物与靶分子一起温育的步骤，其中所述靶分子是项目20至28中任一项所定义的靶分子。[0288]39.项目38的方法，其中该方法进一步包括回收和/或纯化其上连接了标记物和/或载体的靶分子的步骤。[0289]40.项目38或39的方法，其中该溶液的ph值为4.0至9.5，优选5.5至8.0。[0290]41.项目38至40中任一项的方法，其中温育进行至少10秒，优选1分钟，最优选10分钟。[0291]42.项目38至41中任一项的方法，其中在0至95℃之间，优选0至60℃之间，最优选0至42℃之间的温度下进行温育。[0292]43.项目38至42中任一项的方法，其中该方法进一步包括，在温育之前在包含hco3-或co32-的溶液中洗涤本发明的配合物，优选hco3-或co32-的浓度为至少1mm，优选10mm，最优选1m，和/或其中在包含hco3-或co32-的溶液中进行温育，优选hco3-或co32-的浓度为至少1mm，优选10mm，最优选1m。[0293]44.项目38至43中任一项的方法，其中所述温育在水或水溶液中进行。[0294]45.项目38至44中任一项的方法，其中在包含一种或多种选自下组的有机溶剂的溶液中进行温育：dmso、dmf、dms、乙腈和异丙醇。[0295]46.项目38至45中任一项的方法，其中温育在包含一种或多种good氏缓冲物质，tris、磷酸盐和/或碳酸盐/碳酸氢盐的水溶液中进行。[0296]在该项目的一个实施方案中，缓冲液可以是pbs。[0297]47.项目38至46中任一项的方法，其中在ca2 存在下进行温育，优选ca2 以cacl2的形式提供。[0298]48.项目38至47中任一项的方法，其中在包含一种或多种缓冲物质的水溶液中进行温育，其中所述(一种或多种)缓冲物质不包含胺、羧酸、芳族胺和/或磷酸基团。[0299]49.项目38至48中任一项的方法，其中在包含一种或多种选自以下的缓冲物质的水溶液中进行温育：aces、ampso、bes、bistris、bistris丙烷、硼酸盐、caps、capso、ches、dipso、epps、hepes、hepbs、heppso、mes、mops、mopso、pipes、popso、taps、tapso、tea、tes、碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液、磷酸盐缓冲液(例如pbs)和tris。[0300]50.项目38至49中任一项的方法，其中在含有一种或多种选自以下的缓冲物质的水溶液中进行温育：bistris、caps、capso、hepes、hepbs、heppsomes、mops、mopso、pipes、taps、tes、磷酸盐缓冲液(例如pbs)和tris。[0301]51.项目38至50中任一项的方法，其中在包含选自以下的缓冲物质的水溶液中进行温育：bis-tris、mes、hepes和pipes。[0302]52.项目38至51中任一项的方法，其中该方法不涉及在标记物和/或载体存在下的氧化步骤，例如用h2o2处理。[0303]53.一种标记的或载体连接的靶分子，其可通过项目38至52中任一项所定义的方法获得。[0304]54.一种组合物，包含项目53的标记的或载体连接的靶分子。[0305]55.项目53的标记的或载体连接的靶分子或项目54的组合物作为研究试剂的用途。[0306]56.项目53的标记的或载体连接的靶分子或项目54的组合物用作药物。[0307]本发明的“配合物”是指由金属阳离子和配体形成的配合物。因此，术语配合物优选涉及配位配合物或金属配合物。配合物包含金属阳离子形式的路易斯酸和一个或多个配体形式的一个或多个路易斯碱。本发明的配合物具有至少两个如本文别处定义的配体。[0308]如本文所用，术语“蛋白质”和“肽”均涉及由氨基酸组成的多肽。术语“肽”是指具有20个或更少氨基酸的多肽。术语“蛋白质”是指具有超过20个氨基酸的多肽。术语多肽包括“肽”和“蛋白质”。在本文中提及“蛋白质或肽”时，也包括多肽。[0309]如本文所用，“抗体”是可以特异性或选择性结合靶蛋白的任何分子。抗体可以包括或可以是抗体或其部分/片段，其中部分/片段显示与全长抗体基本相同的结合活性。抗体还可包括多价分子、多特异性分子(例如，diabody)、融合分子、aptimer、avimer或其他天然存在或重组产生的分子。可用于本发明的示例性抗体包括抗体样分子。抗体样分子是可以通过与靶分子结合而表现出功能的分子(参见，例如currentopinioninbiotechnology2006,17:653-658；currentopinioninbiotechnology2007,18:1-10；currentopinioninstructuralbiology1997,7:463-469；proteinscience2006,15:14-27)，并且包括，例如，darpins(wo2002/020565)、affibody(wo1995/001937)、avimer(wo20011/wo2005/040229)、adnectin(wo2002/032925)和fynomers(wo2013/135588)。一般而言，术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于，单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全人抗体和抗体片段等，只要它们表现出所需的抗原结合活性。本发明中的抗体还可以是嵌合抗体、重组抗体、重组抗体的抗原结合片段，或人源化抗体。[0310]术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指非完整抗体的分子，其包含完整抗体的一部分并结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于fv、fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2；diabody；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；和由抗体形成的多特异性抗体。[0311]术语“配体”是指以某种方式与另一种物质相互作用的物质。在本发明的上下文中，当在配合物的上下文中使用时，“配体”是指包含能够与路易斯酸形成配位键的路易斯碱的分子。在其他实例中，配体是一种物质，通常是有机的，其包含可以与金属离子形成配位键的基团。配体，当与金属离子配位时，可具有本领域技术人员已知的多种结合模式，包括例如末端(即，与单个金属离子结合)和桥连(即，路易斯碱的一个原子与不止一个金属离子结合)。[0312]术语“路易斯酸”和“路易斯酸的”是本领域公认的，是指可以接受来自如上定义的路易斯碱的一对电子的化学部分。[0313]术语“路易斯碱”和“路易斯碱的”通常是指在某些反应条件下能够提供一对电子的化学部分。根据路易斯碱和金属离子的身份，路易斯碱可以具有在某些配合物中提供单电子的特征，但对于大多数目的而言，优选将路易斯碱理解为双电子供体。路易斯碱性部分的实例包括，不带电荷的化合物，例如醇、硫醇和胺，以及带电荷的部分，例如醇盐、硫醇盐、碳负离子和各种其他有机阴离子。在某些实例中，路易斯碱可由单个原子组成，例如氧化物。[0314]术语“配位”或“配位的”是指配体和金属阳离子之间的相互作用。[0315]本发明上下文中的术语“诊断物”或“诊断剂”涉及诊断类型的试剂。非限制性实例是可随后使用正电子发射断层扫描(pet)或单光子发射计算机断层扫描(spect)成像或本领域技术人员已知的其他方法检测的放射性核苷酸、可通过本领域已知的方法检测的荧光部分和酶活性部分。诊断剂还可以包括包含与其相连的放射性核苷酸、荧光团或酶的抗体。[0316]术语“药物”涉及任何治疗性或预防性物质，包括但不限于小分子、生物药(例如抗体)。一种优选的药物是抗体。[0317]本发明通过以下附图和实施例举例说明。[0318]附图简述:[0319]图1：[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物的化学反应性。[0320]在co2 和co3 配合物中心具有固定化的his6-gfp(seqidno:14)的nta珠，与不同的螯合剂以及还原剂和250mm咪唑的组合一起温育，并测量洗脱的his6-gfp的量。由于co3 中心的动力学惰性，当以[co(iii)(nta)(his6-gfp)]的形式固定在珠子上时，his6-gfp几乎不会被洗脱。图改编自wegnerandspatz,2013(wegnerandspatz,2013)。[0321]图2：通过[co(iii)(nta)]化学标记his标签蛋白的方法示意图。[0322]按wegner&spatz(wegnerandspatz)于2013年公布的，通过氧化预先形成的[co(ii)(nta)(his-蛋白)]配合物形成[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物。nta预先加载co2 离子(来自co(ii)cl2)并与带有his标签的蛋白质一起温育。最后，通过用20mmh2o2氧化整个蛋白质配合物1小时，将co2 中心转化为co3 。然而，这种方法有一个主要缺点，即，氧化步骤会影响所缀合蛋白的功能和稳定性。此外，连接到nta部分的缀合物也会受到氧化过程的影响。[0323]b按照zatloukalová和kucerova于2006年发表的(zatloukalova和kucerova，2006)，通过氧化预先形成的[co(ii)(ida)(h2o)3]配合物形成[co(iii)(ida)(his-蛋白)]配合物。ida预加载co2 离子(来自co(ii)cl2)，通过用20mmh2o2.氧化[co(ii)(ida)(h2o)3]配合物1小时，将co2 中心转化为co3 。随后，[co(iii)(ida)(h2o)3] 配合物与带有his标签的蛋白质一起温育。由于配合物形成非常缓慢且结合效力低，该方案具有局限性。此外，连接到ida部分的缀合物也会受到氧化过程的影响。[0324]c使用钴(iii)碳酸盐形成[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物。nta预载来自钴(iii)碳酸盐(例如na3[co(iii)(co3)3]*3h2o)的co3 离子，以形成本发明的配合物。然后将配合物与带有his标签的蛋白质一起温育。该方案是用于缀合his标签蛋白质的一个非常简单的工作流程，该缀合可以在温和的反应条件下进行。由于反应可以在生理缓冲条件下连续进行，因此蛋白质和nta缀合物(即,标记物(例如荧光团)和/或载体)的功能可以得到完全保留。此外，与方案b中的两个水配体相比，碳酸根配体允许更快、更有效的蛋白质结合。[0325]d使用铂(iv)硝酸盐形成[pt(iv)(nta)(his-蛋白)]配合物。nta预载来自硝酸铂(iv)溶液的pt4 离子以形成本发明的配合物。然后将配合物与带有his标签的蛋白质一起温育。该方案是用于缀合his标签蛋白质的一个非常简单的工作流程，可以在温和的反应条件下进行。与方案b中的两个水配体相比，硝酸根配体允许更快和更有效的蛋白质结合。[0326]图3：用过氧化氢氧化荧光团。将不同的荧光团与0.05％h2o2温育约21小时，之后与1％h2o2温育。每15(0.05％h2o2)到30(1％h2o2)分钟测量一次荧光团的荧光。在h2o2处理期间，所有荧光团都显示出荧光强度的降低，说明使用h2o2的氧化步骤会干扰标记物的功能和稳定性。[0327]图4：通过h2o2在钴氧化过程中引起的蛋白质降解和his标签断裂。his标签蛋白(3,3μm)在有或没有66μmcocl2和20mmh2o2的情况下温育1小时。使用与辣根过氧化物酶偶联的α-his6-标签-抗体(克隆h-3)通过蛋白质印迹分析了蛋白质稳定性和his-标签断裂。在暴露于钴和h2o2后，蛋白质自发地显示出部分降解迹象以及his标签的断裂。所示图像上的凝胶泳道源自相同的凝胶/膜。[0328]图5：nta及其钴配合物的1h-nmr谱。[0329]anta的1h-nmr测量显示在～3.6ppm的峰，这与使用软件nmrpredict(https://www.nmrdb.org/new_predictor/index.shtml？v＝v2.103.0；2019年4月版)，参见banfiandpatiny,2008；castilloetal.2011；aires-de-sousaetal.2002)以insilco方式产生的谱相符。b当nta与co2 和d2o配合形成[co(ii)(nta)(d2o)2]-(用cocl2*6h2o合成)时，峰从～3.6ppm位移到～3.8ppm。c d当用na3[co(iii)(co3)3]*3h2o(c)或k3[co(iii)(co3)3]*3h2o(d)产生配合物时，峰进一步位移到～1.9ppm，表明存在期望的碳酸根配合物[co(iii)(nta)(co3)]2-。所有ppm位移均相对于在4.7ppm的剩余h2o的峰进行归一化。[0330]图6：通过[co(iii)(nta)(co3)]2-获得的[co(iii)(nta)(his6-percevalhr)]配合物的稳定性。在ni2 和co3 配合物中心(后者由na3[co(iii)(co3)3]*3h2o产生)具有固定化的his6-percevalhr(seqidno:15)的nta珠，用pbs或咪唑(250mm)洗涤，然后保留在珠子上的his6-percevalhr量通过荧光测量来确定。通过[co(iii)(co3)3]盐产生的[co(iii)(nta)(his6-percevalhr)]配合物由此在咪唑中显示出与通过h2o2氧化过程形成的配合物相似的化学稳定性(与图1相比)。误差线： /-sd；p值：《0.001：***；《0.01：**；《0.05：*；≥0.05：不显著。[0331]图7：蛋白质与[co(iii)(nta)]配合物的结合。[0332]用[ni(ii)(nta)(h2o)2]-,[co(iii)(nta)(h2o)2]或[co(iii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖珠与his6-gfp(seqidno:14)一起温育。[0333]a在不同时间点通过荧光测量上清液，确定剩余的未结合蛋白。结合碳酸根分子的[co(iii)(nta)]配合物结合蛋白质的速度，显著地快于结合水分子的[co(iii)(nta)]配合物。[0334]b温育312小时后，用缓冲液或250mm咪唑洗涤珠子，并通过荧光测量确定珠子上保留的his6-gfp量。所有[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物在咪唑中都显示出类似的化学稳定性。然而，用[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物官能化的珠子比预装[co(iii)(nta)(h2o)2]的珠子结合显著更多的蛋白质。误差线： /-sd；p值：《0.001：***；《0.01：**；《0.05：*；≥0.05：不显著[0335]图8：缓冲物质对蛋白质结合的影响。[0336]a b：用[co(iii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖珠在不同的缓冲液中与his6-gfp(seqidno:14)一起温育。不同时间点上通过上清液的荧光测量来确定剩余的未结合蛋白。在基于mes和bis-tris的缓冲溶液中，与基于tris的缓冲液相比，配合物的形成速度更快，并且与基于tris和hepes的缓冲液相比，也更有效。图b是图a在实验开始后的0和3小时的时间点的放大图。误差线： /-sd。[0337]图9：[co(iii)(nta)(co3)]2-和[co(iii)(nta)(h2o)2]的uv-vis光谱[0338][co(iii)(nta)(co3)]2-和[co(iii)(nta)(h2o)2]在室温下水溶液中的可见吸收光谱。[co(iii)(nta)(co3)]2-通过将nta与na3[co(iii)(co3)3]*3h2o一起温育而产生，并且[co(iii)(nta)(h2o)2]通过以下方法产生：用h2o2氧化通过nta与co(ii)cl2*6h2o温育而形成的[co(ii)(nta)(h2o)2]配合物。两个最大值中每一个的峰位移表明[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物中存在碳酸根配体。[0339]图10：co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的形成和稳定性取决于na3[co(iii)(co3)3]*3h2o与nta的温育时间和温度[0340]nta官能化的琼脂糖珠在4℃(a),25℃(b)和70℃(c)温育不同的时间段。随后，将得到的[coiii)(nta)(co3)]2-配合物与his6-gfp温育48小时。最终[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性通过使用基于hepes的缓冲液或在缓冲液中的250mm咪唑进行严格洗涤来测试。固定在珠子上的蛋白质量通过bca测定法确定。随着na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的增加，当蛋白质随后在25℃温育48小时后，稳定配合物的百分比以及珠子上固定的his6-gfp增加。随着温度升高，更早达到固定的蛋白的饱和。误差线： /-sd[0341]图11：[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的形成和稳定性取决于[co(iii)(nta)(co3)]2-与his6-gfp的温育时间和温度[0342][coiii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖磁珠在4、25和37℃下温育不同时间段，最终[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性通过使用蛋白质结合缓冲液或在缓冲液中的250mm咪唑进行严格洗涤来测试。基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，确定固定在珠上的蛋白质量。a基于其相对荧光，在咪唑处理后固定在珠上的his-gfp。随着蛋白质温育时间越长，更多的蛋白质可以固定在珠子上，在3.5小时时开始达到饱和平台。没有观察到蛋白质温育温度对最终配合物的产量的影响。b与缓冲液洗涤相比，咪唑处理后固定在珠子上的his-gfp的百分比。所有产生的配合物都表现出对250mm咪唑处理的高稳定性。误差线： /-sd[0343]图12：使用k3[co(iii)(co3)3]*3h2o的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物形成和稳定性[0344]nta官能化的琼脂糖磁珠与k3[co(iii)(co3)3]*3h2o温育指定时间，然后将his6-gfp与产生的[coiii)(nta)(co3)]2-配合物温育。最终[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性通过用蛋白质缓冲液(“缓冲液”)或在缓冲液中的250mm咪唑(“咪唑”)严格洗涤来测试。基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，确定固定在珠上的蛋白质量。通过k3[co(iii)(co3)3]*3h2o产生的[coiii)(nta)(co3)]2-配合物也可以与his-gfp配位形成稳定的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物。误差线： /-sd；p值：《0.001：***；《0.01：**；《0.05：*；≥0.05：不显著[0345]图13：使用10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育在不同缓冲系统中[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的形成及其配合物稳定性[0346]在10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间后，[(coiii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖磁珠与his6-gfp在不同缓冲系统中温育不同的时间段。最终[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性通过用缓冲溶液(“缓冲液”)和在缓冲液中的250mm咪唑(“咪唑”)严格洗涤来测试。基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，确定固定在珠上的蛋白质量。a咪唑处理后固定在珠子上的蛋白质量；b在15分钟蛋白质温育后在咪唑处理前后固定在珠子上的his-gfp。所有蛋白质结合缓冲系统都可以形成稳定的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物，但结合蛋白质的效率和最终配合物的稳定性百分比各不相同。误差线： /-sd[0347]图14：使用48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育在不同缓冲系统中[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的形成及其配合物稳定性[0348]在48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育后，[coiii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖磁珠与his6-gfp在不同缓冲系统中温育不同的时间段。最终[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性通过使用分析缓冲液(“缓冲液”)或在分析缓冲液中的250mm咪唑(“咪唑”)进行严格洗涤来测试。基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，确定固定在珠上的蛋白质量。a咪唑处理后固定在珠子上的蛋白质量；b-e在1分钟(b)、15分钟(c)、1小时(d)或24小时(e)蛋白质温育后，使用或不使用咪唑处理，固定在珠子上的his-gfp。所有蛋白质结合缓冲系统都可以形成稳定的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物，但结合蛋白质的效率各不相同。误差线： /-sd[0349]图15：在不同ph值下[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的形成及其配合物稳定性[0350]在48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育后，[coiii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖磁珠与his6-gfp在基于bistris-或hepes的缓冲系统中在不同ph值温育不同的时间段。最终[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性通过使用分析缓冲液(“缓冲液”)或在分析缓冲液中的250mm咪唑(“咪唑”)进行严格洗涤来测试。基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，确定固定在珠上的蛋白质量。a咪唑处理后固定在珠子上的蛋白质量；b15分钟蛋白质温育后，使用或不使用咪唑处理，固定在珠子上的his-gfp。在所有ph值下都可以形成稳定的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物，但结合蛋白的效率不同。因此，效率随着蛋白质温育和蛋白质温育期间ph值的降低而增加。误差线： /-sd[0351]图16：通过[co(iii)(nta)(co3)]2-稳定固定具有his标签或富组氨酸区域的不同蛋白质[0352][co(iii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖磁珠与his-gfp、his-蛋白a、his-分选酶、his-人血清白蛋白或抗gfp小鼠igg1一起温育，最终[co(iii)(nta)(蛋白)]配合物的稳定性通过使用蛋白质结合缓冲液或在缓冲液中的250mm咪唑进行严格洗涤来测试。a蛋白质与[co(iii)(nta)(co3)]2-温育后蛋白质上清液的sds-page。分子量标记：200、150、100、75、50、37、25kda。泳道1、4、7、10和13：[co(iii)(nta)(co3)]2-温育后剩余的蛋白质。泳道2、5、8、11和14：[ni(ii)(nta)(h2o)2]-温育后剩余的蛋白质。泳道3、6、9、12和15：nta温育后剩余的蛋白质。泳道1-3：his-gfp，泳道4-6：his-蛋白a，泳道7-9：his-分选酶，泳道10-12：his-hsa，泳道13-15：抗gfp小鼠igg1。除了his-蛋白a(为高百分比)外，所有蛋白质都可以在蛋白质温育后从上清液中清除。b咪唑处理后通过bca测定法测定的珠子上的蛋白质量。所有蛋白质都可以实现稳定的[co(iii)(nta)(蛋白)]配合物形成。c使用520分选酶a活性测定试剂盒，荧光计量测定的咪唑处理前后固定的分选酶的活性。固定后分选酶仍然有活性，形成的[co(iii)(nta)(his-分选酶)]配合物可以抵抗250mm咪唑的处理。d e与固定在nta(d)或ida(e)官能化珠上的抗gfp小鼠igg1结合的gfp，基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)确定。通过gfp结合证明，固定的抗体仍具有功能。[0353]图17：ida和talon作为金属结合域。分别通过[co(iii)(ida)(co3)]-或[co(iii)(talon)(co3)]配合物产生的a[co(iii)(ida)(his-gfp)]和b[co(iii)(talon)(his-gfp)]配合物的形成和化学稳定性。na3[co(iii)(co3)3]*3h2o和之后his6-gfp蛋白的温育时间在括号中给出(na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/蛋白质温育时间)。通过使用基于hepes的缓冲液或在缓冲液中的250mm咪唑进行严格洗涤来测试化学稳定性。基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，测量固定在珠上的蛋白质量。与没有金属处理的珠子相比，使用[co(iii)(ida/talon)(co3)]2-配合物，化学稳定地固定在珠子上的his6-蛋白质显著更多。因此，与四齿talon配合物相比，具有三齿金属结合域ida的配合物的化学稳定性急剧增加。误差线： /-sd；p值：《0.001：***；《0.01：**；《0.05：*；≥0.05：不显著。[0354]图18：[co(iii)(ida)(his-蛋白)]配合物的化学反应性。[0355]用[co(iii)(ida)(his6-gfp)]配合物官能化的珠子在不同条件下温育，所述条件包括螯合剂或还原剂与250mm咪唑的组合，在珠子上保留的his-gfp量通过珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)测量。由于co3 中心的动力学惰性，his6-gfp几乎不被洗脱，表明所产生的[co(iii)(ida)(his-蛋白)]配合物的高稳定性。误差线： /-sd[0356]图19：his6-gfp与[co(iii)(ida)(co3)]-和[co(iii)(ida)(h2o)2] 的固定效率[0357]在a3小时和b24小时his6-gfp温育后，通过磁珠上co(iii)(ida)(co3)]-或[co(iii)(ida)(h2o)2] 配合物产生的[co(iii)(ida)(his-gfp)]的配合物形成效率和化学稳定性。co(iii)(ida)(co3)]-配合物通过将ida官能化的磁珠与na3[co(iii)(co3)3]*3h2o温育指定时间(10分钟或48小时)而产生。通过使用基于hepes的缓冲液或在缓冲液中的250mm咪唑进行严格洗涤来测试化学稳定性。基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，测量固定在珠上的蛋白质量。与用[co(iii)(ida)(h2o)2] 配合物官能化的珠子相比，使用10minna3[co(iii)(co3)3]*3h2o温育制备的[co(iii)(ida)(co3)]-配合物，有显著更多的his6-蛋白化学稳定地固定在珠子上。在24小时蛋白质温育时间后，用48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o温育制备的[co(iii)(ida)(co3)]-配合物优于[co(iii)(ida)(h2o)2] 配合物。所有[co(iii)(ida)(his-gfp)]配合物均表现出对咪唑的高化学稳定性。误差线： /-sd；p值：《0.001：***；《0.01：**；《0.05：*；≥0.05：不显著[0358]图20：相对于氧气处理[co(ii)(金属结合域)(his-gfp)]，通过[co(iii)(ida/nta)(co3)]形成[co(iii)(ida/nta)(his-gfp)]化学稳定配合物。通过[co(iii)(金属结合域)(co3)]2-配合物(na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/蛋白温育时间)，或通过用氧气(8小时)或过氧化氢(20mm，1小时)处理氧化[co(ii)(金属结合域)(his-gfp)]，在磁珠上产生的a[co(iii)(ida)(his-gfp)]或b[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的化学稳定性，用基于hepes的缓冲液或在缓冲液中的250mm咪唑处理，以进行攻击。基于珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，测量固定在珠上的蛋白质量。与8小时氧气处理[co(ii)(金属结合域)(his-gfp))]相比，使用[co(iii)(金属结合域)(co3)]配合物在珠子上化学稳定地固定了显著更多的his6-蛋白。误差线： /-sd；p值：《0.001：***；《0.01：**；《0.05：*；≥0.05：不显著[0359]图21：在表面上形成[co(iii)(hs-peg-nta)(his-gfp)]配合物[0360]his-gfp通过[co(iii)(hs-peg-nta(co3)]2-配合物固定在金纳米结构的玻璃表面。纳米结构金点通过巯基-peg-nta官能化，然后与na3[co(iii)(co3)3]*3h2o温育以形成[co(iii)(hs-peg-nta(co3)]2-配合物，随后通过形成[co(iii)(hs-peg-nta)(his-gfp)]配合物，将his6-gfp固定在配合物上。金点之间所有表面都用短peg层钝化，以避免与玻璃表面的非特异性蛋白质相互作用。基于表面上的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)确认gfp固定在表面上，确定了固定化的his-gfp量。“仅peg”：钝化的表面；“peg/gfp”：与his-gfp温育的钝化表面；“无金属”：用硫醇-peg-nta和his-gfp温育的钝化表面；“[co(iii)(nta)(his-gfp)]”：用硫醇-peg-nta、na3[co(iii)(co3)3]*3h2o和his-gfp温育的钝化表面。[0361]图22：在溶液中形成[co(iii)(nta-x-生物素)(his-gfp)]配合物[0362]his-gfp通过[(coiii)(nta-x-生物素)(co3)]配合物与生物素部分偶联，其中通过温育na3[co(iii)(co3)3]*3h2o与nta-x-生物素产生[(coiii)(nta-x-生物素)(co3)]配合物，之后his-gfp与所得配合物温育不同的温育时间。最终的配合物通过生物素-链霉亲和素相互作用，固定在用链霉亲和素官能化的珠子上。根据珠浆的荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，确定固定的蛋白的量作为生物素化蛋白的量度。a[co(iii)(nta-x-生物素)(his-gfp)]配合物在10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta-x-生物素和30分钟[coiii)(nta-x-)(co3)]/his-gfp温育后产生，固定在链霉亲和素珠上。对于所有的na3[co(iii)(co3)3]*3h2o与nta比率，显著量的his-gfp可以被生物素化并固定在珠子上。较高的na3[co(iii)(co3)3]*3h2o比率导致标记率增加。b[co(iii)(nta-x-生物素)(his-gfp)]配合物在10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta-x-生物素和30分钟或48小时[coiii)(nta-x-生物素)(co3)]/his-gfp温育后产生，固定在链霉亲和素珠上，然后用在缓冲液中的250mm咪唑严格洗涤。随着蛋白质温育时间的增加，固定化并因此化学稳定的配合物的量增加。误差线： /-sd；p值：《0.001：***；《0.01：**；《0.05：*；≥0.05：不显著[0363]图23：his6-gfp固定在[pt(iv)(nta)(no3)]官能化珠上[0364]nta官能化的琼脂糖珠与硝酸铂(iv)温育10分钟，然后与his6-gfp温育30分钟。形成的[pt(iv)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性用250mm咪唑攻击，珠子上的固定蛋白通过bca测定来确定。可以证明通过[pt(iv)(nta)(no3)]配合物稳定固定了显著量的蛋白质。此外，金属结合配体硝酸根的使用，允许容易和快速的蛋白质与配合物结合。误差线： /-sd；p值：《0.001：***；《0.01：**；《0.05：*；≥0.05：不显著实施例:[0365]实施例1：比较[co(ii)(nta)(his6-gfp)]和[co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0366]将具有固定的[co(ii)(nta)(his6-gfp)]和[co(iii)(nta)(his6-gfp)]的珠子等分试样，与强螯合剂或与广泛使用的还原剂和250mm咪唑的组合，一起温育，以证明基于co3 的配合物在化学稳定性方面优于常用的基于ni2 或co2 的配合物。[0367]his6-gfp(seqidno:14)使用质粒pethis6gfptevlic(addgene#29663)(pedelacqetal.2006)在大肠杆菌bl21(de3)中表达，并如wegner和spatz(wegnerandspatz,2013)所述，通过ni2 -nta-珠纯化。[0368]ni2 -nta琼脂糖树脂(novagen)，1)用9个珠体积的ddh2o洗涤，2)用3个珠体积的0.1medtaph7.5洗涤，3)用9个珠体积的缓冲液a(50mmtris-hclph7.4，300mmnacl)洗涤三次,4)用1.5个珠体积的0.1mcocl2*6h2o洗涤，5)用9个珠体积的缓冲液b(含250mm咪唑的缓冲液a)洗涤，和6)用9个珠体积的缓冲液a洗涤三次。最后，通过在缓冲液a中的一个珠体积的10μmhis6-gfp中温育，将his6-gfp加载到珠上。在每个步骤之间，珠浆在300g离心1分钟，滗析上清液。为了获得[co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物，将带有固定在co2 -nta上的his6-gfp的珠子，在室温下在含有20mmh2o2的缓冲液a中温育1小时(之后用作含co2 的对照的珠子，在不含h2o2的缓冲液a中温育)。随后，在用缓冲液a洗涤珠子几次后，将珠子重新悬浮在2个珠体积的缓冲液a中，并分配为150μl等分试样用于稳定性实验。最后，将50μl每种测试试剂(最终浓度：螯合剂：250mm咪唑、25mmnta、25mmedta；还原剂(半胱胺、dtt、tcep、抗坏血酸盐)：1mm补充有250mm咪唑)加入等分试样。在室温下温育1小时后，使用读板器(tecan，infinite2000)分析100μl上清液的gfp荧光(λex＝480nm,λem＝510nm)。所有实验一式两份进行。[0369]如图1所示，当his6-gfp与co3 中心结合时，在与测试的螯合剂或还原剂一起温育后，仅观察到非常少量的洗脱蛋白质。相比之下，与co2 珠子结合的his6-gfp在相同条件下被完全洗脱。因此，[co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物对强螯合剂的破坏和还原为co2 都是惰性的。[0370]实施例2：过氧化氢氧化荧光团[0371]如在实施例1描述的方法中以及如先前在现有技术中描述(参见wegner和spatz，2013),使用h2o2将co2 氧化成co3 ，不仅损害所连接的蛋白质，而且也对nta-缀合物例如标记物或载体的功能性产生负面影响。例如，几种荧光团的荧光在h2o2氧化后降低，如下所示。[0372]荧光团缀合物在磷酸盐缓冲盐水(pbs)(thermo；18912014)中稀释(最终浓度：5μg/ml荧光素(riedeldehaen；28802)；185μg/mlalexa488偶联的抗体(invitrogen；a11039/ml)；9μg/mlfitc偶联的抗体(thermo；ma1-81891)；5μmatto488偶联的ni2 -nta(sigma；39625))，在黑色96孔板中100μl每种荧光团溶液与0.05％h2o2温育约21小时，然后在1％h2o2中再温育22小时。在读板器(tecan；spark)上每15分钟(0.05％h2o2)或30分钟(1％h2o2)测量一次荧光强度(λex＝490nm,λem＝535nm)。[0373]图3中描绘的荧光测量值表明，所有分析的荧光团在与h2o2温育后都显示了荧光强度的明显降低。[0374]实施例3：在h2o2氧化钴期间的蛋白质降解和his标签断裂[0375]如实施例1描述的方法中以及wegner和spatz(wegner和spatz2013)先前描述的，使用h2o2将co2 氧化成co3 ，这可自发地引发芬顿样反应(hanna,kadiiska等，1992)，导致蛋白质降解和组氨酸残基的断裂(davies1987,stadtman1990)，如在抗his标签的蛋白质印迹中所证实。[0376]使用质粒prsetb-percevalhr(addgene#49081)(tantamaetal.2013)在大肠杆菌dh5α中表达荧光蛋白percevalhr(seqidno:15)，并通过ni2 -nta柱纯化，如(tantama等人，2013年)中描述。[0377]3.3μm带his7标签的percevalhr蛋白与33μmcocl2*6h2o在蛋白质缓冲液(50mmtrisph7.4，150mmnacl)中混合，并在室温下温育2分钟。随后，加入20mmh2o2并将混合物在21℃温育1.5小时。对于不含钴和/或h2o2的对照样品，使用等体积的蛋白质缓冲液。最后，用33mmedtaph8.0淬灭反应。[0378]对于蛋白质印迹分析，将蛋白质样品与sds样品缓冲液(25mmtris-hclph6.8、192mm甘氨酸、0.1％(w/v)sds、0.002％(w/v)溴酚蓝、100mmdtt(最终浓度))混合，在70℃变性10分钟，然后将84pmol蛋白质加载到sds-page凝胶上(7％(w/v)丙烯酰胺-双丙烯酰胺(37.5:1)，375mmtris-hclph8.8，0.1％(w/v)sds，0.1(w/v)过硫酸铵，0.1％(v/v)temed；运行条件：120v恒定，laemmli运行缓冲液(25mmtris-hclph8.8，192mm甘氨酸，0.1％(w/v)sds))。蛋白质分离后，将蛋白质印迹在硝酸纤维素膜(whatman,10401196)上，并在室温下用tbs-t(20mmtris-hclph7.5，150mmnacl，0.1％(v/v)tween20)洗涤膜5分钟，然后在室温下用tbs-t中的5％(w/v)牛血清白蛋白封闭1小时。最后，将膜与200ng/ml辣根过氧化物酶标记的抗his-标签抗体(克隆h-3)(santacruz，sc-8036hrp)一起温育，用tbs-t洗涤三次10分钟，并在基于鲁米诺的增强型化学发光辣根过氧化物酶(hrp)底物溶液(thermo,34076)中室温温育5分钟。使用las3000系统(fujifilm)检测来自带有his标签的蛋白质的化学发光信号。[0379]图4中的蛋白质印迹表明，蛋白质与钴以及h2o2组合温育后，可发生蛋白质降解以及自发的his标签断裂，如弥散性的低强度蛋白质条带所示。[0380]实施例4：[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物的合成[0381]为了完全避免使用h2o2，开发了一种使用co(iii)碳酸盐(例如na3[co(iii)(co3)3]*3h2o和k3[co(iii)(co3)3]*3h2o)的新方法，用于形成[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物。该配合物形成过程如图2c示意性显示。在第一步中，所述co(iii)盐与nta一起温育以形成[co(iii)(nta)co3]2-。应用质子核磁共振谱(1h-nmr)来证明[co(iii)(nta)co3]2-配合物的成功形成。[0382]三(碳酸根)合钴(iii)酸钠三水合物的合成[0383]三(碳酸根)合钴(iii)酸钠三水合物(na3[co(iii)(co3)3]*3h2o)，如bauer和drinkard(baueranddrinkard1960)所述合成。简而言之，将在50mlddh2o中的0.1摩尔(29.1克)co(ii)(no3)*6h2o(sigma；1.02554)和10ml30％过氧化氢(riedel-dehaen；18312)的混合物，在搅拌下逐滴加入0.5摩尔(＝42.0克)碳酸氢钠(merck；1.06329)在50mlddh2o中的冰冷浆液。将混合物在冰上温育并持续搅拌1小时。随后，将橄榄色产物过滤并分别用冷水、无水乙醇和无水乙醚洗涤三次。最后，将产物在真空下干燥过夜并在-20℃氮气气氛中储存。[0384]三(碳酸根)合钴(iii)酸钾三水合物的合成[0385]按照shibata的描述(shibata1983；改编自mori等人，1956)，在溶液中合成了三(碳酸根)合钴(iii)酸钾三水合物(k3[co(iii)(co3)3]*3h2o)。简而言之，将在24mlddh2o中的0.1摩尔(24g)co(ii)cl2*6h2o(honeywell；255599)和40ml30％过氧化氢的混合物，在搅拌下逐滴加入到0.7摩尔(70g)碳酸氢钾(honeywell；237205)在70mlddh2o中的冰冷浆液中。随后，将所得绿色溶液抽滤并直接用于后续实验。[0386]制备[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物[0387]为了从钠盐产生[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物，将580μmole(210mg)na3[co(iii)(co3)3]*3h2o添加到2ml在ddh2o中的1m碳酸氢钠和2m次氮基三乙酸三钠盐(sigma；n0253)中，将浆液超声处理30分钟。在70℃温育72小时后，将3ml的1m碳酸氢钠添加到现在呈粉红色的浆液中，并将混合物在70℃超声处理2小时。随后，将紫色上清液进行nmr分析。对于由钾盐制备的配合物，k3[co(iii)(co3)3]*3h2o在溶液中由0.1摩尔cocl2*6h2o合成(见上文)，随后加入0.1摩尔次氮基三乙酸三钠盐(25.7克)和60mlddh2o，如(shibata1983)中所述。在60℃连续搅拌温育3小时后，过滤所得紫色溶液，并用乙酸水溶液将ph值调节至7.3。最后，将溶液在4℃温育过夜，澄清除去白色沉淀并进行nmr分析。为了获得配合物[co(ii)(nta)(d2o)]-，在d2o中从储备溶液制备5mm次氮基三乙酸(sigma；72559)和5mmcocl2*6h2o的混合物，并在室温下温育15分钟，之后进行nmr测量。为了将次氮基三乙酸溶解在d2o(carlroth；hn81.3)中，将少量10mnaoh添加到相应的储备溶液中。对于纯nta的测量，如上所述从储备溶液制备d2o中的5mm溶液。在室温下在jeolecz400s光谱仪上以400mhz的共振频率测量1h-nmr谱。为了改善信噪比，在傅立叶变换之前加入了多达32个信号。所得光谱的强度在7ppm标化，所有ppm值都相对于4.70ppm处的水峰进行了调整。[0388]通过测量纯nta及其与钴和水或碳酸根配体的配合物的h1-nmr光谱，证实了[co(iii)(nta)co3]2-配合物的形成(图5)。纯nta的氢谱显示，除了4.70ppm处普遍存在的水峰之外，还在～3.6ppm处有一个峰，这与使用软件nmrpredict进行的模拟(3.57ppm计算值)相符(https://www.nmrdb.org/new_predictor/index.shtml？v＝v2.103.0)(banfi和patiny，2008年；castillo等人，2011年；aires-de-sousa等人，2002年)。当nta与钴和水(此处由于h1-nmr测量，故使用重水(d2o))([co(ii)(nta)(d2o)2]-；图5b)或碳酸根([co(iii)(nta)(co3)]2-；图c d)形成配合物时，～3.6ppm处的原始峰分别位移至～3.8ppm(对于d2o作为配体)和位移至～1.9ppm(对于碳酸根作为配体)。无论使用钴(iii)碳酸钠或钾盐来制备配合物，都观察到了类似的峰位移。nta峰的移动表明，在配合过程中，随着其他原子靠近氢原子，nta中氢原子的磁性环境发生了变化。因此，对于用钴(iii)碳酸盐生成的配合物，观察到不同的峰位移，强烈表明在最终的钴-nta配合物中存在碳酸根配体而不是水配体。[0389]实施例5：通过[co(iii)(nta)co3]形成的[co(iii)(nta)(his6-percevalhr)]配合物的化学稳定性[0390]将具有连接到琼脂糖珠的nta的配合物[co(iii)(nta)(co3)]2-，与带有his标签的蛋白质percevalhr一起温育，以形成固定在琼脂糖珠上的[co(iii)(nta)(his6-percevalhr)]。随后，评估了[co(iii)(nta)(his6-percevalhr)]配合物的化学稳定性。作为对照，采用常规的基于ni2 -nta的基质。[0391]使用质粒prsetb-percevalhr(addgene#49081)(tantama,martinez-francoisetal.2013)，在大肠杆菌dh5α中表达荧光蛋白percevalhr(seqidno:15)，并如(tantama,martinez-francoisetal.2013)所述，通过ni2 -nta柱纯化。[0392]nta琼脂糖树脂(qiagen,1022963)，1)用10个珠体积的ddh2o洗涤，2)用3个珠体积的100mmedtaph7.5洗涤，3)用10个珠体积的ddh2o洗涤三次，并随后加入10个珠体积的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o或1mmni(ii)so4在1mnahco3中的溶液。在23℃以1100rpm在恒温振荡器中振荡温育48小时后，用10个珠体积的ddh2o洗涤珠子两次，用10个珠体积的蛋白质缓冲液(50mmtrisph7.4，150mmnacl)洗涤一次。最后，加入1个珠体积的在蛋白质缓冲液中的10μmhis6-percevalhr(seqidno:15)，并在4℃在恒温振荡器上以1100rpm振荡温育48小时，以使蛋白质结合到基质上。用10个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤两次后，加入3个珠体积的蛋白质缓冲液，并使用读板器(tecan，infinite2000)分析10μl珠浆的percevalhr荧光(λex＝500nm,λem＝545nm)。为了测试配合物的稳定性，加入10个珠体积的在蛋白质缓冲液中的250mm咪唑或单独的蛋白质缓冲液，然后通过用10个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤珠子来移除。最后，将珠子重新悬浮在3个珠体积的蛋白质缓冲液中，并分析10μl珠浆的剩余荧光。所有实验一式三份进行。[0393]如图6所示，用作对照的[ni(ii)(nta)(his6-percevalhr)]配合物对螯合剂咪唑处理显示出低稳定性。与此形成鲜明对比的是，通过钴(iii)碳酸盐形成的[co(iii)(nta)(his6-percevalhr)]配合物和[co(iii)(nta)(co3)]预配合物对咪唑表现出强稳定性。这些配合物的测量稳定性类似于用间接氧化方法(如实施例1中使用的)产生的[co(iii)(nta)(his6-percevalhr)]配合物。因此，该数据证实，令人惊奇地，通过使用[co(iii)(nta)(co3)]2-预配合物，可以高效地无需氧化步骤而形成[co(iii)(nta)(his6-percevalhr)]。[0394]实施例6：his6-gfp与[co(iii)(nta)co3]2-的结合动力学[0395]实施例4证明，可以形成[co(iii)(nta)co3]2-配合物。此外，实施例5表明，通过nta连接到珠子上的[co(iii)(nta)co3]2-配合物可以合成并令人惊讶地用于在珠子上形成[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物。我们推测，在钴(iii)中心作为配体的碳酸根可能促进[coiii(nta)(his-蛋白)]配合物的形成。为了证实这一发现，直接比较了his6-gfp对[co(iii)(nta)(h2o)2]和对[co(iii)(nta)(co3)]2-的结合效率。[0396]nta琼脂糖珠的官能化[0397]nta琼脂糖树脂(qiagen,1022963)，1)用10个珠体积的ddh2o洗涤,2)用10个珠体积的100mmedtaph7.5洗涤,3)用10个珠体积的ddh2o洗涤两次并用6.7个珠体积的ddh2o洗涤一次(对于[co(ii)(nta)(h2o)2]-和[co(iii)(nta)(h2o)2]配合物)或用10个珠体积的ddh2o洗涤两次并用6.7个珠体积的1mnahco3洗涤一次(对于[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物)。随后加入8.7个珠体积的在ddh2o中的1mmco(ii)cl2*6h2o(对于[co(ii)(nta)(h2o)2]-和[co(iii)(nta)(h2o)2]配合物)或在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o(对于[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物)。在25℃以1100rpm在恒温振荡器中温育18小时后，珠子分别用6.7个珠体积的蛋白质缓冲液(50mmtris-hclph7.4，300mmnacl)(对于[co(ii)(nta)(h2o)2]-,[co(iii)(nta)(h2o)2]配合物以及一个[co(iii)(nta)(co3)]2配合物样品)或1mnahco3(对于一个[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物样品，在图7中称作“[co(iii)(nta)(co3)]在1mnahco3中”)洗涤。对于具有最终[co(iii)(nta)(h2o)2]配合物的样品，使用6.7个珠体积的在ddh2o中的20mmh2o2进行第二次洗涤，并在25℃在恒温振荡器(1100rpm)上温育1小时。[0398]his6-gfp与官能化的nta琼脂糖珠的结合动力学[0399]将产生的珠子与3.3个珠体积的在蛋白质缓冲液(50mmtris-hclph7.4，300mmnacl)中的20μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并在4℃以1100rpm在恒温振荡器中温育。对于一个[co(iii)(nta)(co3)]2-样品(在图7中称为“[co(iii)(nta)(co3)]在1mnahco3中”)，使用1mnahco3代替蛋白质缓冲液。通过在不同时间点在读板器(tecan，spark)中测量100μl上清液的荧光强度(λex＝490nm,λem＝535nm)，分析了未结合蛋白质的分数。[0400][co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0401]如上所述，在官能化珠与his6-gfp(seqidno:14)的温育终止后，分析与珠结合的蛋白质的量。为此，珠子用6.7个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤三次，重悬在6.7个珠体积的蛋白质缓冲液中，最后使用读板器(tecan,spark)分析100μl珠浆的gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)。为了测试配合物的稳定性，加入1.7个珠体积的在蛋白质缓冲液中的1.25m咪唑(最终浓度250mm)，在25℃以1100rpm在恒温振荡器上温育10分钟，之后用6.7个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤珠子三次。最后，将珠子重新悬浮在6.7个珠体积的蛋白质缓冲液中，并分析100μl珠浆的剩余荧光。所有实验一式三份进行。[0402]这些实验的结果清楚地表明，结合碳酸根分子的co3 配合物与蛋白质结合的速度，显著快于其中水分子与co3 结合的配合物(图7a)。一致地，用[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物官能化的珠子比预装[co(iii)(nta)(h2o)2]的珠子结合显著更多的蛋白质(图7b)。此外，图7b再次证实[co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物对螯合剂(此处为咪唑)显示出强稳定性。[0403]这些实验进一步表明，在蛋白质结合之前，用1mnahco3洗涤与珠子连接的[co(iii)(nta)(co3)]2-，可以进一步促进his6-gfp的结合。不受理论的束缚，据信缓冲液中hco3-和/或co32-的存在可以阻止[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物转化为较慢的增强性[co(iii)(nta)(h2o)2]配合物。尽管在本实验中对于“[co(iii)(nta)(co3)]在1mnahco3中”的样品(见上文)也在1mnahco3存在下进行了his-蛋白质结合，但可以想到，在蛋白质结合过程中存在1mnahco3，如果有作用的话，也只有非常小程度的促进作用。这是因为在蛋白质结合过程中期望从co3 配合物中释放出碳酸根配体，而这可能因1mnahco3的存在被阻碍而不是促进。[0404]实施例7：his标签蛋白在不同缓冲系统中与[co(iii)(nta)(co3)]2-的结合动力学[0405]确定是否可以通过改变反应缓冲液的组成来改善[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物的形成。[0406]用[co(iii)(nta)(co3)]2-官能化的珠子，采用具有如下小修改的如实施例6中所述的方式制备：用5个珠体积的相应溶液进行珠子洗涤步骤1)至3)。在3)中，第二和第三洗涤步骤用1mnahco3进行。金属在6.5个珠体积中加载。在金属结合之后，珠子用5个珠体积的1mnahco3洗涤。[0407]除了以下变动外，也如实施例6中所述进行了带his标签的gfp(seqidno:14)的温育：使用5个珠体积的10μm蛋白质溶液，并且通过将50mmtrisph7.4替换为50mmbis-trisph6.0,50mmhepesph7.0,50mmmesph6.0或50mmtris-hclph7.5来适应性调整该蛋白质缓冲液。此外，蛋白质温育的前24小时在室温而不是4℃下进行。[0408]这些实验表明，当基于tris的缓冲液被hepes或特别是非配位缓冲液(例如基于mes或bistris的缓冲液)替代时，反应速度和效率可以得到显著提高。温育24小时后，使用基于mes和bistris的缓冲液时，所有蛋白质中95％被固定在珠子上，而使用基于tris的缓冲液时则为75％(图8a)。此外，比较图7a和8a的结果表明，增加用于前24小时蛋白质温育的温度和/或使用1mnahco3进行洗涤，可以促进his-蛋白质配位。当使用基于mes或bistris的缓冲液时，经过三个小时的温育后，大约80％的蛋白质可以与珠子结合。相比之下，在基于tris的缓冲液中，少于50％的蛋白质被固定在珠子上。这证明，可以在合理的时间尺度内以非常高的效率使带有his标签的蛋白质与[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物配位。[0409]值得注意的是，针对不同蛋白质缓冲液所示的ph值，是指将溶液添加到珠子之前的ph值。由于自第二洗涤步骤而留在珠子上的残留nahco3，在与蛋白质温育期间所有样品的ph值都为8.5至9(通过ph测量验证)。因此，由于所有缓冲溶液的ph值非常相似，这些实验清楚地证明，缓冲物质本身对his-蛋白质结合产生影响。所观察到的good氏缓冲剂mes和bistris相对于tris缓冲剂的更好性能，表明使用不能与co3 形成配合物的good氏缓冲剂，相对于使用可形成这种配合物的缓冲剂(例如tris缓冲剂)，是有利的。[0410]实施例8：[co(iii)(nta)(co3)]2-的uv-vis分析[0411]通过nmr，实施例4证明[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物可以形成。在以下实施例中，[co(iii)(nta)co3]2-配合物的形成由另一种技术证明，即通过uv-vis的吸光度测量来证明。[0412]制备co(iii)(nta)(co3)]2-配合物[0413]为了产生[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物，如下制备1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o在1mnahco3中的溶液：以1小时的超声处理，将该盐溶解在所述溶液中，然后通过0,22μm过滤器进行过滤。随后，在1mnahco3中制备0.95mm的该na3[co(iii)(co3)3]*3h2o在1mnahco3中的溶液和溶解在ddh2o中的0.95mmnta三钠盐(sigma；no253)的混合物。在25℃温育1小时后，在uv-vis-nir分光光度计(cary5000)上在1cm比色杯(brand；759150)中测量淡紫色溶液的可见吸光度。[0414]制备[co(iii)(nta)(h2o)2]配合物[0415]为了产生[co(iii)(nta)(h2o)2]配合物，在ddh2o中制备0.95mmco(ii)cl2*6h2o、0,95mmnta三钠盐(sigma；n0253)和20mmh2o2的混合物。在25℃下温育24小时后，在uv-vis-nir分光光度计(cary5000)上，在1cm比色杯(brand；759150)中，相对于具有ddh2o的空白，测量淡紫色溶液的可见吸光度。[0416]通过两个峰的位移，从402nm(对于[co(iii)(nta)(h2o)2]配合物)位移至390nm(对于[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物)或者从567nm位移至573nm，图9中的结果清楚地表明，[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物中碳酸根作为金属结合配体的配位。[0417]实施例9：在na3[co(iii)(co3)3]*3h2o与nta的不同温育时间和温度后his6-gfp与[co(iii)(nta)(co3)]2-的配位以及形成的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性[0418]实施例4证明[co(iii)(nta)co3]2-配合物可以通过将nta与na3[co(iii)(co3)3]*3h2o温育而形成。在下面的实施例中，研究na3[co(iii)(co3)3]*3h2o与nta的不同温育时间和温度，对his6-gfp配位到所产生的[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物上的影响、以及对最终co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的咪唑化学稳定性的影响。[0419]nta琼脂糖珠的官能化[0420]nta官能化的琼脂糖珠(qiagen；1022963)，1)用27个珠体积的ddh2o洗涤，2)用27个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用27个珠体积的ddh2o洗涤一次并用27个珠体积的1mnahco3洗涤两次。随后，加入16个珠体积的在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o，并以1400rpm在恒温振荡器中，将珠子在4℃、25℃或70℃温育所示的1分钟、10分钟、30分钟、1小时、24小时或48小时。温育后，珠子用16个珠体积的1mnahco3洗涤两次。[0421]his6-gfp固定到官能化的[coiii)(nta)(co3)]2-琼脂糖珠上[0422]将产生的珠子与12个珠体积的在蛋白质缓冲液(50mmhepesph7.2,150mmnacl)中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并在25℃以1400rpm在恒温振荡器上振荡温育48小时。在官能化的珠子与his6-gfp(seqidno:14)温育后，珠子用16个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次，并重悬于16个珠体积的蛋白质缓冲液中。[0423][co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0424]在实施所述的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物形成过程后，分析了在有和没有化学胁迫的情况下与珠子结合的蛋白质的量。为此，将珠子分成两部分(每份7.2个珠体积)，并分别用17.8个珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。用17.8个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重悬于17.8个珠体积的蛋白质缓冲液中。根据制造商的指南，在微孔板中通过bca测定(thermo,23227)确定25μl珠浆上的固定蛋白量。该实验一式三份进行。[0425]图10中显示的这些实验的结果清楚地表明，当蛋白质温育长达48小时时，na3[co(iii)(co3)3]*3h2o和nta的温育时间，与缓冲液以及咪唑处理后琼脂糖珠上固定的his-gfp量，呈正相关。对于70℃的温育，反应似乎在1分钟后已经达到其饱和点，因为不令人惊奇地na3[co(iii)(co3)3]*3h2o与nta的配位在较高的温度下被加速。此外，对于在4℃和25℃下进行的温育，如图10a和b所示，温育时间与配合物稳定性呈正相关。对于25℃温育，在10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时已经达到高配合物稳定性，而对于4℃温育，这种稳定性仅在24小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育后才达到。预计稳定的配合物形成会随着温度的升高而加速。[0426]实施例10：在不同温度下[co(iii)(nta)(co3)]2-官能化的珠子与his-蛋白结合的动力学[0427]在以下实施例中，检测在不同的his-蛋白质温育时间和三种不同温度下蛋白质与[co(iii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖磁珠的结合、以及所得[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物对咪唑的稳定性。[0428]nta琼脂糖磁珠的官能化[0429]nta官能化的琼脂糖珠(thermo；78605)，1)用26个珠体积的ddh2o洗涤，2)用26个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用26个珠体积的ddh2o洗涤两次并用26个珠体积的1mnahco3洗涤一次。随后，添加160个珠体积的在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o或1mnahco3(对于不含金属的样品)，珠子在恒温振荡器上1400rpm于25℃温育48小时。温育后，珠子用160个珠体积的1mnahco3洗涤三次。[0430]his6-gfp在官能化[coiii)(nta)(co3)]2-琼脂糖磁珠上的固定[0431]将产生的珠子与120个珠体积的在50mmhepesph7.2,150mmnacl中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并如所示，在4、25或37℃，在恒温振荡器上1400rpm振荡温育所示的1分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、3.5小时或24小时。在官能化珠与his6-gfp(seqidno:14)温育后，珠子用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次，最后重新悬浮在160个珠体积的相应洗涤缓冲液中。[0432][co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0433]在实施了所述的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物形成过程后，分析了在有和没有化学胁迫的情况下与珠子结合的蛋白质的量。为此，将珠子分成两部分，并分别用珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。用178个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重悬于178个珠体积的蛋白质缓冲液中。最后，通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，使用读板器(tecan、spark)，分析10μl珠浆的固定蛋白量。实验一式三份进行。[0434]如图11a所示，咪唑处理的珠子上固定的蛋白量，随着his-gfp与[co(iii)(nta)(co3)]2-官能化珠的温育时间而增加。温育期间的温度不影响形成的[co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物的最终产量。对于所有蛋白质温育时间和温度，可以观察到所得配合物对咪唑的高稳定性(图11b)。[0435]实施例11：使用k3[co(iii)(co3)3]*3h2o形成[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物时[co(iii)(nta)(his-gfp)]的形成和稳定性[0436]实施例4证明，通过将k3[co(iii)(co3)3]*3h2o与nta一起温育可以形成[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物。在以下实施例中，研究his-gfp与使用k3[co(iii)(co3)3]*3h2o产生的co(iii)(nta)(co3)]2-配合物的配位以及所得[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物对咪唑的化学稳定性。[0437]nta琼脂糖磁珠的官能化[0438]nta官能化的琼脂糖磁珠(thermo；78605)，1)用600个珠体积的ddh2o洗涤，2)用600个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用600个珠体积的ddh2o洗涤一次并用600个珠体积的1mnahco3洗涤两次。随后，添加160个珠体积的在1mnahco3中的1mmk3[co(iii)(co3)3]*3h2o或仅1mnahco3(对于不含金属的样品)。k3[co(iii)(co3)3]*3h2o如实施例4中所述产生。基于合成过程的100％反应效率的假设，进行浓度计算。如所示将样品在25℃以1400rpm在恒温振荡器中温育10分钟或48小时后，用160个珠体积的1mnahco3将珠子洗涤三次。[0439]his6-gfp固定到官能化的nta磁珠上[0440]将产生的珠子与120个珠体积的在蛋白质缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并在25℃在恒温振荡器上以1400rpm振荡温育如所示的1小时或48小时。在官能化珠与his6-gfp(seqidno：14)温育后，珠子用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次并重悬于160个珠体积的蛋白质缓冲液中。[0441][co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0442]在实施了所述的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物形成过程后，分析了在有和没有化学胁迫的情况下与珠子结合的蛋白质的量。为此，将珠分成两部分(每份72个珠体积)，并分别用178个珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。用178个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重悬于178个珠体积的蛋白质缓冲液中，并通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，使用读板器(tecan、spark)，分析了10μl珠浆的固定蛋白量。实验一式三份进行。[0443]图12中描绘的结果清楚地表明，his-gfp可以与由k3[co(iii)(co3)3]*3h2o与nta温育形成的co(iii)(nta)(co3)]2-配合物配位。所得的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物对咪唑处理显示出高化学稳定性。因为k3[co(iii)(co3)3]*3h2o在较高浓度是可溶的，因此，与使用na3[co(iii)(co3)3]*3h2o相比，使用k3[co(iii)(co3)3]*3h2o可以在较高浓度实施与金属结合域的温育。[0444]实施例12：在不同蛋白质结合缓冲液中his6-gfp与[co(iii)(nta)(co3)]2-的配位以及形成的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性[0445]实施例7展示了不同缓冲物质对his标签蛋白质与[co(iii)(nta)(co3)]2-的结合动力学的影响。在以下实施例中，研究在多种不同的缓冲系统中，蛋白质与两种不同na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的[co(iii)(nta)(co3)]2-官能化琼脂糖磁珠的结合，以及所得[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物对咪唑的稳定性。[0446]nta琼脂糖磁珠的官能化[0447]nta官能化的琼脂糖珠(thermo；78605)，1)用182个珠体积的ddh2o洗涤，2)用182个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用182个珠体积的ddh2o洗涤一次并用182个珠体积的1mnahco3洗涤两次(对于采用10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品)，或用182个珠体积的ddh2o洗涤两次并用182个珠体积的1mnahco3洗涤一次(对于具有48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品)。随后，添加160个珠体积的在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o或1mnahco3(对于不含金属的样品)，并将珠子在25℃和1400rpm在恒温振荡器上温育所示的10分钟或48小时。温育后，用160个珠体积的1mnahco3，对于10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品，将珠子洗涤两次，或对于48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品，将珠子洗涤三次。[0448]his6-gfp固定到官能化的[coiii)(nta)(co3)]2-琼脂糖磁珠上[0449]将产生的珠子与120个珠体积的在基于tris-、hepes-、mes-、mops-、bistris-、aces-、pipes-、bes-、caps-或taps-的蛋白质缓冲液(50mm缓冲液ph7.2,150mmnacl)或pbs中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并在25℃在恒温振荡器上以1400rpm振荡温育所示的1分钟、15分钟、1小时或24小时。在将官能化珠与his6-gfp(seqidno:14)温育后，对于具有10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品，用160个珠体积的蛋白质缓冲液，或对于具有48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品，用分析缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)，将珠子洗涤一次，并最后重新悬浮在160个珠体积的相应洗涤缓冲液中。[0450][co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0451]在实施了所述的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物形成过程后，分析了在有和没有化学胁迫的情况下与珠子结合的蛋白质的量。为此，对于具有48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品，珠子被分成两部分(每份72个珠体积)，并分别用178个珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。用178个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重悬于178个珠体积的蛋白质缓冲液中。使用读板器(tecan，spark)通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，分析10μl珠浆的固定蛋白量。对于具有10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品，在进行如下洗涤处理之前和之后分析珠子，所述洗涤处理包括：首先用160个珠体积的在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑，然后用160个珠体积的蛋白质结合缓冲液进行洗涤。实验一式三份进行。[0452]结果清楚地表明，在所有缓冲系统中，带his标签的蛋白质都可以以化学稳定的方式固定在珠子上。与具有10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品(图13)相比，在具有48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品中稳定配合物的比例更高(图14)。对于所有缓冲系统和na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间，咪唑处理后固定蛋白的量随着蛋白质温育时间的增加而增加。因此，与10分钟na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间相比，在具有48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品中不同的缓冲系统对反应动力学的影响更大。预计，在48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品上，使用hepes、mes、mops和pipes缓冲剂，在短的蛋白质温育时间，导致珠子上增加量的稳定固定的蛋白质(图14b-d)。对于较长的温育时间，预计(图14e)，hepes、mes、mops或aces是首选的good氏缓冲剂。[0453]实施例13：ph对his6-gfp与[co(iii)(nta)(co3)]2-的配位和形成的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的稳定性的影响[0454]实施例7表明，蛋白质结合缓冲液的ph对带his标签的蛋白质与[co(iii)(nta)(co3)]2-的结合动力学的影响。在以下实施例中，在两种蛋白质结合缓冲系统中，各使用5种不同的ph值，检测蛋白质与[co(iii)(nta)(co3)]2-官能化的琼脂糖磁珠的结合以及所得[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物对咪唑的稳定性。[0455]nta琼脂糖磁珠的官能化[0456]nta官能化的琼脂糖珠(thermo；78605)，1)用26个珠体积的ddh2o洗涤，2)用26个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用26个珠体积的ddh2o洗涤两次并用26个珠体积的1mnahco3洗涤一次。随后，添加160个珠体积的在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o或1mnahco3(对于不含金属的样品)，然后将珠子在25℃下在恒温振荡器中以1400rpm温育48小时。温育后，对于48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育时间的样品，用160个珠体积的1mnahco3将珠子清洗三次。[0457]his-gfp固定到官能化的[coiii)(nta)(co3)]2-琼脂糖磁珠上[0458]将产生的珠子与120个珠体积的在基于bistris或hepes的蛋白质缓冲液(50mm缓冲液，150mmnacl)中的10μmhis6-gfp(seqidno：14)混合，对于基于bistris的系统，ph为5.5、6.0、6.5、7.0或7.5，对于基于hepes的系统，ph为ph7.5、8.0、8.5、9.0或9.5，并在25℃下在恒温振荡器上以1400rpm振荡温育所示的1分钟、15分钟、1小时或24小时。在官能化珠与his6-gfp(seqidno:14)温育后，珠子用160个珠体积的分析缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)洗涤一次，最后重悬于160个珠体积的分析缓冲液中。[0459][co(iii)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0460]在实施所述的[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物形成过程后，分析了在有和没有化学胁迫的情况下与珠子结合的蛋白质的量。为此，将珠子分成两部分(每份72个珠体积)，并分别用178个珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。在用178个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重悬于178个珠体积的蛋白质缓冲液中。使用读板器(tecan，spark)通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)分析10μl珠浆的固定蛋白量。实验一式三份进行。[0461]结果清楚地表明，在所有ph值下，带his标签的蛋白质都可以以化学稳定的方式固定在珠子上。因此，可以以化学稳定的方式固定高百分比的his-gfp，并且咪唑处理前后的固定蛋白量随着蛋白质温育时间的增加而增加(图15a)。使用在较低ph值的蛋白质结合缓冲液，最终[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的配合物形成效率得到急剧的增加(图15b)。不仅可以观察到基于ph值的效率差异，还可以观察到源自缓冲系统的效率差异(ph7.5bistrisvs.hepes)。[0462]实施例14：不同蛋白质通过其his标签或富含组氨酸的区域固定到[co(iii)(nta)(co)3]2-或[co(iii)(ida)(co)3]-官能化珠上[0463]几个实施例证明his6-gfp可以通过[co(iii)(nta)(co)3]2-或[co(iii)(ida)(co)3]-固定到珠子上。在以下实施例中，测试不同的his标签蛋白以及抗体(通过其fc部分的富含组氨酸区域配位)在珠子上的固定。此外，还研究了固定的酶(分选酶)和抗体(gfp与固定的抗gfpigg1的结合)的功能。[0464]nta官能化的琼脂糖磁珠(thermo；78605)或ida官能化的磁珠(cubebiotech；30805)，1)用33个珠体积的ddh2o洗涤，2)用33个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用33个珠体积的ddh2o洗涤一次并用33个珠体积的1mnahco3洗涤两次(对于不具有金属和具有钴中心的样品)，或用33个珠体积的ddh2o洗涤三次(对于具有镍中心的样品)。随后，添加160个珠体积的在1mnahco3中的na3[co(iii)(co3)3]*3h2o或1mnahco3(对于不含金属的样品)或在ddh2o中的1mmniso4(对于具有镍中心的样品)，珠子在25℃和1400rpm在恒温振荡器中温育10分钟。温育后，珠子用160个珠体积的1mnahco3或ddh2o(对于具有镍中心的样品)洗涤三次。[0465]蛋白质在官能化的[coiii)(nta/ida)(co3)]2-琼脂糖磁珠上的固定[0466]将产生的珠子与120个珠体积的蛋白质(10μmhis-gfp(seqidno：14)；10μmhis-蛋白a(abcam；ab52953)；10μmhis-分选酶a(seqidno：16)；1μmhis-人血清白蛋白(antikoerperonline；abin2181228)；0.2μm抗gfp小鼠igg1(biolegend；902605))在蛋白质结合缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)中的溶液混合，并在25℃下以1400rpm在恒温振荡器上振荡温育48小时或30分钟(对于ida样品)。在官能化珠与蛋白质温育后，保存蛋白质上清液样品用于之后通过sds-page分析，珠子用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次，最后重悬在160个珠体积的分析缓冲液中，或者对于抗体样品，继续进行gfp温育，如单独部分所述。[0467][co(iii)(nta/ida)(蛋白)]配合物的化学稳定性[0468]在实施了所述的[co(iii)(nta/ida)(蛋白)]配合物形成过程后，分析化学胁迫后与珠子结合的蛋白量。为此，将珠子用178个珠体积的在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。用178个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重悬于178个珠体积的蛋白质缓冲液中。根据制造商的指南，在微孔板上通过bca测定法(thermo，23227)确定25μl珠浆上的蛋白量。[0469]确定固定在珠子上的分选酶a的功能性[0470]按照制造商的说明，使用来自anaspec的520分选酶a活性测定试剂盒(#72228)，测定在20μl珠浆上固定的分选酶a的活性。[0471]gfp结合固定的α-gfp抗体[0472]为了评估固定的抗体的功能，用[co(iii)(nta/ida)(igg1)]官能化的珠子在25℃与120个珠体积的在蛋白质结合缓冲液中的0.54μmgfp(无his标签)(abcam；ab84191)一起温育1小时。温育后，珠子用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次，最后重新悬浮在160个珠体积的分析缓冲液中，并且对于具有ida的样品，进行如上所述的化学稳定性测定。最后，使用读板器(tecan，spark)基于10μl珠浆的gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，确定与固定的抗体结合的gfp。[0473]蛋白质上清液的sds-page[0474]除了使用12％(w/v)丙烯酰胺-双丙烯酰胺(37.5:1)凝胶并且每孔加载6μl蛋白质上清液之外，如实施例3中所述进行蛋白质温育后蛋白质上清液的sds-page。使用instantbluecoomassie染色剂(expedion；isb1l)进行条带可视化。[0475]his-分选酶的纯化[0476]使用质粒pet29_esrta(addgene#75144)(chen,dorretal.2011)在大肠杆菌bl21(de3)中表达酶分选酶a(seqidno:16)，并如(chen,dorretal.2011)所述，通过ni2 -nta柱纯化。[0477]图16中显示的结果清楚地表明，除了his6-gfp之外，其他带有his标签的蛋白质或甚至抗体通过其富含组氨酸的区域也可以在蛋白质结合期间从上清液中清除(图16a)，并最终稳定地固定在[co(iii)(nta)(co)3]2-或[co(iii)(ida)(co)3]-官能化的珠子上(图16b)。此外，可以证明，固定的蛋白仍然具有功能，例如酶分选酶a仍然有活性(图16c)或固定在nta或ida珠上的抗gfp抗体仍然可以结合其抗原gfp。[0478]实施例15：使用非nta的其他金属结合域的配合物形成和稳定性[0479]实施例4证明，可以形成[co(iii)(nta)co3]2-配合物。此外，实施例5表明，可以合成通过nta连接到珠子上的[co(iii)(nta)co3]2-配合物，并令人惊讶地用于在珠子上形成[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物。我们推测，除nta之外的其他金属结合结构域也可用于形成[co(iii)(金属结合域)(his-蛋白)]配合物。为了测试方法的通用性，检查了使用亚氨基二乙酸(ida)(一种三齿金属结合域)和talon(一种商业四齿金属结合域)的配合物形成。[0480]ida/talon磁珠的官能化[0481]ida官能化的磁珠(cubebiotech；30805)或talon官能化的磁性琼脂糖树脂(takara,635636)，1)用20个珠体积的ddh2o洗涤,2)用20个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤,3)用20个珠体积的ddh2o洗涤两次并用20个珠体积的1mnahco3洗涤一次。随后加入160个珠体积的在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o或仅1mnahco3(对于不含金属的样品)。在25℃和1400rpm下将样品按所示在恒温振荡器中温育10分钟或48小时后，用160个珠体积的1mnahco3将珠子洗涤三次。[0482]his6-gfp固定在官能化的ida/talon磁珠上[0483]将产生的珠子与160个珠体积的在蛋白质缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并在25℃在恒定振荡器上以1400rpm振荡温育所示的30分钟、1小时或48小时。在官能化珠与his6-gfp(seqidno：14)温育后，珠子用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次，并重悬于160个珠体积的蛋白质缓冲液中。[0484][co(iii)(ida/talon)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0485]在实施了所述的[co(iii)(ida)(his-gfp)]或[co(ii)(talon)(his-gfp)]配合物形成过程后，在有和没有化学胁迫的情况下分析结合到珠子上的蛋白质的量。为此，将珠子分成两部分(每份72个珠体积)，并分别用178个珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。用178个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重新悬浮在178个珠体积的蛋白质缓冲液中，并使用读板器(tecan、spark)通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)分析了10μl珠浆的固定蛋白量。两个实验均一式三份进行。[0486]实验清楚地证明了，用ida(图17a)和talon(图17b)作为金属结合域的蛋白质固定化。因此，通过钴(iii)碳酸根配合物进行的钴(iii)介导的蛋白质固定，不限于使用nta作为金属结合域。此外，三齿金属结合结构域ida显示出甚至改进的特性，例如与(参见图20b)相比，短温育时间的改进稳定性。四齿金属结合域talon也展示出了蛋白质的固定化。[0487]实施例16：研究[co(iii)(ida)(his-gfp)]配合物的化学稳定性[0488]实施例1证明[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的化学稳定性。在实施例15中，证明了[co(iii)(ida)(his-gfp)]的形成及其对咪唑的稳定性。在以下实施例中，将[co(iii)(ida)(his-gfp)]官能化珠，与强螯合剂或与广泛使用的还原剂和250mm咪唑的组合一起温育，以证明ida与co3 金属中心的配合可以形成化学稳定的配合物，就如(实施例1中所证明的)由nta和co3 组成的配合物。[0489]ida磁珠的官能化[0490]ida官能化的磁珠(cubebiotech；30805)，1)用20个珠体积的ddh2o洗涤，2)用20个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用20个珠体积的ddh2o洗涤两次并用20个珠体积的1mnahco3洗涤一次。随后，加入160个珠体积的在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o或1mnahco3(对于不含金属的样品)，珠子在恒温振荡器中1400rpm于25℃温育10分钟。温育后，珠子用20个珠体积的1mnahco3洗涤三次。将产生的珠子与160个珠体积的在50mmhepesph7.2、150mmnacl中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并在25℃在恒温振荡器上以1400rpm振荡温育30分钟。在与his6-gfp(seqidno:14)温育后，用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤珠子三次。[0491][co(iii)(ida)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0492]随后，160个珠体积的每种测试试剂(最终浓度：250mm咪唑、25mmnta或25mmedta在蛋白质缓冲液中，或补充有250mm咪唑的1mmdtt、tcep或抗坏血酸在蛋白质缓冲液中，或50mm甘氨酸ph10.0)如所示添加到相应的样品中。在25℃和1400rpm振荡温育1小时后，去除上清液，用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤珠子三次，并溶解在160个珠体积的蛋白质缓冲液中。最后，使用读板器(tecan，spark)通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)，分析了10μl珠浆的剩余固定蛋白量。实验一式三份。[0493]实验清楚地证明了，[co(iii)(ida)(his6-gfp)]配合物对不同化学物质(包括螯合剂和还原剂)的高化学稳定性。如图18所示，当his6-gfp与[co(iii)(ida)(co3)]配合物结合时，与用缓冲液处理的珠子相比，在与测试的螯合剂或还原剂温育后，仅观察到非常小的固定化减少。因此，[co(iii)(ida)(his6-gfp)]配合物对强螯合剂的破坏以及还原为co2 都是惰性的。[0494]实施例17：比较通过[co(iii)(ida)(co3)]-与通过[co(iii)(ida)(h2o)2] 的[co(iii)(ida)(his-gfp)]配合物形成[0495]实施例4证明，可以形成[co(iii)(nta)co3]2-配合物。此外，实施例5表明，可以合成通过nta连接到珠子上的[co(iii)(nta)co3]2-配合物，并令人惊讶地用于在珠子上形成[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物。在实施例6中表明，与使用[co(iii)(nta)(h2o)2]的配合物形成动力学相比，his-gfp与[co(iii)(nta)(co3)]2-的结合动力学得到改善。在实施例15中证明，ida可以作为金属结合域通过[co(iii)(ida)co3]-用于形成[co(iii)(ida)(his-gfp)]配合物。我们推测，碳酸根作为钴(iii)中心的配体也可能促进[co(iii)(ida)(his-蛋白)]配合物的形成。为了证实这一发现，直接比较了his6-gfp与[co(iii)(ida)(h2o)2]以及与[co(iii)(ida)(co3)]-的配合物形成效率以及最终的[co(iii)(ida)(his-gfp)]配合物的化学稳定性。[0496]ida磁珠的官能化[0497]ida官能化的磁珠(cubebiotech；30805)，1)用80个珠体积的ddh2o洗涤，2)用80个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用80个珠体积的ddh2o洗涤两次并用80个珠体积的1mnahco3(对于[co(iii)(ida)(co3)]2-配合物)或ddh2o(对于[co(ii)(ida)(h2o)2]-配合物或无金属样品)洗涤一次。[0498]随后加入160个珠体积的在脱气的ddh2o中的1mmco(ii)cl2*6h2o(对于[co(ii)(ida)(h2o)2]和[co(iii)(ida)(h2o)2] 样品)或在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o(对于[co(iii)(ida)(co3)]-配合物)。向不含金属的样品中加入160个珠体积的ddh2o。在25℃以1400rpm在恒温振荡器中温育10分钟(或对于具有[co(iii)(ida)(co3)]-配合物的指定样品，温育48小时)后，将珠子用160个珠体积的1mnahco3(对于具有[co(iii)(ida)(co3)]2-配合物的样品)或ddh2o(对于[co(ii)(ida)(h2o)2]样品或无金属样品)洗涤三次。[co(iii)(ida)(h2o)2] 用160个珠体积洗涤一次，在160个珠体积的20mmh2o2中在恒温振荡器上1400rpm于25℃温育1小时，最后用160个珠体积的ddh2o洗涤一次。[0499]his6-gfp固定到官能化的ida磁珠上[0500]将产生的珠子与160个珠体积的在蛋白质缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)或pbs中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，如所示在25℃以1400rpm在恒温振荡器上振荡温育3小时或24小时。在官能化珠与his6-gfp(seqidno：14)温育后，珠子用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次并重悬于160个珠体积的蛋白质缓冲液中。[0501][co(iii)(ida)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0502]在实施了所述的co(iii)(ida)(his-gfp)]配合物形成过程后，分析了在有和没有化学胁迫的情况下与珠子结合的蛋白质的量。为此，将珠子分成两部分(每份72个珠体积)并分别用178个珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。用178个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重新悬浮在178个珠体积的蛋白质缓冲液中，并使用读板器(tecan、spark)通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)分析了10μl珠浆的固定蛋白量。实验一式三份进行。[0503]这些实验的结果清楚地表明，通过将nta和na3[co(iii)(co3)3]*3h2o温育10分钟获得的[co(iii)(ida)(co3)]-配合物官能化的珠子，比预装[co(iii)(ida)(h2o)2] 的珠子结合显著更多的蛋白质(图19)。对于用48小时na3[co(iii)(co3)3]*3h2o温育获得的[co(iii)(ida)(co3)]-配合物官能化的珠子，仅在24小时蛋白质温育后可见超过co(iii)(ida)(h2o)2] 配合物的显著优势。需要强调的是，对于ida，优选温育时间为10分钟的na3[co(iii)(co3)3]*3h2o/nta温育以及30分钟至3小时的随后蛋白质温育。通过这些温育时间组合，与[co(iii)(ida)(h2o)2] 相比，[co(iii)(ida)(co3)]-配合物可以实现显著改善的固定效率。此外，图19再次证实[co(iii)(ida)(his6-gfp)]配合物对螯合剂(此处为咪唑)的强稳定性。[0504]实施例18：比较通过[co(iii)(金属结合域)(co3)]2-与通过氧气处理[co(ii)(金属结合域)(his-gfp)]的[co(iii)(金属结合域)(his-gfp)]化学稳定配合物的形成[0505]实施例5证明，通过[co(iii)(nta)(co3)]2-形成的[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物的高百分比是化学稳定的。我们推测，与用氧气处理[co(ii)(金属结合域)(his-蛋白)]相比，始于[co(iii)(金属结合域)co3]2-的[co(iii)(金属结合域)(his-蛋白)]配合物形成，可以导致增加量的化学稳定的[co(iii)(金属结域)(his-蛋白)]配合物。为了证实这一发现，分别使用nta或ida作为金属结合域，直接比较了通过[co(iii)(金属结合域)(co3)]或通过8小时氧气处理[co(ii)(金属结合域)(his-蛋白)]所形成的化学稳定[co(iii)(金属结合域)(his-蛋白)]配合物的量。[0506]ida/nta琼脂糖磁珠的官能化[0507]ida官能化磁珠(cubebiotech；30805)或nta官能化磁性琼脂糖树脂(thermo，78605)，1)用80个珠体积的ddh2o洗涤，2)用80个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用80个珠体积的ddh2o洗涤两次并用160个珠体积的ddh2o(对于[co(ii)(ida/nta)(h2o)2]配合物)或1mnahco3(对于[co(iii)(ida/nta)(co3)]配合物或无金属样品)洗涤一次。对于具有[co(ii)(ida/nta)(h2o)2]配合物的样品，所有洗涤均使用脱气的20分钟氮气充气的溶液以及在覆盖有氮气的管子中进行。[0508]随后加入160个珠体积的在脱气、20分钟氮气充气的ddh2o中的1mmco(ii)cl2*6h2o(对于[co(ii)(ida/nta)(h2o)2])或在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o(对于[co(iii)(ida/nta)(co3)]配合物)。向不含金属的样品中加入1mnahco3。在25℃以1400rpm在恒定振荡器中温育10分钟(或对于具有[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物的指定样品，温育48小时)后，珠子用160个珠体积的ddh2o(对于[co(ii)(ida/nta)(h2o)2]样品)或1mnahco3(对于具有[co(iii)(ida/nta)(co3)]配合物的样品或无金属样品)洗涤三次。[0509]his6-gfp固定到官能化的ida/nta磁珠上[0510]将产生的珠子与120个珠体积的在蛋白质缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并在25℃下在恒温振荡器上以1400rpm振荡温育30分钟或48小时(对于无金属样品)或如图9所示。在官能化珠与his6-gfp(seqidno:14)温育后，将珠子用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤两次(样品“[co(iii)(ida/nta)(his-gfp)]通过h2o2”仅一次)，最后加入160个珠体积的蛋白质缓冲液。[co(ii)(ida/nta)(his-gfp)]的一个样品(在图20中称为“[co(iii)(ida/nta)(his-gfp)]通过o2”)用o2通气8小时，而在另一个[co(ii)(ida/nta)(his-gfp)]样品(在图9中称为“[co(iii)(ida/nta)(his-gfp)]通过h2o2”)中加入6,4个珠体积的500mmh2o2(最终20mm)，并在25℃以1400rpm在恒温振荡器上温育1小时，然后用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤。[0511][co(iii)(ida/nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0512]在实施了所述的co(iii)(ida)(his-gfp)]或co(ii)(nta)(his-gfp)]配合物形成过程后，在有和没有化学胁迫的情况下，分析了结合到珠子上的蛋白质的量。为此，珠子用160个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次，重新悬浮在160个珠体积的蛋白质缓冲液中，分成两部分(每份72个珠体积)，并用178个珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。用178个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重新悬浮在178个珠体积的蛋白质缓冲液中，并使用读板器(tecan、spark)通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)分析了10μl珠浆的固定蛋白量。ida实验一式三份进行；nta实验单个地在三个独立实验中进行。[0513]图20中记录的这些实验的结果清楚地表明，使用[co(iii)(ida)(co3)]2-配合物(图20a)和[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物(图20b)，与用氧气对[co(ii)(金属结合域)(his-蛋白)]]配合物官能化的珠子通气8小时相比，可以在珠子上化学稳定地固定显著更多的his6-gfp蛋白。除了更高百分比的稳定配合物外，使用[co(iii)(金属结合域)(co3)]2-也比氧化方法更快。[0514]实施例19：通过[co(iii)(hs-peg-nta)(co3)]2-配合物在表面固定蛋白质[0515]本发明的数个实施例证明了通过[co(iii)(nta)(co3)]2-形成[co(iii)(nta)(his-蛋白)]配合物。在本实施例中，在具有纳米结构金点的玻璃表面上测试了采用该原理的蛋白质固定。[0516]纳米结构玻璃表面的产生和钝化[0517]纳米结构表面，如前(spatz,etal.2000,roman,martinetal.2003,lohmuller,aydinetal.2011)所述，通过二嵌段共聚物胶束纳米光刻法生产，通过扫描电子显微镜测定，具有平均颗粒间距58nm。简而言之，分别将5mg/ml的聚苯乙烯(501)-b-聚-2-乙烯基吡啶(323)(polymersource,canada)溶解在邻二甲苯中。随后，将0.5比例的四氯金酸与乙烯基吡啶单体加入到溶液中并搅拌24小时。将溶液旋涂在20x20mmn°1玻璃盖玻片(carlroth，德国)上。之后，对基板进行等离子体处理(10％h2/90％ar，350w，0.4mbar，45分钟)。[0518]为了防止任何蛋白质非特异性粘附到金纳米结构之间的玻璃基板上，根据之前描述的程序(blummel，perschmann等人，2007)钝化玻璃表面。因此，在氧等离子体中激活纳米图案表面(150w，0.4mbar，10分钟)，并在80℃在含有0.25mmα-甲氧基-ω-三甲氧基甲硅烷基聚(乙二醇)(分子量2000g/mol)(irisbiotech，德国)、5.5μm水和20mm无水三甲胺(acrosorganics，美国)的无水甲苯p.a.(acrosorganics，美国)中在氮气气氛下温育过夜。最后，将基板用乙酸乙酯(acrosorganics，美国)洗涤三次，用甲醇(vwr化学品，美国)洗涤一次，并在n2流下干燥。[0519]用巯基-peg-nta对表面进行官能化[0520]钝化后，将100μl具有0,5mmhs-(ch2)11-eg3-nta(prochimia；th007)的99,8％乙醇或乙醇(仅用于“仅peg”和“peg/gfp”样品)移液到每个表面。在室温下温育1小时后，将表面在ddh2o浴中或(对于样品“[co(iii)(nta)(his-gfp)]”)在1mnahco3中洗涤三次。[0521][co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物的形成[0522]官能化后，表面覆盖400μl在1mnahco3中的1mmna3[co(iii)(co3)3]*3h2o(对于样品“[co(iii)(nta)(his-gfp)]”)或ddh2o(对于其他样品)，并在室温下温育10分钟。随后，对于样品“[co(iii)(nta)(his-gfp)]”在1mnahco3浴中，或对于其他样品在ddh2o浴中，将表面清洗三次。最后，将300μl在蛋白质结合缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)中的10μmhis6-gfp，加到表面上，并在室温下温育30分钟。在蛋白结合缓冲液浴中洗涤3次后，将表面置于透明的6孔板中，覆盖上蛋白结合缓冲液，使用读板器(tecan，spark)分析gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)作为表面上固定蛋白的量度。[0523]实验结果如图21所示。与其他对照样品相比，在使用硫醇-peg-nta、na3[co(iii)(co3)3]*3h2o和his-gfp处理的表面上可以测量到高得多的荧光信号，表明在该表面上成功地形成[co(iii)(nta)(his-gfp)]配合物。[0524]实施例20：用[co(iii)(生物素-x-nta)(co3)]配合物对his-gfp进行位点特异性的生物素化[0525]在几个实施例中，证明了带his标签的蛋白质通过[co(iii)(nta)(co3)]2-配合物固定到珠子上和在实施例19中固定到用nta官能化的表面上。在以下实施例中，测试了通过[co(iii)(生物素-x-nta)(co3)]配合物在溶液中对his-gfp在其his标签处的生物素化。[0526]his-gfp的生物素化[0527]60μm生物素-x-nta(sigma-aldrich；51410)与在1mnahco3中的30μm(样品1:2)、60μm(样品1:1)或600μm(样品10:1)na3[co(iii)(co3)3]*3h2o或仅1mnahco3(对于具有金属的样品)混合，并在室温下在旋转轮上温育10分钟。所得[co(iii)(生物素-x-nta)(co3)]配合物随后在室温下与6μmhis6-gfp(seqidno:14)在蛋白质结合缓冲液(50mmhepesph7.2,150mmnacl)中的溶液在旋转轮上温育30分钟或48小时。[0528][co(iii)(生物素-x-nta)(his-gfp)]固定到链霉亲和素官能化的琼脂糖上[0529]温育后，使所得的[co(iii)(生物素-x-nta)(his-gfp)]配合物，在所示的30分钟或48小时温育步骤中在室温和转动下，结合到链霉亲和素官能化的琼脂糖凝胶(gehealthcare，17-5113-01)上(所述琼脂糖凝胶通过用166个珠体积的蛋白质结合缓冲液洗涤3次制备)。温育后，珠子用16个珠体积的蛋白质结合缓冲液洗涤三次，并重新悬浮在16个珠体积的蛋白质缓冲液中。[0530][co(iii)(生物素-x-nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性[0531]在将[co(iii)(生物素-x-nta)(his-gfp)]配合物与珠子固定的程序后，分析了在有或没有化学胁迫的情况下与珠子结合的蛋白质量。为此，将珠子分成两部分，并分别用17个珠体积的蛋白质缓冲液或在蛋白质结合缓冲液中的250mm咪唑洗涤一次。在用17个珠体积的蛋白质缓冲液进行最后洗涤后，将珠子重新悬浮在17个珠体积的蛋白质缓冲液中。最后，使用读板器(tecan，spark)通过gfp荧光(λex＝490nm,λem＝535nm)分析10μl珠浆的固定蛋白量。实验一式三份进行。[0532]如图22a所示，在所有co/nta比率下，均证实了带his标签的gfp在溶液中的生物素化。然而，使用生物素-x-nta与na3[co(iii)(co3)3]*3h2o的较高比例，可以实现更好的标记效率，如基于固定在链霉亲和素珠上的生物素化蛋白质的荧光而量度的。在图22b中证明，与10分钟蛋白质温育的样品相比，48小时蛋白质温育后有更多配合物可以在严格咪唑洗涤后固定在链霉亲和素珠上，因此，更长时间的蛋白质温育将产生更多量的稳定形成的配合物。[0533]实施例21：使用硝酸铂(iv)形成[pt(iv)(nta)(his6-gfp)]配合物及其化学稳定性[0534]我们推测，不仅碳酸根作为配体，而且硝酸根在金属中心也可促进[(金属)(nta)(his-蛋白)]配合物的形成。此外，我们推测，除了co3 之外，其他具有低配体交换速率的过渡金属也可形成化学稳定的[(金属)(nta)(his-蛋白)]配合物。为了证实这一发现，检查了his6-gfp与[pt(iv)(nta)(no3)]的结合效率。[0535]nta琼脂糖珠的官能化[0536]nta官能化的琼脂糖珠(qiagen；1022963)，1)用10个珠体积的ddh2o洗涤，2)用10个珠体积的100mmedtaph8.0洗涤，3)用10个珠体积的ddh2o洗涤两次并用10个珠体积的1m硝酸洗涤一次。随后加入16个珠体积的硝酸铂(iv)(44mg/lpt(iv))(fisherscientific；15407817)在1m硝酸中的溶液或仅1m硝酸(对于不含金属的样品)。在25℃下以1400rpm将样品在恒温振荡器中温育10分钟后，用16个珠体积的1m硝酸将珠子洗涤三次。[0537]his6-gfp固定到[pt(iv)(nta)(no3)]琼脂糖珠上[0538]将产生的珠子与16个珠体积的在蛋白质缓冲液(50mmhepesph7.2，150mmnacl)中的10μmhis6-gfp(seqidno:14)一起温育，并在25℃下以1400rpm在恒温振荡器上振荡温育30分钟。在官能化珠与his6-gfp(seqidno：14)温育后，珠子用16个珠体积的蛋白质缓冲液洗涤一次，并重悬于16个珠体积的蛋白质缓冲液中。[0539][pt(iv)(nta)(his6-gfp)]配合物的化学稳定性covalentlyattachedpegcoatingsonnanostructuredsio(2)-basedinterfaces."biomaterials28(32):4739-4747.[0554]border,w.a.,c.b.wilsonando.gotze(1976)."nephriticfactor:descriptionofanewquantitativeassayandfindingsinglomerulonephritis."kidneyint10(4):311-318.[0555]cal,p.m.,g.j.bernardesandp.m.gois(2014)."cysteine-selectivereactionsforantibodyconjugation."angewchemintedengl53(40):10585-10587.[0556]caravan,p.,c.comuzzi,w.crooks,t.j.mcmurry,g.r.choppinands.r.woulfe(2001)."thermodynamicstabilityandkineticinertnessofms-325,anewbloodpoolagentformagneticresonanceimaging."inorganicchemistry40(9):2170-2176.[0557]castillo,a.m.,l.patinyandj.wist(2011)."fastandaccuratealgorithmforthesimulationofnmrspectraoflargespinsystems."jmagnreson209(2):123-130.[0558]chappell,l.l.,d.ma,d.e.milenic,k.garmestani,v.venditto,m.p.beitzelandm.w.brechbiel(2003)."synthesisandevaluationofnovelbifunctionalchelatingagentsbasedon1,4,7,10-tetraazacyclododecane-n,n',n",n"'-tetraaceticacidforradiolabelingproteins."nuclmedbiol30(6):581-595.[0559]chen,x.andy.w.wu(2016)."selectivechemicallabelingofproteins."orgbiomolchem14(24):5417-5439.[0560]chen,i.,b.m.dorrandd.r.liu(2011)."ageneralstrategyfortheevolutionofbond-formingenzymesusingyeastdisplay."procnatlacadsciusa108(28):11399-11404.[0561]chin,j.,s.s.lee,k.j.lee,s.parkandd.h.kim(1999)."ametalcomplexthatbindsalpha-aminoacidswithhighandpredictablestereospecificity."nature401(6750):254-257.[0562]cini,r.andg.giogi(1987)."purinenucleotide-metalcomplexes."inorganicachimicaacta137(1-2):87-90.[0563]clerac,r.,f.a.cotton,k.r.dunbar,t.lu,c.a.murilloandx.wang(2000)."newlineartricobaltcomplexofdi(2-pyridyl)amide(dpa),[co3(dpa)4(ch3cn)2][pf6]2."inorgchem39(14):3065-3070.[0564]cusanelli,a.,u.frey,d.t.richensanda.e.merbach(1996)."theslowestwaterexchangeatahomolepticmononuclearmetalcenter:variable-temperatureandvariable-pressure17onmrstudyon[ir(h2o)6]3 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