包含FFAR4激动剂和α-7NACHR激动剂或正调节剂的联合疗法的制作方法

包含ffar4激动剂和
α-7 nachr激动剂或正调节剂的联合疗法
技术领域
1.本发明涉及包含ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂的组合制剂或组合物。本发明还涉及ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂联合用于治疗神经变性疾病的用途。


背景技术：

2.已知阿尔茨海默病(ad)与淀粉样蛋白β(aβ)相关，aβ是一种38-43个氨基酸(aa)的肽(来自38-43个氨基酸的同种型)，源自淀粉样前体蛋白并沉积在淀粉样斑块中。特别是，42和43个氨基酸形式聚合成低聚物和原纤维，它们具有神经毒性，尽管聚合和毒性即使在部分分解代谢的较短形式中也保留了下来。之前已经证明了由内质网衍生酶引起的aβ分解代谢模式(rogeberg等人，2014)。突触丧失是阿尔茨海默病的早期特征，目前被认为与aβ代谢障碍有关。胆碱能功能降低也是阿尔茨海默病的早期特征，症状性胆碱能治疗(例如多奈哌齐、加兰他敏、爱斯能(exelon)) 不能充分缓解这一症状。ad进展也以小胶质细胞激活和炎症增加为特征 (nordengen等人，2019)。
3.在体内，中枢神经系统(cns)先天免疫细胞，包括小胶质细胞(骨髓干细胞衍生细胞，在妊娠期间接种到cns并通过局部增殖维持为细胞群)，维持突触稳态。这包括在具有突触前和突触后细胞/隔室以及星形胶质细胞的复杂网络中的吞噬作用和活性诱导的aβ产生的降解。尽管目前认为小胶质细胞的特性在ad初期会发生变化，并随着患者发展为ad诱导的痴呆症而获得炎症表型，但事件的初始顺序尚未完全了解。小胶质细胞是髓脑细胞驻留的先天免疫细胞，是cns免疫防御的主要和早期反应者。它们还被认为在维持突触稳态方面发挥作用。
4.在衰老过程中，aβ半衰期增加，这被认为是导致ad发病率与年龄相关的增加的原因。在病理情况下，外周免疫系统和小胶质细胞之间的交流导致外周血先天免疫细胞(单核细胞)向中枢神经系统的循环增加。外周髓细胞，如单核细胞和巨噬细胞，在许多方面与小胶质细胞组织细胞平行调节，并共享吞噬特性。此外，这些细胞可能会循环并浸润cns，并被认为可能在诸如脑淀粉样变性的ad发病机制中发挥作用。外围aβ隔室 (cns外部的隔室)用作cns的aβ汇点(sink)。一般来说，50％的aβ分解代谢在cns之外。在已建立的ad中已经描述了跨单核细胞谱系(小胶质细胞、单核细胞和巨噬细胞)的先天免疫细胞类型的基因表达谱的共调节。小鼠研究表明，骨髓来源的巨噬细胞内的纤维状aβ具有吞噬作用；外周单核细胞衍生的巨噬细胞对脑aβ的清除(koronyo等人，2015)；并且已经表明小胶质细胞吞噬功能受损与aβ斑块沉积同时发生(koronyo 等人，2015；zuroff等人，2017；krabbe等人，2013)。
5.多不饱和脂肪酸(pufa)，包括ω-3脂肪酸，是所有细胞膜磷脂的重要成分。已经使用二十二碳六烯酸(dha；iupac名称 (4z,7z,10z,13z,16z,19z)-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸))-丰富的补充剂改变先天免疫活性，并且这种类型的干预已被证明可以改善ad相关的pbmc(外周血单核细胞)和小胶质细胞特征，并与认知改善相关(wang 等人，2015；antonietta等人，2012)。王等人证明aβ-40是aβ的一种常见形式，减少外周血单核细胞
(pbmc)产生的特化促消解介质(spm)，而 spm在炎症消退中起关键作用。王等人进一步证明，用富含dha的油治疗ad患者防止pbmc产生spm的减少，这与认知的改善有关。antonietta 等人证明dha在体外以剂量依赖性方式抑制lps诱导的小胶质细胞产生的促炎细胞因子(如tnf-α、il-6和il-1β)和一氧化氮。外周血单核细胞(pbm)也是骨髓干细胞衍生的，但在血液中的半衰期较短(1-7天)，并不断从骨髓中补充。
6.其他研究还表明，ω-3脂肪酸(如dha)对脂肪细胞和巨噬细胞具有保护、抗炎作用(alvarez-curto等人，2016；im 2015)。ω-3脂肪酸，例如dha，激活ffar4受体，从而抑制炎症刺激物(像lps)的作用并下调nf-kb系统(alvarez-curto等人，2016)，这导致炎症反应的调节和减轻。
7.wo2011/006144公开了使用dha治疗和预防神经紊乱的方法。
8.dha穿过bbb(血脑屏障)，由此产生的脑脊液(csf)浓度与csf总 tau水平降低有关，表明它们减少神经变性、改善aβ诱导的神经元损伤并增加小胶质细胞aβ吞噬作用(antonietta等人2012；freund等人2014；tan等人2016)。
9.在另一个领域，wo2018/150276公开了可替宁和磷虾油用于治疗慢性压力和抑郁，特别是ptsd的用途。
10.如上所述，胆碱能治疗仅不充分地减轻与阿尔茨海默病相关的认知症状，并且尚未证明可以减轻疾病进展。因此，需要改进神经变性疾病如阿尔茨海默病的治疗。
11.在不同的技术领域，lappe等人报道了染料木黄酮、多不饱和脂肪酸和维生素d3和k1对绝经后妇女骨矿物质密度的影响。


技术实现要素：

12.本发明的出现是因为现在令人惊讶地表明，先天免疫模型系统中细胞的dha处理增加了aβ吞噬作用以及降解。结果(在下面的实施例中示出)表明aβ吞噬作用和降解的增加可能部分由内质网(er)相关酶的活性增加介导(1)，这与dha对er应激的积极影响一致(2)。现在了解到，dha 对aβ吞噬作用和降解的影响是通过ffar4受体介导的，而增加的aβ吞噬作用是由质膜上chrna7表达增加所介导的(3)。
13.在阿尔茨海默病中观察到的小胶质细胞活化和炎症增加将伴随着 nf-kb活性的增加，和膜上chrna7表达的减少和不足以及胆碱能反应性的降低。
14.神经炎症部分通过神经免疫轴进行调节，其中刺激先天免疫细胞上的α7-烟碱样受体(α7烟碱乙酰胆碱受体；α7 nachr)是一个重要组成部分 (4)(5)。先天免疫α7-胆碱能激活改善了炎症激活。chrna7是经典的α7 nachr受体的基因，尤其在神经元和先天免疫细胞上表达。
15.chrfam7a是部分复制自chrna7的、附近独特的人类基因。已知 chrfam7a转录或表达会阻碍chrna7表达或α7 nachr功能，最有可能促进cns炎症激活并推定阻碍突触烟碱传递(6-8)。α7 nachr是一种五聚体，具有主要的同聚形式(chrna7)，但可以是假异聚体，因为来自chrfam7a的α7单体可能散布在其他同聚五聚体中。chrfam7a基因以可变数量的拷贝存在，含有与多种神经精神疾病相关的大量多态性，并可能降低α7 nachr的表达和功能(9-10)。
16.α7烟碱系统的治疗调节和激活用于治疗例如阿尔茨海默病、精神分裂症、帕金森
病，但对所有疾病而言都寻求进一步的治疗效果(9)。cns炎症也伴随并可能导致疾病进展或治疗抵抗，但不是当前治疗方案的一部分 (11-13)。
17.还提出胆碱能不足可能会自我强化，因为缺乏α7烟碱刺激将导致更强的炎症激活，甚至进一步降低chrna7表达(king等人，2017)。此外，已经发现aβ原纤维与α7 nachr结合并随后被吞噬，因此缺乏质膜α7烟碱受体也会减少纤维状aβ吞噬作用和纤维状aβ-α7介导的抗炎信号传导 (rothbard等人，2018)。
18.本发明基于ffar4激动剂，例如ω-3脂肪酸(例如，dha)，组成性地减轻nf-kb激活、炎症激活的理解。假设、测试并证实这也增加了 chrna7表达(图4)，使生理和药理学胆碱能刺激发挥作用，从而阻止 ad进展。特别是，ffar4激活抑制了nf-kb，导致chrna7表达增加，以及炎症反应减少。chrna7表达的增加会导致aβ吞噬作用增加。
19.然而，aβ的细胞内积累有助于ad发病机制，并且在没有相关降解增加的情况下，不能预期增加的aβ吞噬作用会改善ad。本发明基于以下认识，即ffar4和α7烟碱刺激可以预期协同作用，通过增加生理反应途径的功能来增加aβ吞噬作用和降解两者(图3)。
20.因此，在第一方面，本发明提供包含ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂的组合制剂。
21.在第二方面，本发明提供包含ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂的组合物。
22.便利地，α7 nachr激动剂或正调节剂是正变构调节剂。
23.优选地，正变构调节剂是加兰他敏(galantamine)、ns-1738、 pnu-120596或tqs，或其药学上可接受的盐。
24.或者，α7 nachr激动剂或调节剂是激动剂。
25.便利地，激动剂是pnu-282987、sen12333、tc5619 s24795或a-582941，或其药学上可接受的盐。
26.优选地，α7 nachr激动剂或正调节剂是i型pam，更优选地选自由染料木黄酮(genistein)、ns-1738、avl-3288和加兰他敏组成的组。
27.或者，α7 nachr激动剂或正调节剂是ii型pam，优选选自由 pnu-120596和pam-2组成的组。
28.优选地，组合制剂或组合物包含多于一种α7 nachr正调节剂。
29.有利地，多于一种α7 nachr正调节剂包含加兰他敏、ns-1738、 pnu-120596和tqs。
30.便利地，ffar4激动剂是pufa、化合物a、ncg21、gw9508或 tug-891，或其药学上可接受的盐。
31.有利地，pufa是长链pufa(c18至22)。
32.优选地，pufa是ω-3脂肪酸。
33.更优选地，pufa是dha。
34.有利地，组合制剂或组合物包含dha、加兰他敏、ns-1738、 pnu-120596和tqs。
35.便利地，组合制剂或组合物是药物组合物并且包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
36.在本发明的第三方面，提供了包含ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂的组合制剂或组合物用于治疗神经变性疾病的方法，其中组合制剂与本发明的第一方面一致
以及组合物与本发明的第二方面一致。
37.在本发明的第四方面，提供了ffar4激动剂用于治疗神经变性疾病的方法中，其中该方法包括将ffar4激动剂与α7 nachr激动剂或正调节剂同时或顺序施用。
38.在本发明的第五方面，提供了α7 nachr激动剂正调节剂用于治疗神经变性疾病的方法中，其中该方法包括将α7 nachr激动剂或正调节剂与 ffar4激动剂同时或顺序施用。
39.便利地，ffar4激动剂是pufa、化合物a、ncg21、gw9508或 tug-891，或其药学上可接受的盐。
40.有利地，pufa是长链pufa(c18至22)。
41.优选地，pufa是ω-3脂肪酸。
42.更优选地，pufa是dha。
43.有利地，α7 nachr激动剂或正调节剂是正变构调节剂。
44.便利地，正变构调节剂包含加兰他敏、ns-1738、pnu-120596和tqs 中的至少一种，或其药学上可接受的盐。
45.优选地，正变构调节剂包括加兰他敏、ns-1738、pnu-120596和tqs。
46.有利地，α7 nachr激动剂或正调节剂是α7 nachr激动剂。
47.便利地，α7 nachr激动剂是pnu-282987、sen12333、tc5619、s24795 或a-582941，或其药学上可接受的盐。
48.优选地，ffar4激动剂是dha并且α7 nachr激动剂或正调节剂包含加兰他敏、ns-1738、pnu-120596和tqs。
49.有利地，神经变性疾病是阿尔茨海默病。
50.根据本发明的第六方面，提供试剂盒，其包含：包含ffar4激动剂的第一产品和包含α7 nachr激动剂或正调节剂的第二产品。
51.在第七方面，本发明提供治疗神经变性疾病的方法，包括向有需要的患者施用如本发明第一方面所述的组合制剂或如第二或第三方面所述的组合物；或如第四方面所述的ffar4激动剂和如以上第五方面所述的α7 nachr激动剂或正调节剂。
52.如本文所用，术语“ffar4”是指游离脂肪酸受体，其是
‘
视紫红质样’g 蛋白偶联受体(gpcr)家族的成员，并且被长链脂肪酸选择性激活。ffar4 以前被称为gpr120。其更多细节可以在free fatty acid receptors,springer, 2018,pp33-56中找到，该文献通过引用并入本文。
53.如本文所用，术语“α7 nachr”是指由五个相同的α7亚基制成的烟碱乙酰胆碱受体。
54.如本文所用，术语“激动剂”是指与受体结合并直接激活受体的物质。它包括完全激动剂和部分激动剂(即与完全激动剂相比仅具有部分功效的激动剂)。
55.如本文所用，术语“组合制剂”是指多组分的制剂。在一些实施方案中，多种组分在分子水平上彻底混合。在其他实施方案中，多组分以分开的体积保持在单个产品内。
56.如本文所用，术语“ω-3脂肪酸”是指特征在于存在距离末端甲基三个原子远的双键的n-3多不饱和脂肪酸。
57.如本文所用，术语“正调节剂”是指间接增加主要配体对靶蛋白的作用的物质。
58.如本文所用，术语“正变构调节剂”是指通过结合与正构结合位点不同的位点而间
接诱导激动剂对靶蛋白的作用增加但不直接激活该蛋白质的物质。
59.如本文所用，术语“其药学上可接受的盐”意指通过使游离形式的化合物与酸或碱反应形成的盐。药学上可接受的盐的实例包括氢卤酸盐，例如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐和氢碘酸盐；无机酸盐，例如盐酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐和磷酸盐；低级链烷磺酸盐，例如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐和乙磺酸盐；芳基磺酸盐，例如苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐；有机酸盐，例如乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐、草酸盐和马来酸盐；碱金属盐，例如钠盐、钾盐和锂盐；碱土金属盐，例如钙盐和镁盐；金属盐，例如铝盐和铁盐；无机盐，例如铵盐；胺盐，包括有机盐，例如叔辛胺盐、二苄胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、n-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、n,n
’‑
二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、n-苄基苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐和三(羟甲基)氨基甲烷盐；以及氨基酸盐，例如甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。
60.如本文所用，术语“药物组合物”意指适合于出于治疗目的而施用于预期的人或动物受试者的药物制剂。
61.如本文所用，术语“顺序施用”是指向患者施用两种产品，其中两种产品不同时施用。在一些实施方案中，顺序施用的每个实例意味着两种产品各自相隔小于5天、4天、3天、2天或1天施用。
62.本文使用的术语“治疗”是指任何部分或完全治疗，包括：抑制疾病或症状，即，阻止其发展；和缓解疾病或症状，即，使疾病或症状消退。
附图说明
63.图1示出了dha对thp-1细胞模型中aβ40降解的影响。每个降解的aβ肽都是两次切割的产物。x轴示出在哪个氨基酸之后发生切割，y 轴在每次检测到相应切割时计数。一组的肽列表是检测到的身份(identity) 的累计。对每个条件/样品组进行三个平行分析。dha：二十二碳六烯酸。
64.图2示出了来自离体单核细胞(黑色列)和thp-1细胞(灰色列)中的aβ的切割模式。每个aβ肽都是两次切割的产物。x轴示出在哪个氨基酸之后发生切割，y轴在每次检测到相应切割时计数。一组的肽列表是检测到的身份的累计。“来自供体的单核细胞(n＝12)”是指来自健康供体和患有阿尔茨海默病的供体的单核细胞；
65.图3示出了aβ40的单核细胞处理的比较。对检测到的aβ衍生肽的所有切割位点进行评估，对它们的每个肽键进行计数并总计七个实验(n＝7 dha刺激 7个对照)。x轴注释肽键数，以及y轴注释每个肽键断裂的次数。
66.图4示出了在添加aβ42肽、aβ42肽与dha组合以及单独的dha 的tpa分化的thp-1细胞(对照)中和在tpa分化的thp-1细胞中 chrna7单核细胞表达。y轴示出56kda条带信号强度，用chrna7特异性抗体(目录号21379-1-ap，proteintech)染色，而x轴示出不同的实验条件。dha：二十二碳六烯酸，aβ42肽：含有42个氨基酸的常规淀粉样β肽。tpa：佛波酯12-o-十四烷酰基佛波酯-13-乙酸酯。
67.图5示出了在添加了aβ肽、aβ肽与dha组合以及单独的dha的分化thp-1细胞中chrna7和chrfam7a的单核细胞表达(蛋白质印迹)。dha：二十二碳六烯酸，aβ1-40肽：含有40
个氨基酸的常规淀粉样β肽。
68.图6示出了添加了aβ肽，aβ肽与dha组合以及单独的dha， chrna7和chrfam7a的单核细胞表达(定量pcr数据)。
69.图7示出了在不同刺激条件(1-9)下，在thp单核细胞培养物中， chrna7(“n”；浅灰)chrfam7a(“m”；黑色)及比值(“n/m”；深灰)的定量pcr测量，所有值都相对于tpa处理但未受刺激的条件(在 y轴上＝1)。dha：二十二碳六烯酸，gal：加兰他敏，pam1型，pnu： pnu-120596，pam2型。
70.详细说明
71.一般而言，本发明涉及用于治疗神经变性疾病的ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂的组合。ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂可以作为单独的组合物施用，或者它们可以在相同的组合物中。
72.ffar4激动剂
73.在一些实施方案中，ffar4激动剂是pufa(多不饱和脂肪酸)、化合物a、ncg21、gw9508和tug-891中的一种，或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，pufa是α-亚麻酸(ala)、二十碳五烯酸(epa) 或二十二碳六烯酸(dha)。优选地，pufa是ω-3脂肪酸，更优选地是dha。
74.在一些实施方案中，施用多于一种ffar4激动剂，选自一种或多种 pufa、gw9508和tug-891，或其药学上可接受的盐。一种或多种pufa 可以是ala、epa和dha中的一种或多种。例如，ffar4激动剂可以包含两种或更多种pufa，并且可以任选地进一步包含gw9508和tug-891 中的一种或两种，或其药学上可接受的盐。在另一个实例中，ffar4激动剂可以是一种pufa和gw9508或tug-891中的一种或两种，或其药学上可接受的盐。在另一个实例中，ffar4激动剂可以是gw9508和 tug-891两种，或其药学上可接受的盐。当有两种或更多种pufa时，可以使用ala、epa和dha的任意组合。
75.在一些实施方案中，ffar4激动剂可包含epa和dha。在这些实施方案中，可选择各种比例的epa:dha。在一些实施方案中，ffa4激动剂是dpa(22:5)、epa(20:5)或ara(20:4)或几种pufa的组合(例如在胶囊中)。
76.ffar4激动剂可以是天然存在的激动剂，例如在天然油中发现的那些，或者可以是合成激动剂。例如，ffar4激动剂可以天然存在于例如鱼油中，例如来自鲱鱼或沙丁鱼，或者ffar4激动剂可以已经合成。
77.在一些实施方案中，ffar4激动剂选自以下：癸酸(10:0)、十一环酸 (11:0)、月桂酸(12:0)、十三烷酸(13:0)、肉豆蔻酸(14:0)、十五烷酸(15:0)、棕榈酸(16:0)、肉豆蔻油酸(14:1n-5)、棕榈油酸(16:1n-7)、油酸(18:1n-9)、岩芹酸(18:1n-12)、顺式-异油酸(18:1n-7)、反油酸(反式-18:1n-9)、异油酸(反式-18:1n-7)、二十碳烯酸(20:1n-9)、芥酸(22:1n-9)、神经酸(24:1n-9)、亚油酸(18:2n-6)、γ-亚油酸(18:3n-6)、反亚油酸(全反式18:2n-6)、二十碳二烯酸(20:2n-6)、二高-γ-亚油酸(20:3n-6)、花生四烯酸(20:4n-6)、肾上腺酸(22:4n-6)、松油酸(5,9,12-18:3n-6)、α-亚油酸(18:3n-3)、硬脂酸(18:4n-3)、二十碳三烯酸(20:3n-3)、epa(20:5n-3)、二十二碳三烯酸(22:3n-3)、 dha(22:6n-3)、c9,t11-共轭亚油酸(cla)(c9,t11-18:2n-7)、 t9,t11-cla(t9,t11-18:2n-7)、t10,c12-cla(t10,c12-18:2n-6)、α-桐酸 (c9,t11,t13-18:3n-5)、西门木炔酸、α-亚麻酸、metabolex化合物b、
metabolex 36、merck cpda、banyu cpd2、gsk137647a、tug-119、二十二碳六烯酸(22:6；dha,ω3)、二十碳五烯酸(20:5；epa,ω3)、硬脂酸(18:0)、顺式
ꢀ‑
11,14,17-二十碳三烯酸(20:3)、顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(20:5；epa)、 amg-837、amg-1638、ant203、as2034178、dc260126、胰高血糖素样肽1、gw1100、ncg21、tak-875(fasiglifam)、tug-469、tug-424或 tug-770。
78.在一些实施方案中，ffar4激动剂，特别是上述pufa是游离脂肪酸的形式。在其他实施方案中，它以不同的或衍生的形式提供并且是例如醚 (例如乙醚)、酯或其单-、二-或三甘油酯。
79.在一些实施方案中，ffar4激动剂与表面活性剂一起配制以提供自微乳化药物递送系统(smedds)。wo2010/119319(通过引用并入本文)公开了用表面活性剂配制的pufa例如epa和dha组合物。这种制剂可以改善pufa的释放并增强其溶解、消化、生物利用度和/或吸收。
80.α7 nachr激动剂或正调节剂
81.在一些实施方案中，α7 nachr激动剂或正调节剂是激动剂。在一些实施方案中，α7 nachr激动剂是pnu-282907、sen12333、tc5619、s24795 或a-582941，或其药学上可接受的盐。在其他实施方案中，α7 nachr激动剂选自以下列表：gts-21/dmxb-a、ar-r17779、ssr180711、abbf、 evp-6124、tc-5619、rg3487、pha-568487、azd03128、abt-107和jn403。
82.在一些实施方案中，α7 nachr激动剂或正调节剂是正调节剂。在一些实施方案中，正调节剂是正变构调节剂。在一些实施方案中，α7 nachr 正调节剂是加兰他敏、ns-1738、pnu-120596或tqs(rndsystems.目录号 4233/10)，或其药学上可接受的盐。
83.在一些实施方案中，正调节剂是i型pam。在一些特定实施方案中， i型pam选自以下：染料木黄酮、ns-1738、avl-3288和加兰他敏。在一些实施方案中，正调节剂是ii型pam。在一些特定实施方案中，ii型pam 选自以下：pnu-120596和pam-2。
84.在进一步的实施方案中，α7 nachr激动剂或正调节剂选自以下： encenicline(evp-6164)、aq051、abt-126、托烷司琼(tropisetron)、tc-5619、 jnj-39393406、尼古丁和奥匹哌醇、avl-8168、bms-910731、bnc-210、 bnc-375、bradanicline、epgn-1137、gln-1062、nbp-14、skl-20540和 vqw-765。
85.在jerem
í
as corradi and cecilia bouzat.mol pharmacol 90:288
–
299, 2016年9月(特别是其中的表1)；antonella de jaco,laura bernardini, jessica rosati and ada maria tata.central nervous system agents in medicinal chemistry,2017,17(特别是其中的表1)；jason r.tregellas,koreyp.wylie nicotine&tobacco research,2018,1
–
8(特别是其中的表1)；和 neuronal acetylcholine receptor subunit alpha 7(chrna7)-pipelinereview,h2 2018中提供了合适的α7 nachr激动剂或正调节剂的更多细节，每篇文献均通过引用并入本文。
86.在一些实施方案中，存在多于一种α7 nachr激动剂和/或正调节剂。例如，pnu-282987、加兰他敏、ns-1738、pnu-120596或tqs中的多于一种，或其药学上可接受的盐的任意组合。在一些实施方案中，α7 nachr 激动剂或正调节剂包括加兰他敏、ns-1738、pnu-120596和tqs，或其药学上可接受的盐。在其他实施方案中，α7 nachr激动剂或正调节剂由加兰他敏、ns-1738、pnu-120596和tqs组成。
87.本文还提供了包含ffar4激动剂和/或α7 nachr激动剂或正调节剂的药物组合物。药物组合物还可包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含一种或多种额外的活性成分和/或佐剂。在某些实施方案中，药物组合物还可包含对相同疾病适应症治疗有效的一种或多种成分。
88.具体组合
89.在一些实施方案中，ffar4激动剂是pufa，并且α7 nachr激动剂或正调节剂是变构正调节剂。在一些实施方案中，ffar4激动剂是dha 并且α7 nachr激动剂或正调节剂是加兰他敏、ns-1738、pnu-1205976 和tqs中的一种或多种。在一些实施方案中，ffar4激动剂是dha并且α7 nachr激动剂或正调节剂是加兰他敏、ns-1738、pnu-1205976和tqs。
90.试剂盒
91.在一些实施方案中，ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂作为单一组合物提供。在一些实施方案中，ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂作为试剂盒提供，所述试剂盒包含：包含ffar4激动剂的第一产品和包含α7 nachr激动剂或正调节剂的第二产品。这些产品可以单独施用于患者，或者可以配制成单一的组合物，然后施用于患者。
92.在一些实施方案例中，产品是药物产品。在其他实施方案中，试剂盒还提供至少一种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂，用于将ffar4 激动剂和/或α7 nachr激动剂或正调节剂制成药物组合物。
93.在存在多于一种ffar4激动剂和/或多于一种α7 nachr激动剂和/或正调节剂的实施方案中，每种ffar4激动剂和/或每种α7 nachr激动剂和/或正调节剂可以在单独的产品中提供。在一些实施方案中，所有ffar4 激动剂在第一产品中提供，并且所有α7 nachr激动剂和/或正调节剂在第二产品中提供。
94.试剂盒中的每种产品都装在单独的小瓶或隔室中。试剂盒还可包括用于施用每种产品的说明书。
95.神经变性疾病
96.本发明的组合物用于治疗神经变性疾病，优选在人类中。在一些实施方案中，神经变性疾病与炎症和α7 nachr的表达或反应性的降低有关。在一些实施方案中，神经变性疾病是阿尔茨海默病。
97.治疗方法
98.还提供了治疗神经变性疾病的方法，尤其是在人类中。在一些实施方案中，该方法包括向有需要的患者施用如上所述的ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂。ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂可以作为单一组合物施用或可以作为单独的组合物施用。
99.在一些实施方案中，ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂作为单独的组合物同时施用。在一些实施方案中，这种同时施用意味着两种组合物在彼此相隔几分钟内施用(即它们不是在完全相同的时间施用)。
100.在一些实施方案中，ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂顺序施用，即一个接一个。在一些实施方案中，ffar4激动剂在α7 nachr 激动剂或正调节剂之前施用。在一些实施方案中，α7 nachr激动剂或正调节剂在ffar4激动剂之前施用。在一些实施方案中，在α7 nachr激动剂或正调节剂之前至少一周、至少两周、至少三周、至少一个月、至少两个月或
至少三个月施用ffar4激动剂。在一些实施方案中，在α7 nachr 激动剂或正调节剂之前一周、两周、三周、一个月、两个月或三个月施用 ffar4激动剂。在一些实施方案中，在α7 nachr激动剂或正调节剂之前一个月施用ffar4激动剂。施用剂量之间的延迟不必是准确的(即正好一周或正好一个月)。在延迟是以周为单位的情况下，“周”理解为6至8 天。在延迟是以月为单位的情况下，“月”理解为28至32天。
101.在一些实施方案中，ffar4和α7 nachr激动剂或正调节剂各自向患者施用数次(即不止一次)。在一些实施方案中，ffar4激动剂和α7 nachr 激动剂或正调节剂施用相同的次数。在一些实施方案中，ffar4激动剂的施用次数比α7 nachr激动剂或正调节剂的施用次数多。在一些实施方案中，α7 nachr激动剂或正调节剂的施用次数比ffar4激动剂的施用次数多。
102.ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂中的每一个可以独立地施用至少两次、至少三次、至少四次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次或至少10次。在一些实施方案中，向患者施用ffar4 激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂中的每一种超过10次。
103.在一些实施方案中，每一、二或三周或每一、二或三个月施用ffar4。在一些实施方案中，每一、二或三周或每一、二或三个月施用α7 nachr 激动剂或正调节剂。当ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂在单一组合物中时，该组合物可以每1、2或3周或至少每1、2或3个月施用一次。
104.在一些实施方案中，治疗方法包括诊断受试者是否患有神经变性疾病，如果是，则作为单独的组合物或作为单一组合物施用ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂。
105.剂量
106.在一些实施方案中，dha或其衍生物以至少0.75g/天、0.8g/天、0.85g/ 天、0.9g/天、1.0g/天、1.05g/天、1.1g/天、1.15g/天、1.2g/天、1.25g/天、 1.3g/天、1.35g/天、1.4g/天、1.45g/天、和1.5g/天的量施用。在一些实施方案中，dha或其衍生物以不超过4.5g/天、4.0g/天、3.95g/天、3.9g/天、 3.85g/天、3.8g/天、3.75g/天、3.7g/天、3.65g/天、3.6g/天、3.55g/天、3.5g/ 天、3.45g/天、3.4g/天、3.35g/天、3.3g/天、3.25g/天、3.2g/天、3.15g/天、 3.1g/天、3.0g/天、2.95g/天、2.9g/天、2.85g/天、2.8g/天、2.75g/天、2.7g/ 天、2.65g/天、2.6g/天、2.55g/天、2.5g/天、2.45g/天、2.4g/天、2.35g/天、 2.3g/天、2.25g/天、2.2g/天、2.15g/天、2.1g/天、2.05g/天、2.0g/天、1.95g/ 天、1.9g/天、1.85g/天、1.8g/天、1.75g/天、1.7g/天、1.65g/天、1.6g/天、 1.55g/天、或1.5g/天的量施用。在一些实施方案中，dha或其衍生物以 0.75g/天和2.5g/天之间、0.75g/天和2.25g/天之间、0.8g/天和2.25g/天之间、 1.0g/天和2.0g/天之间、1.25g/天和2.0g/天之间、1.35g/天和2.0g/天之间或 1.5g/天和2.0g/天之间的量施用。在一些实施方案中，dha或其衍生物以 1.5g/天的量施用。在一些实施方案中，dha或其衍生物以2.0g/天的量施用。对于除dha或其衍生物以外的ffar4激动剂，所选择的剂量是实现与上述dha剂量等效的剂量。在存在多于一种ffar4激动剂的实施方案中，施用的每种ffar4激动剂的量可以独立地如上所述。在一些实施方案中，施用的ffar4激动剂的总量如上所述。例如，在一些实施方案中，施用的dha或其衍生物的总量为1.5g/天。在其他实施方案中，施用的 dha或其衍生物的总量为2.0g/天。在其他实施方案中，施用的dha或其衍生物的总量在3.5g/天和4.5g/天之间，优选4.0g/天。特别优选
地，施用的dha或其衍生物的浓度在1和100μm之间，优选地在5和20μm之间，更优选地在8和12μm之间，更优选地10μm。在一些实施方案中， ffar4激动剂作为包含至少60重量％的一种或多种pufa，例如至少70 重量％、80重量％、90重量％或95重量％的一种或多种pufa的pufa 组合物提供。在一些实施方案中，ffar4激动剂包含至少90重量％的dha。
107.在一些实施方案中，α7 nachr激动剂或正调节剂以至少4mg/天、至少5mg/天、至少6mg/天、至少7mg/天、至少8mg/天、至少9mg/天、至少10mg/天、至少11mg/天、至少12mg/天、至少13mg/天、至少14mg/ 天、至少16mg/天、至少17mg/天、至少18mg/天、至少19mg/天、至少 20mg/天、至少21mg/天、至少22mg/天、至少23mg/天或至少24mg/天的量施用。在一些实施方案中、α7 nachr激动剂或正调节剂以不超过30mg/ 天、不超过29mg/天、不超过28mg/天、不超过27mg/天、不超过26mg/ 天、不超过25mg/天或不超过24mg/天的量施用。在一些实施方案中，α7 nachr激动剂或正调节剂以4mg/天和24mg/天之间、5mg/天和24mg/天之间、5mg/天和10mg/天之间、8mg/天和24mg/天之间、8mg/天和16mg/天之间，或16mg/天和24mg/天之间的量施用。合适剂量的更多细节可以在 wattmo等人，alzheimer's research&therapy20135:2中找到，其通过引用并入本文。在存在多于一种α7 nachr激动剂和/或正调节剂的实施方案中，每种激动剂和/或正调节剂以如上所述的量独立地施用。在一些实施方案中，施用的一种或多种α7 nachr激动剂或正调节剂的总量如上所述。
108.施用
109.ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂可以通过本领域技术人员已知的任何递送技术施用于患者。例如，在其他技术中，ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂可以通过注射、口服、以溶液形式、脂质体形式或干燥形式(例如，以包衣颗粒、口服胶囊等形式)或借助皮肤贴剂来施用。在ffar4激动剂和α7 nachr激动剂或正调节剂作为单独的组合物施用的实施方案中，它们可以通过相同或不同的技术施用。在一些实施方案中，ffar4激动剂是口服施用。在一些实施方案中，α7 nachr激动剂或正调节剂口服施用。
实施例
110.实施例1
111.以下试点实验的结果表明，免疫沉淀液相色谱质谱(ip lc-ms)方法检测与监测疾病进展和治疗两者相关的aβ降解。ip lc-ms工具已用于两组样品；来自患者和健康受试者的细胞模型系统和生物体液。
112.首先，使用细胞模型来研究ω-3脂肪酸dha对淀粉样蛋白β降解的影响。在这里，thp-1细胞在有和没有dha(1μm)的情况下孵育，随后与 aβ(1-40aa，10ng/μl)一起孵育。其次，从健康对照(nc)和神经变性疾病(ad) 患者中分离出单核细胞。在这两种情况下，细胞都被裂解并进行了iplc-ms。从ip lc-ms鉴定的肽产生了图1和图2中显示的aβ切割模式的说明。
113.在图1中，图中的每个条表示沿aβ1-40中40个氨基酸的每个位置上累计的切割位点。因此，条含有各种长度的肽，但具有相同的起始或结束氨基酸。对每个条件/样品组进行三个平行分析，这是指有或没有dha的每个条件下的三次孵育。
114.dha实验中的切割模式(图1)意味着接受和未接受dha的细胞之间的酶活性不同。同样，从健康和患病受试者的细胞中获得的aβ的切割模式不同，部分与thp-1模型的切割模
式相当。图2说明thp-1细胞中的切割位点对应于供体单核细胞中的切割位点。
115.预计进一步的实验将筛选各种化合物对aβ降解和其他疾病相关蛋白质实体的影响。
116.实施例2
117.单核细胞thp-1细胞被用作模型系统，ip lc-ms作为分析方法来研究dha对单核细胞aβ-40处理的影响。
118.使thp-1细胞系培养物成熟和分化，分成对照并平行刺激，并重复进行总共7次(对照n＝7；dha刺激n＝7)。测试细胞与dha孵育过夜，所有样品与aβ-40孵育1至2h。在用两种商业抗体和一种内部抗体进行免疫沉淀之前，通过冻融循环裂解细胞。将免疫沉淀物注入lc-ms系统。液相色谱使用c4吸附剂在传统的两柱装置中操作。质谱在传统的esi 和 dda模式下操作。
119.在细胞裂解物中，很少检测到完整的aβ-40，而广泛检测到aβ-40降解产物，证明单核细胞吞噬和降解的aβ-40两者。在分析的样品中鉴定了累计数量的89种降解的aβ肽(n＝14)。
120.还对条件之间的aβ-40肽进行了半定量评估。在这里，比较了分解代谢肽的产量，dha与对照样品中分解代谢肽的平均比率为1.3(12％rsd)。这意味着dha可作为aβ-40的单核细胞吞噬作用和分解代谢之一或两者的催化剂。
121.aβ细胞培养物降解模式如图3所示。结果与溶酶体降解的体外实验和从患者收获的单核细胞中获得的实验结果相一致，这表明在体内相当的效果是合理的。
122.实施例3
123.离体单核细胞
124.从年龄范围为24至84岁，性别分布为1:1的供体血液样品(n＝36) 中分离单核细胞。进行ip和nlcms以研究单核细胞aβ产物。在使用两种商业抗体和一种内部抗体进行免疫沉淀(ip)之前，通过冻融循环裂解细胞。
125.将ip洗脱液注入nlc-ms系统。nlc使用c4吸附剂在传统的两柱设置中操作。ms在传统的esi 和dda模式下操作。
126.在单核细胞中鉴定出累计数量的38种内源性aβ肽。这些肽主要来自以下pbbs；13-23、33-34和37-40，如图2所示，表明中域周围的保守节段与内溶酶体模型的结果类似(1)。
127.thp-1细胞
128.单核细胞thp-1细胞被用作模型系统，ip和nlcms作为分析方法来研究dha对单核细胞aβ1-40处理的影响：thp-1细胞系培养物成熟和分化，分成对照(7)和平行刺激(7)。受刺激的样品与dha孵育过夜，所有样品与aβ1-40孵育1或2h。ip和nlcms执行如上(图1、2和3)。
129.western印迹蛋白质分析
130.通过western印迹分析对用和不用aβ1-42以及用和不用dha孵育的 thp-1细胞进行检测，检测细胞样品中是否存在烟碱型乙酰胆碱受体 (nachr)的α7亚型。这样做的目的是显示nachr的单核细胞膜表达，并探索该受体响应dha刺激的调节的改变。
131.thp-1细胞生长
132.将thp-1细胞以830000个细胞/ml(实验1)或860000个细胞/ml (实验2)的浓度接
种在6孔板中，每孔2ml，并使用100nm tpa(12-o
‑ꢀ
十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯)分化24小时。对于实验，添加dha以提供 100um(实验1)或10um和100um(实验2)的浓度，并以2.5ng/ul的终浓度添加aβ42。将细胞孵育过夜(18小时)。每个dha实验都有未用 dha孵育的细胞做平行。孵育后，细胞保持低温，刮松并转移到15ml管中。细胞用冷pbs洗涤两次，然后重新悬浮在100ul pbs中并转移到 eppendorf管中。通过五个冻融循环裂解细胞，并通过bca蛋白质测定法测定每个样品中的总蛋白质。分析后将样品储存在-80℃。
133.western印迹条件
134.western印迹分析在目录号21379-1-ap，proteintech，使用1:1000稀释进行。二抗是山羊抗兔igg-hrp(目录号4030-05，southernbiotech)， 1:2000稀释。用于稀释的溶剂如下所述。
135.将样品溶解在4x laemmli缓冲液w/b-me(分别为biorad和)，95℃变性5min，并将质量为12μg蛋白质/样品/孔加样到凝胶中。体积为10ul 的precision plus protein dual xtra颜色标准品(biorad)用于估计分子量。样品在8-16％梯度sds-page(criterion tgx预制凝胶，biorad)中分离并免疫印迹到pvdf膜(ge healthcare)上。膜在含0.1％ tween20(1xtbs-t)(biorad)的1x tris缓冲盐水中的5％脱脂奶粉中在室温下封闭1h，然后在含1％脱脂奶粉的1x tbs-t中用一抗在4℃下孵育过夜。洗涤后，将膜用二抗在1x tbs-t中的5％脱脂奶粉中室温孵育1h。根据供应商的说明书，通过ecl plus蛋白质印迹检测系统(ge healthcare)可视化印迹。在las-3000mini(fujifilm corporation)上可视化膜，并使用 multigauge分析软件(fujifilm corporation)量化条带强度。
136.显示的条带位于nachr的预测mw(56kda)。
137.结果见表1和图4(chrna7是56kda蛋白质)。
138.表1
[0139][0140]
结论
[0141]
实验结果与dha刺激后chrna7上调一致(chrna7是56kda蛋白)，因此伴随着ab降解的增加。也可能存在仅ab42表达较低的趋势，这可能会阻碍ab的摄取。
[0142]
实施例5
[0143]
图5示出了chrna7和chrfam7a在添加了aβ肽、aβ肽与dha 组合以及单独的dha的分化thp-1细胞中的单核细胞表达(蛋白质印迹)。 dha：二十二碳六烯酸，aβ1-40肽：含有40个氨基酸的常规淀粉样β肽。
[0144]
图5的结果显示，当用dha刺激时，chrna7(功能亚基)表达增加，chrfam7a(已知阻碍α7 nachr功能的亚基)表达减少。与dha 和aβ1-40肽共同刺激时效果更明显。
[0145]
实施例6
[0146]
图6示出了添加了aβ肽，aβ肽与dha组合以及单独的dha的 chrna7和chrfam7a的单核细胞表达(定量pcr数据)。
[0147]
图6的结果显示，当用dha刺激时，chrna7(功能亚基)转录增加，chrfam7a(已知阻碍α7 nachr功能的亚基)转录减少。与dha 和aβ1-40肽共同刺激时效果更明显。
[0148]
实施例7
[0149]
thp-1细胞系和治疗
[0150]
人急性单核细胞白血病细胞系thp-1(atcc tib-202，atcc，us) 在37℃和5％co2下，在含有glutamax(gibco，life technologies，uk) 并补充10％胎牛血清(fbs)，(gibco，life technologies，uk)和1％抗生素/抗真菌剂(gibco，life technologies，uk)的rpmi 1640中培养。
[0151]
将160万个细胞接种到6孔板的每个孔中，并通过100nm tpa(12-o
‑ꢀ
十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯)(cell signaling technology，us)处理48小时使其分化为巨噬细胞。用100μm二十二碳六烯酸(dha)、(sigma aldrich， germany)、10ng/ul淀粉样β蛋白1-40(aβ)、(apexbio，us)、10μm pnu-120596(sigma aldrich，germany)，40μm氢溴酸加兰他敏(sigmaaldrich，germany)和组合处理细胞过夜(大约20h)。
[0152]
rna分离和实时定量pcr(qpcr)
[0153]
使用rneasy plus mini试剂盒(qiagen)使用基因组dna消除柱分离总 rna。根据方案使用350μl rlt plus直接在孔中裂解thp-1细胞并储存在
ꢀ‑
80℃。将冷冻的裂解物在37℃的水浴中孵育，直至完全解冻并使用 qiashredder(qiagen)离心柱均质。rna在30μl无rnase的水中洗脱，并使用nanodrop nd-1000分光光度计(nanodrop technologies)评估数量。
[0154]
qpcr分析
[0155]
使用quantitect cdna逆转录试剂盒(qiagen)逆转录1μg总rna。由于低chrna7表达(cq值》38，表2)，将rna输入量增加到2μg，将逆转录试剂盒改为高容量逆转录试剂盒(life technologies as)，并使用 taqman preamp master mix对cdna进行预扩增(life technologies as)，运行18个循环并按1:20稀释(图7)。然后获得了chrna7的cq值《27 (平均25.4)和《20(chrfam7a，平均18.6)。使用chrfam7a和 chrna7合成寡核苷酸标准品(gene art，life technologies as)进行绝对定量。使用taqman基因表达分析chrfam7a(hs04189909_m1)和 chrna7(hs01063372_m1)(thermo fisher)和taqman基因表达预混液(lifetechnologies as)，在每次qpcr反应中应用预扩增后按1:20稀释的2,5ulcdna，总体积为10μl并在quant studio7(applied biosystems)上三个重复运行。
[0156]
讨论
[0157]
α-7烟碱受体亚类(最近发现的独特的人类chrfam7a(“m”)和经典形式chrna7(“n”))的转录可以通过结合dha和α7-胆碱能激活的方式进行修饰，使得n/m比增加。chrna7是功能亚基，而chrfam7a 是已知阻碍α7 nachr功能的亚基。
[0158]
本实施例提供了证据表明dha(二十二碳六烯酸)和α7-变构正调节剂可以增加先
天免疫α7-胆碱能(烟碱能)反应性，因为dha和烟碱能激活的组合减少chrfam7a-转录并增加chrna7转录。
[0159]
结果表明：
[0160]
1)α7烟碱受体亚类(最近发现的独特的人类chrfam7a和经典形式chrna7)的转录可以通过组合dha和α7-胆碱能变构调节剂进行修饰。
[0161]
2)受体激活增加了chrna7并减少了chrfam7a转录。
[0162]
3)结果也支持了chrna7和chrfam7a转录被独立调控的模型。
[0163]
4)表明了chrna7和chrfam7a亚类在单核细胞中转录。
[0164]
图7示出了thp-1单核细胞在tpa(12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯)和不同附加条件下培养的结果。定量pcr，证明在条件1(dha)中chrna7(“n”)转录稳定，而chrfam7(“m”)转录减少，导致n/m比(灰色柱)增加。条件2，淀粉样蛋白β，显示n和m受体转录都减少。条件3显示在pnu-120596(α-7烟碱正调节剂)存在下的较小变化。类似地，条件4显示在gal(加兰他敏；α-7烟碱变构调节剂)存在下的较小变化。条件5，dha 淀粉样蛋白β显示未改变的n和减少的m转录，导致n/m比增加。条件6显示在pnu和dha存在下n-受体转录强烈增加。条件7显示在pnu和dha和淀粉样蛋白β存在下n-受体转录强烈增加，m转录减少，n/m比强烈增加。条件8显示在gal和dha存在下m受体转录减少，n/m比增加。条件9显示在gal、dha和淀粉样蛋白β存在下m受体转录减少，n/m比增加。
[0165]
受体激活增加chrna7转录并减少chrfam7转录。
[0166]
鉴于chrfam7表达对功能性α7烟碱受体表达的预期影响，预计所观察到的高n/m比是有益的，并且是建议的联合治疗方案的结果(图7)。
[0167]
与阿尔茨海默病特别相关，发现dha与淀粉样蛋白β以及有或没有α7正调节剂，增加n转录并减少m转录，从而使α7亚类转录偏向更高的n/m比(图7)。
[0168]
显示chrna7和chrfam7a亚类在单核细胞中转录(表2)。
[0169]
表2
[0170]
基因cq值细胞类型chrna7_hs01063372_m139.7thp-1单核细胞chrfam7a_hs04189909_m132.4thp-1单核细胞
[0171]
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