用于检测前列腺癌生物标志物的方法与流程

1.本公开涉及一种用于从尿液样品中检测前列腺癌相关生物标志物的方法。本公开还涉及可在家中使用的预筛选方法和试剂盒，并涉及用于自动分析尿液样品的系统。


背景技术：

2.前列腺癌是男性最常见的癌症类型。前列腺癌的过度诊断可能导致过度治疗。这通常会导致影响生活质量的长期副作用。面临的挑战是将生长非常缓慢且危害最小的前列腺癌类型与侵袭性转移性前列腺癌类型区分开来。典型的前列腺癌诊断包括前列腺特异性抗原(psa)检测、直肠指检、膀胱镜检查和磁共振成像(mri)方法。psa检测是最简单和最经济(cost-effective)的，因为它可以在实验室由血液样品进行测量。然而，psa检测的缺点在于，血液中的psa量也可能由于其他若干原因而升高(例如在良性病症下)，并因此检测会产生较高的假阳性结果。这种假阳性结果会导致额外的诊断和不必要的治疗，更不用说精神压力。以上所列方法均不适用于人群水平的前列腺癌筛查。


技术实现要素：

3.鉴于这些已知的诊断方法，需要一种经济、简单、快速和可靠的方法来诊断侵袭性前列腺癌。有利地，还旨在提供一种使用简单的测试试剂盒在家中预筛选前列腺癌的方法。此外，仍旨在提供一种易于实施的自动筛选系统。
4.典型的用于检测前列腺癌相关生物标志物的方法包括：
[0005]-将人类受试者的尿液样品与调节剂和发光标签接触以获得测量样品，所述调节剂选自由钠；3-羟基-4-[(2-羟基萘-1-基)二氮烯基]萘-1-磺酸酯、钠；3-羟基-4-[(1-羟基萘-2-基)二氮烯基]-7-硝基萘-1-磺酸酯、三异丙基硅烷，和氯化铁(iii)组成的组；
[0006]-孵育所述测量样品；
[0007]-用激发光照射所述测量样品；以及
[0008]-测量所述测量样品中所述标签的时间分辨发光信号，并且如果所述发光信号比对照样品的发光信号高至少50％，则确定所述人类受试者的前列腺癌的可能性增加，所述对照样品来自未患有前列腺癌的人类受试者。
[0009]
另一种典型的用于预筛选前列腺癌相关生物标志物的方法包括：
[0010]-在测试管内接触人类受试者的尿液样品，其中，所述测试管包括三异丙基硅烷和钠；3-羟基-4-[(2-羟基萘-1-基)二氮烯基]萘-1-磺酸酯；
[0011]-将所述测试管与所述样品一起孵育；以及
[0012]-目视观察所述测试管，并且如果观察到所述测试管的内容物的颜色改变，则确定前列腺癌的可能性增加。
[0013]
典型的多个部分的试剂盒(a typical kit of parts)，包括
[0014]-包括三异丙基硅烷和钠；3-羟基-4-[(2-羟基萘-1-基)二氮烯基]萘-1-磺酸酯的测试管；
mol sci.2018；20(1):95.)。尿铁浓度通常介于50-100μg/l，随个体生理和年龄变化而变化(pfrimer,karina et al.“impact of aging on urinary excretion of iron and zinc”nutrition and metabolic insights(2014)vol.7；47-50.26.)。本方法基于健康和不健康受试者尿液样品中铁结合分子的差异。事实上，这些分子在癌症样品中比在健康样品中更丰富。该差异通过所描述方法检测。假设癌性和健康样品的铁浓度相同，但铁结合剂的量不同。因此，在癌性病例中信号较高，因为游离铁被结合剂摄取。在健康样品中，铁保留在样品中，并干扰标签，使得发光信号降低。
[0033]
调节剂钠；3-羟基-4-[(2-羟基萘-1-基)二氮烯基]萘-1-磺酸酯以商品名为calcon
tm
(cas编号2538-85-4)出售，和调节剂钠；3-羟基-4-[(1-羟基萘-2-基)二氮烯基]-7-硝基萘-1-磺酸酯以商品名为black t(cas编号1787-61-7)出售。优选使用纯度为97％的氯化铁(iii)(cas编号7705-08-)和优选纯度为98％的三异丙基硅烷(cas编号6485-79-6)。
[0034]
当钠；3-羟基-4-[(2-羟基萘-1-基)二氮烯基]-萘-1-磺酸酯用作调节剂时，其用量通常为50-800μm，最通常为250μm，体积为4μl。当钠；3-羟基-4-[(1-羟基萘-2-基)二氮烯基]-7-硝基萘-1-磺酸酯用作调节剂时，其用量通常为50-1000μm，优选500μm，体积为4μl。当三异丙基硅烷用作调节剂时，其用量通常为10％溶液的4μl，但也可使用2-25％的溶液。当氯化铁(iii)用作调节剂时，其用量通常为5-500μm，优选300μm。
[0035]
在本方法中，如果发光信号比对照样品的发光信号高至少50％，则确定人类受试者的前列腺癌的可能性增加，所述对照样品来自未患有前列腺癌的人类受试者。因此，发光信号可以比对照样品高至少50、75、90、100、125、150、175、200、250或300％，或者甚至更高。
[0036]
通常，本方法不包括在人体上实施的步骤。
[0037]
所使用的标签可以是氯化铕(eucl
3
)标签或氯化铽(tbcl
3
)标签。如本领域技术人员所知，这些标签以复合物的形式存在。例如，可使用来自sigma-aldrich的氯化铕(iii)99.99％、cas编号10025-76-0，和来自sigma-aldrich的氯化铽(iii)99.99％、cas编号10042-88-3。氯化铕标签可以用例如氯化铕、次氮基三乙酸(nta)(例如99％，cas编号139-13-9，来自sigma-aldrich)和三辛基氧化膦(topo)(例如99％，cas编号78-50-2，来自sigma-aldrich)的复合物。一种可能的组合是以3:9:9的比例混合这三种成分。也可以使用2-噻吩甲酰三氟丙酮(例如99％，cas编号326-91-0，来自sigma-aldrich)或4,4,4-三氟-1-(2-呋喃基)-1,3-丁二酮(例如99％，cas编号326-90-9，来自sigma-aldrich)代替nta。
[0038]
氯化铕复合物的各种组分浓度，氯化铕为80nm-5.0μm；topo为5nm-3μm；nta为100nm-3μm。因此氯化铕的浓度可以是例如80nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm或4μm直至200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm或5μm。topo的浓度可以是例如5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、1.5μm或2μm直至15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm或3μm。因此nta的浓度可以是例如100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、1.5μm或2μm直至200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、
700nm、800nm、900nm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm或3μm。
[0039]
根据一个实施方案，标签的用量为每个微量滴定孔4μl。因此，一种可能性是以4μl用量的标签混合物使用标签，所述标签混合物含有二甲基亚砜中的氯化铕0.717μm、三辛基氧化膦0.430μm和次氮基三乙酸0.430μm(nta)。
[0040]
激发光可以来自例如脉冲激光器、发光二极管(led)，或氙闪光灯。
[0041]
根据一个实施方案，在200-800μs延迟时间之后，测量时间分辨发光信号200-800μs的时间。因此，可以测量信号，例如从200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或750μs直至250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750或800μs的时间。独立于此，延迟时间可以是例如从200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或750μs直至250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750或800μs。
[0042]
在将样品与调节剂接触之前，可选对尿液样品进行稀释。稀释剂和调节剂也可同时加入。稀释剂可以是例如生理盐溶液。稀释率可以是例如1:5-1:20。1:5的稀释率是指有1份体积的样品和5份体积的生理盐溶液。稀释率可以是例如从1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15或1:16直至1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20。
[0043]
典型的孵育时间为1-15分钟。较长的孵育时间可能会降低方法的效率。孵育时间可以是例如从1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12分钟直至4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分钟。孵育通常在室温和正常大气下进行。
[0044]
本公开还涉及另一种方法，即用于预筛选前列腺癌相关生物标志物的方法，包括：
[0045]-在测试管内接触人类受试者的尿液样品，其中，所述测试管包括三异丙基硅烷和钠；3-羟基-4-[(2-羟基萘-1-基)二氮烯基]萘-1-磺酸酯；
[0046]-将所述测试管与所述样品一起孵育；以及
[0047]-目视观察所述测试管，并且如果观察到所述测试管的内容物的颜色改变，则确定前列腺癌的可能性增加。
[0048]
因此，该方法与受试者可以在家进行的测试相关。除非另有说明，以上公开的与使用标签的方法相关的实施方案和变体应用必要修改以适用于该家庭方法。
[0049]
最通常的情况是，如果使用样品稀释法，将尿液样品稀释至1:2(1份样品，2份生理盐溶液)。两种调节剂均置于样品管中。如果样品含有癌性标志物，测试管中的颜色将变为630-650nm范围内可见的颜色，即测试管将变成红色/暗红色。对于健康的受试者，颜色没有变化。需要注意的是，即使样品随后被干燥，颜色仍会保留在测试管中。
[0050]
颜色的变化可以通过人眼视觉观察到，或者可以通过例如装在移动电话上并与移动电话的相机一起使用的特定应用程序来读取。
[0051]
测试管的体积通常为1-10ml，例如3ml。样品的稀释最好在测试管中进行。在该方法中，孵育时间也通常为1-15分钟，并且以上所列变体加上必要的修改可以适用。根据一个实施方案，三异丙基硅烷的用量针对3ml样品，对于3ml的经稀释样品体积，优选200μl 10％溶液。三异丙基硅烷也可用作5
–
25％的溶液。对于3ml体积的经稀释样品，钠；3-羟基-4-[(2-羟基萘-1-基)二氮烯基]萘-1-磺酸酯的用量为200μl的250μm溶液。该调节剂也能以100μm-800μm范围使用。
[0052]
本公开仍进一步涉及多个部分的试剂盒，包括：
[0053]-包括三异丙基硅烷和钠；3-羟基-4-[(2-羟基萘-1-基)二氮烯基]萘-1-磺酸酯的测试管；
[0054]-用于采集尿液样品的装置；和
[0055]-用于将经稀释的尿液样品与测试管接触的装置。
[0056]
因此，尽管可用于医疗保健，多个部分的试剂盒也能用于例如在家进行测试，特别是在实验室器材较少或没有实验室器材的地方。多个部分的试剂盒还例如以安瓿瓶形式包含用于稀释的一些生理盐溶液。然后，多个部分的试剂盒仍可进一步包含用于稀释尿液样品的装置。
[0057]
用于采集尿液样品的装置可以是无菌杯和无菌注射器。用于稀释尿液样品的装置可包括无菌比色皿或无菌管，其由透明材料制成并待有标记，该标记向用户显示要添加多少生理盐溶液。用于将经稀释的尿液样品与测试管接触的装置可以是例如移液管。试剂盒优选还包括使用说明书。
[0058]
本公开仍进一步涉及试剂盒，所述试剂盒包括调节剂和将其与时间分辨发光测量仪一起使用的说明书，即用于实施确定前列腺癌可能性的方法的说明书。试剂盒还可以包括对照样品的数据库、对该数据库的使用许可，或者用于比较的一些对照样品。此外，试剂盒可以包括标签。
[0059]
本公开还涉及钠；3-羟基-4-[(2-羟基萘-1-基)二氮烯基]萘-1-磺酸酯、钠；3-羟基-4-[(1-羟基萘-2-基)二氮烯基]-7-硝基萘-1-磺酸酯、三异丙基硅烷，或氯化铁(iii)用于前列腺癌的预筛选的用途。该用途通常是离体的。
[0060]
本公开仍进一步涉及用于自动分析尿液样品的系统，该系统能连接到马桶。该系统包括：
[0061]-至少一个检测设备，其被配置为接收尿液样品，以检测所述尿液样品的初始颜色，使所述尿液样品与调节剂接触以形成测量样品，孵育测量样品并检测孵育后颜色和/或所述颜色的强度；
[0062]-计算设备，其被配置为分析经检测的颜色和可选的颜色强度，并且发送任何经检测的前列腺癌风险增加的信息；和
[0063]-用于将经检测的颜色和可选的颜色强度传送到计算设备的装置。
[0064]
检测设备可以附接到马桶的内部，例如附接到马桶的前部和/或后部，使得可以在小便时提供尿液样品。例如，当使用两个检测设备时，它们可以被配置为一旦接收到尿液样品就唤醒，并从而仅在活动(或被唤醒)时通信。检测设备优选地可通过不需要钻孔或类似的可移除附接方式附接。检测设备也可以制成与马桶成一体。
[0065]
用于将经检测的颜色和/或颜色强度传送到计算设备的装置可以例如通过无线电通信或类似方式。计算设备还可以例如经由通信网络连接到服务器系统，在这种情况下，服务器系统可以基于指示前列腺癌的风险增加的任何经检测的信息来进行分析和进一步的动作。服务器还可以配置为存储所提供的任何信息。
[0066]
对经检测的颜色和可选颜色强度的分析包括将添加调节剂前经检测的颜色与孵育后的颜色或该颜色的强度进行比较。也可以在添加调节剂后立即检测颜色，在这种情况下，两次检测都基于颜色的强度。然后将该比较的结果与存储在数据库中的结果(即来自未患有前列腺癌的人的样品的结果和来自患有前列腺癌的人的样品的结果的数据库)进行比
较。至少在表明前列腺癌风险增加时，然后进一步传达后一种比较的结果。
[0067]
检测设备还可以配置为稀释样品，例如使用来自卫生间水系统的水。
[0068]
检测设备可以具有例如以下结构。其包含用于接收尿液样品的开口，且所述开口连接到流体系统的第一部。在该第一部分中，还会向样品中添加水(通常来自马桶的水系统)，以形成经稀释样品。第一部分至少部分透明，以便传感器可以察觉经稀释样品。例如，传感器可以是相机或光电探测器(诸如光敏二极管)，布置为测量介于620-650nm的光的颜色和/或强度。因此，传感器在经稀释样品形成后读取经稀释样品的颜色(通常在数秒内)，并将测量结果传送至计算设备。此后，将经稀释样品与调节剂的混合物(如上文关于可在家中进行的测试方法所公开的)接触，并孵育1-10分钟，例如5分钟。在此期间，开口被关闭，以便使得更多的流体不能够进入检测设备。这可能与稀释发生在相同的部，也可能发生在不同的部。孵育后，样品可再次保留在稀释发生的相同的部，或移至流体系统的另一部。如果样品被移动，系统可以包括第二传感器，或者如果样品一直留在同一空间，则再次使用第一传感器，以测量620-650nm处发射的光的颜色和/或强度。再次地，结果被传送到计算设备，计算设备然后进行分析(或者例如将信息进一步发送到服务器)，并且如果需要，例如将警报发送到马桶用户的移动设备。
[0069]
实验部分
[0070]
来自已知健康受试者和已知患有前列腺癌受试者的尿液样品进行如下测试。
[0071]
使用来自人类受试者的10份癌症和12份健康尿液样品进行了初步实验。在进一步步骤之前，以10000rpm的转速对样品离心5min，以去除任何多余的固体物质。将1ml透明上清液稀释至9ml生理盐溶液。
[0072]
首先向微量滴定孔中加入4μl调节剂溶液。调节剂由mq水中的四种不同的前述调节剂中的一种组成。所有调节剂均从sigma-aldrich获得。然后，将每份样品分成3份体积为100μl的平行样品，并用移液管移至96孔板。
[0073]
最后，向每个微量滴定孔中加入4μl标签混合物，标签混合物含有二甲基亚砜(dmso)中的氯化铕0.717μm、三辛基氧化膦(topo)0.430μm和次氮基三乙酸0.430μm(nta)。
[0074]
孵育10分钟后，使用victor 2多标签计数器(wallac,perkin-elmer life and analytical sciences)在400μs延迟时间后的400μs窗口中测量发光发射强度。
[0075]
图1示出了来自健康受试者和患有癌症的受试者的样品的时间分辨发光信号。时间分辨发光在纵坐标上给出，时间在横坐标上给出。实线表示来自健康受试者的样品的结果(“正常”样品)，并且虚线表示来自患有前列腺癌的受试者的样品的结果。因此，发光有明显的差异，特别是在一定时间后。
[0076]
图2a-2f示出了来自健康受试者和癌症受试者的样品在不同时间点的发光信号，柱的高度表示发光。健康受试者的测试样品数为12个(图2a、2c和2e)，并且癌症受试者的测试样品数为10个(图2b、2d和2f)，每个垂直柱代表一个样品。在时间0，将上面列出的试剂加入到样品中，并且在0分钟(图2a和2b)、5分钟(图2c和2d)和10分钟(图2e和2f)的时间(即立即或在孵育5或10分钟之后)测量发光。在5分钟时间点的测量表明，健康样品的信号水平降低速度快于癌症样品。孵育10分钟后，信号差异已经显著，并足以用于诊断目的。
[0077]
图3a是从上方看到的马桶300的示意图。检测设备310a附接在马桶300的后侧，在马桶内，并且第二检测设备310b附接在马桶300的前侧，在马桶内。检测设备310a、310b以能
够在排尿时提供尿液样品的方式附接。检测设备310a、310b通过无线电通信连接到计算设备340。计算设备340又通过通信网络342连接到服务器系统344。检测设备被配置为测量来自尿液样品的视觉信号，并将测量结果发送到服务器系统344以用于进一步分析和存储。
[0078]
图3b是使用中的检测设备310a的细节的图示。检测设备310a通过附接装置314附接到马桶的侧面302。检测设备310a包括用于接收尿液样品并从出水口304接收水306以稀释样品的第一开口330。尿液样品和水从第一开口330被引导至流体通道的第一部分332。第一部分332对于第一传感器320是至少部分透明的，以测量经稀释样品的第一颜色并将测量的样品的第一颜色提供给控制器324。经稀释样品进一步通过流体系统的第二部分334引导至流体系统的第三部分336。调节剂也被供给到第三部分336(未示出)。第三部分336被配置为将经稀释样品与调节剂一起保持用于孵育。第三部分对于第二传感器322是至少部分透明的，以测量第二颜色和/或其强度，并将测量的第二颜色和/或强度提供给控制器324。如图3a所示，控制器连接至通信模块326，并且通信模块326向计算设备340提供测量结果。