使用藏红花酸治疗实体肿瘤的方法与流程

1.本公开涉及在治疗实体瘤中具有治疗用途的藏红花酸。例如，本公开涉及治疗实体瘤，尤其是胶质母细胞瘤的方法，通过在放射疗法、化学疗法、免疫疗法或其组合的疗法之前、期间或之后向有需要的哺乳动物施用药学有效量的藏红花酸。本公开还涉及藏红花酸在用于治疗实体瘤，尤其是胶质母细胞瘤的组合物中的用途。


背景技术：

2.恶性癌症如血液肿瘤和实体瘤严重威胁着人类健康。癌症的治疗传统上是通过手术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法和激素疗法中的一种或组合来完成的。随着抗癌新药的出现，特别是免疫疗法的兴起，近年来血液肿瘤的疗效有了很大的提高，而放疗和化疗仍然是实体瘤手术后的主要治疗方法。
3.然而，放疗和化疗对正常组织和器官有伤害或毒性，导致自身免疫力下降，并可能导致某些副作用，例如脱发、恶心、呕吐、食欲不振、免疫系统受损、骨髓抑制等。这些副作用可能会危及化疗和放疗的疗效，甚至导致完全停止化疗和放疗。不幸的是，开发能够靶向特定分子或癌症相关信号通路并减少副作用的化疗药物的尝试往往未能在患者预后方面产生预期的改善。这主要是由于癌细胞能够利用多种不同细胞机制的组合来增强活力。在许多情况下，癌细胞能够通过在初始治疗后简单地激活其他存活途径来规避靶向治疗诱导的细胞凋亡。同时，由于肿瘤细胞的原发性和获得性耐药等因素，化疗的治疗效果仍不理想。
4.胶质母细胞瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，由脑和脊髓胶质细胞癌变引起，具有高发病率、高复发率、高死亡率和低治愈率的特点。由于其浸润性生长，它与正常脑组织没有显着区别。而且在大多数情况下，它不仅限于一个脑叶，以手指状的方式穿透脑组织，从而损害脑组织。胶质母细胞瘤约占所有脑肿瘤的12％至15％(占所有原发性中枢神经系统(cns)肿瘤的85％至90％)。美国中枢神经系统肿瘤的新病例数约为每年18,800例(每100,000人6.6例)，约有12,800例(每100,000人4.7例)死亡。这种类型的癌症约占美国所有癌症的1.3％，占美国所有癌症相关死亡的2.2％。在中国，每年有超过100,000例新病例。在全球范围内，每年约有176,000例新的脑和其他中枢神经系统肿瘤病例，估计死亡率为128,000。一般来说，白色人种原发性脑肿瘤的发病率高于黑色人种，男性死亡率高于女性。发病高峰出现在45～70岁之间，其中儿童发病率最高。多形性胶质母细胞瘤(gbm)是最常见和最致命的类型，仍然是一种无法治愈的疾病。即使在最激进的治疗方案下进行治疗，gbm患者的平均预期寿命也只有12-15个月。
5.目前胶质母细胞瘤的标准治疗方法是最大程度地手术切除，然后放疗联合替莫唑胺(tmz)化疗(放疗同时或放疗后)。具体而言，胶质母细胞瘤患者每天接受2gy分次局部照射，每周5天，持续6周(共60gy)，外加替莫唑胺每天75mg/m2/天，休息1个月后，接受6个周期的辅助替莫唑胺(150至200mg/m2/天，在每个28天的周期内连续5天)。然而，接受标准治疗的患者的两年生存率仍然较低。因此，迫切需要开发新的有效治疗剂和/或有效的放疗/化疗增敏剂来治疗胶质母细胞瘤。
6.历史上，天然产物是成功的药用活性化合物来源，尤其是在化疗方面副作用较少。事实上，1981年至2006年间使用的抗癌药物中有63％是天然产物、受天然产物启发或由天然药效团合成。源自天然材料的药用活性化合物具有提供靶向细胞毒性和免疫调节反应的潜力，同时限制与当前使用的癌症治疗相关的副作用。天然产物的使用试图平衡同时针对多种途径的强大能力与人类安全消费和良性副作用的历史记录。
7.藏红花酸(c
20h24
o4，cas：27876-94-4)是一种天然存在的，具有广泛的生理活性的8，8
′‑
diapo-ψ，ψ
′
carotenedioic acid。藏红花酸为砖红色结晶，熔点285℃，不溶于水和大多数有机溶剂。藏红花素具有以下化学结构：
[0008][0009]
作为从藏红花(crocus salivus)或栀子(gardenia jasminoides)果实中提取的着色剂藏红花黄或栀子黄中的次要化合物，藏红花酸已使用了1000多年。藏红花和栀子中的天然藏红花酸含量很稀少。商业上，藏红花酸主要通过番红花苷水解后去除糖基获得。现在也可以通过化学合成方法获得。
[0010]
藏红花酸已被证实能有效增加哺乳动物组织中的氧扩散和耗氧量。藏红花酸微溶于水和普通溶剂，限制了其在食品、饮料、药物和营养补充剂中的应用。通过将藏红花酸与氢氧化钠反应获得反式藏红花酸钠(tsc)以增加其在水中的溶解度(参见美国专利第6,060,511号)。tsc已被证实可治疗高血压、动脉粥样硬化、心血管疾病、外周血管疾病、脑卒中、血管血栓、脑缺血、缺血性骨坏死、慢性眼病、黄斑变性、糖尿病视网膜病变等一系列疾病。
[0011]
据报道，藏红花酸在治疗更严重(55％-60％)的失血时无益。相比之下，tsc在更严重的失血性休克模型中表现良好(参见gainer，expert opinion on investigational drugs，17：6，917-924(2008))。在一项关于tsc对脑梗塞影响的研究中，观察到梗塞体积呈u形减少：梗塞体积的减少在23至229μg/kg的剂量范围内达到统计学显着性，最大保护作用在剂量为92μg/kg。(参见manabe等，j neurosurg.113(4)：802-809(2010))。相比之下，在tsc对放疗和放化疗对动物胶质母细胞瘤模型存活率增强疗效的研究中，发现在100μg/kg左右的剂量下达到峰值疗效(参见，sheehan等人，j neurosurg.108：972-978(2008)；j neurosurg.113：234-239(2010))。随后在美国进行了一项临床试验，以确定在放疗过程中加入tsc(以下简称“tsc 放疗”)治疗gbm的效果。2017年发表了ii期临床结果，其中kaplan-meier分析显示36％接受tsc 放疗的患者在2年时存活，相比之下，标准治疗方法的历史2年生存率为27％至30％。此结果强烈提示放疗时加入tsc有利于gbm的治疗(参见，gainer等人，j neurosurg.126：460-466(2017))。
[0012]
在实体瘤，尤其是胶质母细胞瘤的治疗中，开发用于放射疗法和化学疗法的新型治疗药物和/或增敏剂的医疗需求仍未得到满足。本发明人惊奇地发现，通过在放疗或化疗或联合放/化疗前应用藏红花酸，可以显着提高放疗和化疗的疗效，从而有效治疗实体瘤，防止肿瘤复发和转移。


技术实现要素：

[0013]
一方面，本公开提供了一种治疗哺乳动物的实体瘤的方法，包括在放疗、化疗、免疫疗法或它们的组合之前、期间或之后向哺乳动物施用药学有效量的藏红花酸。
[0014]
在一些实施方案中，哺乳动物是人。
[0015]
在一些实施方案中，放射治疗选自电磁波的形式，例如x射线或伽马射线，或带电粒子或中性粒子。
[0016]
在一些实施方案中，放射疗法通过外照射、间质植入物或其组合来施用。
[0017]
在一些实施方案中，在4-7周内以约60-70gy的剂量给予放射治疗。
[0018]
在一些实施方案中，本文公开的实体瘤选自胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、皮肤癌相关肿瘤、乳腺癌、头颈癌、妇科癌症、泌尿和男性生殖器癌、膀胱癌、前列腺癌、骨癌、内分泌腺癌、消化道癌、乳腺癌、主要消化道/器官癌、中枢神经系统癌和肺癌。
[0019]
在另一个实施方案中，实体瘤是胶质母细胞瘤。
[0020]
在一些实施方案中，化疗方法选自于替莫唑胺、顺铂、甲氨蝶呤或紫杉醇一起施用药物。
[0021]
在另一个实施方案中，化疗方法是使用替莫唑胺。
[0022]
在一个实施方案中，实体瘤是胶质母细胞瘤，并且化疗是施用替莫唑胺。
[0023]
在一些实施方案中，藏红花酸用作增敏剂。
[0024]
在一些实施方案中，该方法进一步包括与至少一种抗癌方法一起施用。
[0025]
本文公开的抗癌方法选自癌症治疗中的其他增敏剂、靶向治疗剂和免疫治疗剂。
[0026]
在另一个实施方案中，抗癌方法选自抗癌烷化剂、抗癌抗代谢物、抗癌抗生素、植物来源的抗癌剂、抗癌铂配位化合物、抗癌喜树碱衍生物、抗癌酪氨酸激酶抑制剂、单克隆抗体和生物反应调节剂。
[0027]
在一些实施方案中，药学有效量的藏红花酸在作为放射疗法、化疗、免疫疗法或其组合的疗法之前施用。
[0028]
在另一方面，本公开提供了用于治疗实体瘤的包含藏红花酸和至少一种药学上可接受的载体或助剂的组合物。
[0029]
在一些实施方案中，组合物为注射剂、片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、气雾剂、口服液体制剂、颗粒剂、粉剂、缓释制剂、纳米制剂、糖浆剂、酒、酊剂、洗剂、膜剂或组合的形式。
[0030]
在一些实施方案中，组合物是脂质体制剂的形式。
[0031]
在一些实施方案中，组合物通过口服、注射、植入、喷雾、吸入或其组合施用。
[0032]
在另一方面，本公开提供了一种使哺乳动物对放疗、化疗或其组合的疗法增敏的方法，包括向哺乳动物施用药学有效量的藏红花素。
[0033]
在一些实施方案中，哺乳动物是人。
附图说明
[0034]
图1示出了balb/c裸小鼠hela皮下瘤相对体积(vt/v0)随观察天数的变化曲线。
[0035]
图2示出了balb/c裸小鼠hct116皮下瘤相对体积(vt/v0)随观察天数的变化曲线。
[0036]
图3示出了balb/c裸小鼠hepg2皮下瘤相对体积(vt/v0)随观察天数的变化曲线。
[0037]
图4示出了balb/c裸小鼠c6原位胶质瘤模型动物的kaplan-meier生存曲线。
[0038]
图5示出了balb/c裸小鼠c6原位胶质瘤模型动物的kaplan-meier生存曲线。
[0039]
图6示出了balb/c裸小鼠c6原位胶质瘤模型动物的kaplan-meier生存曲线。
[0040]
图7示出了c57bl/6小鼠同源gl261原位胶质瘤模型动物的kaplan-meier生存曲线。
[0041]
图8示出了c57bl/6小鼠同源gl261原位胶质瘤模型动物的kaplan-meier生存曲线。
具体实施方式
[0042]
除非另有说明，以下术语应理解为具有以下含义：
[0043]
如本文所用，包括权利要求，单词的单数形式，例如“a”(一种、一个)、“an”(一种、一个)和“the”(该)，包括它们相应的复数参考，除非上下文另有明确规定。
[0044]
如本文所用，术语“或其组合”是指该术语之前所列项目的所有排列和组合。例如，“a、b、c或其组合”旨在包括以下各项中的至少一项：a、b、c、ab、ac、bc或abc，如果顺序在特定上下文中很重要，则ba、ca、cb、cba、bca、acb、bac或cab。继续该示例，明确包括包含一个或多个项目或术语的重复的组合，例如bb、aaa、ab、bbc、aaabcccc、cbbaaa、cababb等。技术人员将理解，除非从上下文中另外明显看出，否则通常对任何组合中的项目或术语的数量没有限制。
[0045]
如本文所用，术语“癌症”是指由已失去对正常生长控制的易感性的细胞增殖引起或表征的增殖性疾病。本技术中使用的术语“癌症”包括肿瘤和任何其他增殖性疾病。同一组织类型的癌症起源于同一组织，可根据其生物学特征分为不同的亚型。癌症可以选自例如胶质母细胞瘤、鳞状细胞癌、皮肤癌相关肿瘤、乳腺癌、头颈癌、妇科癌症、泌尿和男性生殖器癌、膀胱癌、前列腺癌、骨癌、内分泌腺癌、消化道癌、主要消化道/器官癌、中枢神经系统癌和肺癌。
[0046]
胶质母细胞瘤，也称为多形性胶质母细胞瘤，可能由弥漫性星形细胞瘤或间变性星形细胞瘤发展而来，但更常见的是新发的，没有恶性程度较低的证据的前体。在组织学上，这种肿瘤是一种间变性细胞胶质瘤，由分化差的、通常是多形性的星形细胞肿瘤细胞组成，具有明显的核异型性和活跃的有丝分裂活动。胶质母细胞瘤主要影响大脑半球。例如，中枢神经系统肿瘤与改变的癌基因、改变的肿瘤抑制基因和染色体异常的特征模式相关。
[0047]
皮肤癌相关肿瘤包括鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、恶性黑色素瘤、默克尔细胞皮肤癌和非黑色素瘤皮肤癌。头颈癌包括例如喉癌、下咽癌、鼻咽癌、口咽癌、唇癌和口腔癌以及鳞状细胞癌。淋巴瘤包括例如aids相关淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金病和中枢神经系统淋巴瘤。
[0048]
乳腺癌的实例包括但不限于浸润性导管癌、浸润性小叶癌、原位导管癌和原位小叶癌。呼吸道癌症的实例包括但不限于小细胞和非小细胞肺癌，以及支气管腺瘤和胸膜肺母细胞瘤。
[0049]
泌尿和男性生殖器癌症的实例包括但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌、尿道癌、睾丸癌和人乳头状肾癌。
[0050]
妇科癌症的例子包括但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌，以及子宫肉瘤。
[0051]
内分泌腺癌可以通过参考它们产生的激素来命名，例如，胃泌素瘤(产生胃泌素)、胰岛素瘤(产生胰岛素)、生长抑素瘤(产生生长抑素)、vipomas(产生vip)和胰高血糖素瘤(产生胰高血糖素)
[0052]
消化道癌症的实例包括但不限于肛门癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、胆囊癌、胃癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌和唾液腺癌。
[0053]
肺癌的实例包括但不限于小细胞肺癌和非小细胞肺癌，包括鳞状细胞肺癌、腺癌和大细胞肺癌。
[0054]
这些疾病已在人类中得到很好的表征，但在其他哺乳动物中也存在类似的病因，并且可以通过施用本文公开的药物组合物来治疗。
[0055]
如本文所用，术语“增敏”、“增敏作用”或“增敏剂”是指癌症样品或哺乳动物对治疗有反应的敏感性增加或抗性降低。根据用于特定治疗的本领域已知方法和下文描述的方法，包括例如细胞增殖测定(tanigawa n、kem dh、kikasa y、morton dl，cancer res，42：2159-2164(1982))，细胞死亡分析(weisenthal lm，shoemaker rh，marsden ja，dill pl，baker ja，moran em，cancer res，94：161-173(1984)；weisenthal lm，lippman me，cancer treat rep，69：615-632(1985)；weisenthal lm，in：kaspers gjl，pieters r，twentyman pr，weisenthal lm，veerman ajp，eds.白血病和淋巴瘤的耐药性.langhorne，pa：harwood academic publishers，415-432(1993)；weisenthal lm，contrib gynecol obstet，19：82-90(1984)。也可以通过测量一段时间内肿瘤大小的减小来测量动物的敏感性或抗性，例如，人为6个月，小鼠为4-6周。如果治疗敏感性的增加或抗性的降低为25％或更多，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％或与不存在此类组合物或方法时的治疗敏感性或抗性相比，高至2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多。对治疗性治疗的敏感性或抗性的确定在本领域中是常规的并且在普通技术临床医生的技能范围内。
[0056]
如本文所用，“癌症治疗增敏剂”是指可以使癌症治疗敏化的化合物或包含至少一种化合物的组合物。例如，它是指含有有效量的至少一种化合物和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或其组合的化合物或组合物。例如，可以在癌症治疗之前、期间或之前施用上述化合物或组合物以改善或增强一种或多种治疗活性组合物对有需要的个体的癌症或肿瘤的作用，然后实现消除、抑制、改善、安慰或预防癌症及其症状的目标；延缓、禁止、逆转肿瘤增殖的速度；或类似上述目的的医疗效果。
[0057]
如本文所用，术语“化学疗法”是指使用化学试剂来破坏癌细胞。示例性化疗剂包括但不限于放线菌素d、阿霉素、阿曲胺、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、cpt-11、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、柔红霉素、表柔比星依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、磷酰胺、伊立替康、多柔比星脂质体、洛莫司汀、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、丙卡巴肼、紫杉醇硫代甲氧苄啶、紫杉醇甲硫脲、紫杉醇硫代甲氧苄啶，tomudex，topotecan，treosulfan，uft(uracil-tegufur)，长春碱，长春新碱，长春地辛和长春瑞滨。化疗可以单独使用或联合使用来治疗某些类型的癌症。有时它可以与其他类型的治疗一起使用，例如手术、放疗、免疫治疗或它们的组合。
[0058]
如本文所用，“放疗”，也称为“放射疗法”，是指用电离辐射治疗癌症和其他疾病。电离辐射沉积能量，通过破坏细胞的遗传物质来伤害或破坏被治疗区域(即“目标组织”)的
细胞，使这些细胞无法继续生长。虽然辐射会损害癌细胞和正常细胞，但正常细胞能够自我修复并正常运作。放疗可用于治疗局部实体瘤，例如皮肤癌、舌癌、喉癌、脑癌、乳腺癌或子宫颈癌。它还可以用于治疗白血病和淋巴瘤(分别是造血细胞和淋巴系统的癌症)。示例性放射治疗可以选自电磁波的形式，例如x射线或伽马射线，或者带电粒子或中性粒子。放射疗法可以通过外照射、间质植入物或其组合来实施。在4-7周内对大多数肿瘤进行60-70gy的放疗疗程。
[0059]
本文公开的放疗和化疗增敏剂是可以在放疗和化疗之前或同时使用以增强放疗和化疗对肿瘤的作用的药物化合物或组合物。
[0060]
如本文所用，术语“施用”或“施药”是指通过任何方式将化合物或组合物(例如，治疗剂)引入哺乳动物体内以预防或治疗疾病或病症(例如，癌症)。
[0061]
如本文所用，本文所用的术语“治疗”，“疗法”和“治疗性治疗”是指治愈性疗法或预防性疗法。这些术语还描述了为对抗疾病或相关病症而管理和护理哺乳动物，并且包括施用组合物以减轻疾病或病症的症状、副作用或其他并发症。癌症的治疗包括例如手术、化学疗法、放射疗法、基因疗法和免疫疗法。
[0062]
如本文所用，术语“哺乳动物”是指人或其他动物，例如农场动物或实验室动物(例如豚鼠或小鼠)。在一些实施方案中，哺乳动物是人。可以是已被诊断为需要治疗本文公开的疾病或病症的人。
[0063]“药学有效量”包括足以改善或预防医学状况的症状或体征的量。特定患者或兽医受试者的有效量可根据多种因素而变化，例如所治疗的病症、患者的整体健康、给药的方法途径和剂量以及副作用的严重程度。药学有效量可以是避免显着副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。该效果将导致诊断量度或参数改善至少5％，例如至少10％，进一步例如至少20％，进一步例如至少30％，进一步例如至少40％，进一步例如至少50％，进一步例如至少60％，进一步例如至少70％，进一步例如至少80％，甚至进一步例如至少90％，其中100％定义为正常受试者显示的诊断参数。藏红花素的药学有效量是例如足以在癌症治疗之前、期间或之后减小肿瘤体积、抑制肿瘤生长或预防或减少转移的量。
[0064]
术语“药学上可接受的”是指那些适合与人或动物组织接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，有合理的收益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0065]
本文公开的药物组合物可以是常规片剂基质，例如乳糖、蔗糖和玉米淀粉与粘合剂，例如阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶，旨在帮助给药后片剂分解和溶解的崩解剂，例如马铃薯淀粉、海藻酸、玉米淀粉和瓜尔胶、黄蓍胶、阿拉伯胶，旨在改善片剂制粒流动并防止片剂材料粘附到片剂模具和冲头表面的润滑剂，例如滑石，硬脂酸，或硬脂酸镁、钙或锌、染料、着色剂和调味剂(如薄荷、冬青油或樱桃调味剂)，旨在增强片剂的美观品质并使患者更容易接受它们。
[0066]
用于口服液体剂型的合适赋形剂包括例如磷酸二钙和稀释剂例如水和醇，例如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇，添加或不添加药学上可接受的表面活性剂、悬浮剂或乳化剂。各种其他材料可以作为包衣存在或以其他方式改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以涂有虫胶、糖或两者。可分散粉剂和颗粒剂适用于制备水悬浮液。它们提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂
的例子是上面已经提到的那些。也可以存在另外的赋形剂，例如上述那些甜味剂、调味剂和着色剂。
[0067]
本文公开的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油，例如液体石蜡或植物油的混合物。合适的乳化剂可以例如选自(1)天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶和黄蓍胶，(2)天然存在的磷脂，例如大豆和卵磷脂，(3)衍生自脂肪的酯或偏酯酸和己糖醇酐，例如脱水山梨糖醇单油酸酯，(4)偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。乳液还可包含例如甜味剂和调味剂。
[0068]
油性混悬剂可通过将活性成分悬浮在植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油或矿物油如液体石蜡中来配制。油性悬浮液可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。悬浮液还可含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯；一种或多种着色剂；一种或多种调味剂；和一种或多种甜味剂，如蔗糖或糖精。
[0069]
糖浆和酏剂可以与甜味剂一起配制，例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖。此类制剂还可包含例如至少一种选自缓和剂、防腐剂如对羟基苯甲酸甲酯和丙酯以及调味剂和着色剂的实体。
[0070]
本文公开的组合也可以肠胃外给药，即皮下、静脉内、眼内、肌内或腹膜内给药，作为藏红花酸的可注射剂量，例如在生理学上可接受的稀释剂中，药用载体可以是无菌液体或液体的混合物，例如水、盐水、葡萄糖水溶液和相关糖溶液、酒精(例如乙醇、异丙醇或十六醇)、二醇(例如丙二醇或聚乙二醇)、甘油缩酮(例如2，2-二甲基-1，1)-二氧戊环-4-甲醇、醚如聚乙二醇)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或脂肪酸甘油酯或乙酰化脂肪酸甘油酯，添加或不添加药学上可接受的表面活性剂如肥皂或洗涤剂，悬浮剂如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素，或乳化剂和其他药物药物佐剂。
[0071]
可用于本文公开的肠胃外制剂的油的示例是石油、动物、植物或合成来源的油，选自例如花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、凡士林和矿物油。合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸、异硬脂酸和肉豆蔻酸。合适的脂肪酸酯是例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。合适的皂包括脂肪酸碱金属盐、铵盐和三乙醇胺盐，合适的洗涤剂包括阳离子洗涤剂，例如二甲基二烷基卤化铵、烷基吡啶鎓卤化物和烷基胺乙酸盐；阴离子洗涤剂，例如烷基、芳基和烯烃磺酸盐，烷基、烯烃、醚和单甘油酯硫酸盐，以及磺基琥珀酸盐；非离子洗涤剂，例如脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚(氧乙烯-氧丙烯)或环氧乙烷或环氧丙烷共聚物；和两性洗涤剂，例如烷基-β-氨基丙酸酯和2-烷基咪唑啉季铵盐，以及混合物。
[0072]
肠胃外制剂中使用的表面活性剂的例子是聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯类，例如脱水山梨糖醇单油酸酯和通过环氧丙烷与丙二醇缩合形成的环氧乙烷与疏水性碱的高分子量加合物。
[0073]
本文公开的药物组合物可以是无菌可注射水性悬浮液的形式。此类悬浮液可根据已知方法使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七烷-乙氧基十六醇，环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，用于例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。
[0074]
本文公开的无菌注射制剂也可以是例如在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液。可以使用的稀释剂和溶剂是例如水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和等渗葡萄糖溶液。此外，无菌不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，油酸等脂肪酸可用于制备注射剂。
[0075]
本文公开的药物组合物也可以以栓剂的形式给药，用于药物的直肠给药。例如，这些组合物可以通过将药物与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在室温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此会在直肠中熔化以释放药物。这些材料例如选自可可脂和聚乙二醇。
[0076]
用于肠胃外给药的控释制剂包括例如本领域已知的脂质体、聚合物微球和聚合物凝胶制剂。
[0077]
可能需要或必须通过机械递送装置将本文公开的药物组合物引入患者。用于递送药剂的机械递送装置的构造和使用是本领域公知的。例如，直接向大脑给药的直接技术通常涉及将药物输送导管放置到患者的脑室系统中以绕过血脑屏障。在美国专利第5，011，472号中描述了一种这样的可植入递送系统，用于将药剂输送到身体的特定解剖区域。
[0078]
根据需要或期望，本文公开的药物组合物还可包含其他常规药学上可接受的成分，通常称为载体、稀释剂或助剂。可以使用以合适的剂型制备此类组合物的常规方法。这些成分和程序包括在以下参考文献中描述的那些：powell，m.f.等，“肠外制剂辅料概要”，pda journal of pharmaceutical science ft technology 52(5)，238-311(1998)；strickley，r.g“在美国上市的小分子治疗药物的肠胃外制剂(1999)-第1部分”pda journal of pharmaceutical science&technology 53(6)，324-349(1999)；和nema，s.等，“赋形剂及其在注射产品中的使用”pda journal of pharmaceutical science et technology，51(4)，166-171(1997)。可酌情用于配制本文公开的组合物用于其预期给药途径的常用药物成分包括例如酸化剂(实例包括但不限于乙酸、柠檬酸、富马酸、盐酸，和硝酸)；碱化剂(实例包括但不限于氨溶液、碳酸铵、二乙醇胺、单乙醇胺、氢氧化钾、硼酸钠、碳酸钠、氢氧化钠和三乙醇胺、三乙醇胺)；吸附剂(实例包括但不限于粉状纤维素和活性炭)；气溶胶推进剂(示例包括但不限于二氧化碳、氯氟烃，例如freon-11(ccl3f)、freon-13(cclf3)和freon-114(主要是ccif2-ccif2))；空气置换剂(示例包括但不限于氮气和氩气)；抗真菌防腐剂(实例包括但不限于苯甲酸、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和苯甲酸钠)；抗微生物防腐剂(实例包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞和硫柳汞)；抗氧化剂(实例包括但不限于抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、次磷酸、硫代甘油、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、甲醛合次硫酸氢钠和焦亚硫酸钠)；粘合材料(示例包括但不限于嵌段聚合物、天然和合成橡胶、聚丙烯酸酯、聚氨酯、有机硅、聚硅氧烷和苯乙烯-丁二烯共聚物)；缓冲剂(实例包括但不限于偏磷酸钾、磷酸二钾、乙酸钠、无水柠檬酸钠和二水柠檬酸钠)；载体(例如但不限于金合欢糖浆、芳香糖浆、芳香酏剂、樱桃糖浆、可可糖浆、橙汁、糖浆、玉米油、矿物油、花生油、芝麻油、注射用抑菌氯化钠、和抑菌注射用水)；螯合剂(实例包括但不限于依地酸二钠和依地酸)；着色剂(示例包括但不限于fd&c red no.3、fd&c red no.20、fd&c yellow no.6、fd&c blue no.2、d&c green no.5、d&c orange no.5、d&c red no.8、焦糖和氧化铁红)；澄清剂(例子包括但不限
于膨润土)；乳化剂(实例包括但不限于阿拉伯胶、西托聚乙二醇、鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯50单硬脂酸酯)；包封剂(实例包括但不限于明胶和邻苯二甲酸醋酸纤维素)；食用香料(实例包括但不限于茴香油、肉桂油、可可、薄荷醇、橙油、薄荷油和香兰素)；保湿剂(实例包括但不限于甘油、丙二醇和山梨糖醇)；浮游剂(例子包括但不限于矿物油和甘油)；油(例子包括但不限于花生油、矿物油、橄榄油、花生油、芝麻油和植物油)；软膏基质(实例包括但不限于羊毛脂、亲水性软膏、聚乙二醇软膏、凡士林、亲水性凡士林、白色软膏、黄色软膏和玫瑰水软膏)；用于例如透皮递送的渗透促进剂(实例包括但不限于单羟基或多羟基醇、一元或多元醇、饱和或不饱和脂肪醇、饱和或不饱和脂肪酸酯、饱和或不饱和二羧酸、精油、磷脂酰衍生物、脑磷脂、萜烯、酰胺、醚、酮和尿素)
[0079]
增塑剂(实例包括但不限于邻苯二甲酸二乙酯和甘油)；溶剂(实例包括但不限于乙醇、玉米油、棉籽油、甘油、异丙醇、矿物油、油酸、花生油、纯净水和无菌注射用水；硬化剂(实例包括但不限于)限于，鲸蜡醇、鲸蜡酯蜡、微晶蜡、石蜡、硬脂醇、白蜡和黄蜡)；栓剂基质(实例包括但不限于可可脂和聚乙二醇)；表面活性剂(实例包括，但不限于，苯扎氯铵、壬苯醇10、氧苯醇9、聚山梨醇酯80、十二烷基硫酸钠和脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)；悬浮剂(实例包括但不限于琼脂、膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、高岭土、甲基纤维素、黄蓍胶和veegum)；甜味剂(实例包括但不限于阿斯巴甜、葡萄糖、甘油、甘露醇、丙乙二醇、糖精钠、山梨糖醇和蔗糖)；片剂抗粘剂(实例包括但不限于硬脂酸镁和滑石粉)；片剂粘合剂(实例包括但不限于阿拉伯胶、海藻酸、羧甲基纤维素钠、可压缩糖、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、甲基纤维素、非交联聚乙烯吡咯烷酮和预胶化淀粉)；片剂和胶囊稀释剂(实例包括但不限于磷酸氢钙、高岭土、乳糖、甘露醇、微晶纤维素、粉状纤维素、沉淀碳酸钙、碳酸钠、磷酸钠、山梨糖醇和淀粉)；片剂包衣剂(实例包括但不限于液体葡萄糖、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素和虫胶)；片剂直接压片赋形剂(实例包括但不限于磷酸氢钙)；片剂崩解剂(实例包括但不限于海藻酸、羧甲基纤维素钙、微晶纤维素、波拉克林钾、交联聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠、羟基乙酸淀粉钠和淀粉)；片剂助流剂(实例包括但不限于胶体二氧化硅、玉米淀粉和滑石)；片剂润滑剂(实例包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、硬脂酸和硬脂酸锌)；片剂/胶囊不透明剂(例子包括但不限于二氧化钛)；片剂抛光剂(实例包括但不限于巴西棕榈蜡和白蜡)；增稠剂(实例包括但不限于蜂蜡、鲸蜡醇和石蜡)；张力剂(例子包括但不限于葡萄糖和氯化钠)；增粘剂(实例包括但不限于海藻酸、膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠和黄蓍胶)；和润湿剂(实例包括但不限于十七亚乙基氧十六醇、卵磷脂、山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯硬脂酸酯)。
[0080]
当本文公开的增敏剂液体或凝胶为注射剂形式时，该注射剂可以使用例如注射器直接瘤内注射，或在照射时通过例如血管造影导管间接注射到肿瘤区域中。在这种情况下，可以在施用抗癌剂之前、之后或同时使用例如注射器或血管造影导管将本文公开的敏化剂液体或凝胶注射到目标肿瘤区域中。例如，可以使用具有约21号针头的注射器在超声检查引导下进行瘤内注射，同时观察敏化剂渗透到组织中的状态。敏化剂可以在超声引导下广泛输送到组织，以改变注射针的深度和方向。施用于肿瘤区域的敏化剂的剂量因肿瘤的大小和给药方法而异。
[0081]
在此使用的抗癌剂包括例如烷化剂，例如环磷酰胺、异环磷酰胺、白消安、美法仑、盐酸苯达莫司汀、盐酸尼莫司汀、雷尼莫司汀、达卡巴嗪、盐酸丙卡巴肼和替莫唑胺；抗代谢药，如甲氨蝶呤、培美曲塞钠、氟尿嘧啶、多西氟尿苷、卡培他滨、替加氟、阿糖胞苷、阿糖胞苷八磷酸水合物、依西他滨、吉西他滨盐酸盐、巯嘌呤水合物、磷酸氟达拉滨、磷酸氟达拉滨、左旋糖胺酸钾、左旋糖胺酸钾、左旋糖胺酸钙，和阿扎胞苷；抗肿瘤抗生素，如盐酸多柔比星、盐酸柔红霉素、吡柔比星、盐酸表柔比星、盐酸伊达比星、盐酸阿柔比星、盐酸氨柔比星、盐酸米托蒽醌、丝裂霉素c、放线菌素d、博来霉素、硫酸培普霉素、唑来霉素；硫酸长春新碱、硫酸长春碱、硫酸长春地辛、酒石酸长春瑞滨、紫杉醇、多西紫杉醇水合物、甲磺酸艾日布林等微管抑制剂；激素类药物，例如阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、他莫昔芬柠檬酸盐、托瑞米芬柠檬酸盐、氟维司群、氟他胺、比卡鲁胺、醋酸甲羟孕酮、雌莫司汀磷酸钠水合物和醋酸亮丙瑞林；铂类药物，如顺铂、米瑞铂水合物、卡铂、奈达铂、奥沙利铂；盐酸伊立替康水合物、盐酸诺吉替康等拓扑异构酶i抑制剂；拓扑异构酶ii抑制剂，如依托泊苷和索布唑烷；细胞因子，如干扰素γ1a、teceleukin和celmoleukin；抗体药物，如曲妥珠单抗、利妥昔单抗、吉妥珠单抗奥佐米星、贝伐单抗和西妥昔单抗；放射免疫治疗剂，如ibritumomab tiuxetan；分子靶向药物，如吉非替尼、甲磺酸伊马替尼、硼替佐米、盐酸厄洛替尼、甲苯磺酸索拉非尼、苹果酸舒尼替尼、沙利度胺、盐酸尼罗替尼水合物、达沙替尼水合物、甲苯磺酸拉帕替尼水合物、依维莫司、来那度胺水合物、地塞米他米他明、和非特异性免疫刺激剂，如ok-432、干卡介苗、云芝多糖制剂、香菇多糖和ubenimex。抗癌剂的其他实例包括乙酰格拉酮、卟啉钠、他拉泊芬钠、乙醇和三氧化二砷。
[0082]
抗癌剂的实例包括蒽环类抗癌剂，例如盐酸多柔比星、盐酸柔红霉素、吡柔比星、盐酸表柔比星、盐酸伊达比星、盐酸阿柔比星、盐酸氨柔比星和盐酸米托蒽醌；顺铂、米瑞铂水合物、卡铂、奈达铂、奥沙利铂等铂类抗癌剂；基于嘧啶抗代谢物的抗癌剂，例如氟尿嘧啶、多西氟尿苷、卡培他滨、替加氟、阿糖胞苷、阿糖胞苷八磷酸水合物、依西他滨和盐酸吉西他滨。
[0083]
本公开，通过以下实施例，已经证明藏红花素可以成功地用作例如化学疗法和/或放射疗法增敏剂，用于移植到小鼠上的各种实体瘤。它可以与放疗和/或化疗协同作用，延长荷瘤小鼠的生存期。此外，与目前处于iii期临床试验的tsc相比，藏红花素可具有以下优势：(1)藏红花素联合放化疗治疗的荷瘤小鼠的总生存期可显着长于那些用相同剂量的tsc联合放化疗治疗；(2)藏红花素不仅能增强肿瘤细胞对放疗的敏感性，还能增强肿瘤细胞对化疗的敏感性；(3)tsc与放化疗达到最大协同作用的最佳剂量为100μg/kg，随后呈剂量依赖性降低，而藏红花素与放化疗的协同作用可呈剂量依赖性增加。范围为100-400μg/kg。
[0084]
参考以下实施例可以更好地理解本公开的范围，这些实施例并非旨在将本公开限制为特定实施例。
[0085]
实施例1藏红花酸载药脂质体制剂的制备
[0086]
称取卵磷脂13mg，胆固醇5mg，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(peg-dspe2000)2mg，溶解在2ml氯仿，加入药物3mg(溶解在dmso中)，置于成膜的茄形烧瓶中减压回收氯仿有机溶剂成膜。取2ml去离子水加入茄形烧瓶中旋转水合，得到载药脂质体。
[0087]
实施例2藏红花酸联合放疗疗法对balb/c裸小鼠实体瘤模型的抑制作用
[0088]
1.实验材料
[0089]
hela人宫颈癌细胞系、hct116人结肠癌细胞系，hepg2人肝癌细胞系，(atcc)。
[0090]
藏红花酸：砖红色粉末，hplc检测纯度大于98％(绍兴天康生物科技有限公司)。
[0091]
静脉注射藏红花酸采用实施例1制备的脂质体制剂，灌胃给药藏红花酸用0.5％羧甲基纤维素钠配制成一定浓度的藏红花酸悬浊液。
[0092]
tsc：按照专利方法(us6060511)，用藏红花酸制备，hplc检测纯度大于98％。
[0093]
4-8周龄的雄性balb/c裸小鼠，由浙江省医学科学院试验动物中心提供。
[0094]
2.方法
[0095]
2.1造模
[0096]
取生长良好的hela、hct116、hepg2人瘤细胞株，用pbs悬成浓度为1x107/m1的悬液，每只balb/c裸小鼠(4-6周龄)右前肢腋下皮下接种200ul(2x106)，接种时保证每只小鼠接种部位以及接种肿瘤细胞数量一致，每个细胞株4只，共接种12只。待瘤体积增长至0.3立方厘米时，选择生长良好、无变性坏死、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织接种，接种大小约为直径2mm的瘤块，每株瘤组织分瘤接种25只。
[0097]
2.2给药干预
[0098]
接种生长2-3周，待瘤块体积达到0.25-0.35立方厘米后，各组25只小鼠随机分为5小组，
[0099]
(1).模型对照组(control)；
[0100]
(2).放疗组(rt)；
[0101]
(3).放疗 静注tsc组(rt tsc iv(100ug/kg))；
[0102]
(4).放疗 静注藏红花酸组(rt crocetin iv(100ug/kg))；
[0103]
(5).放疗 口服藏红花酸组(rt crocetin po(200ug/kg))。
[0104]
所有小鼠连续5天给药，第3天给药后30分钟内，研究组2-5进行xray辐照(rs-2000-pro-225(rad source))，单次、局部5gy。
[0105]
2.3实验观察
[0106]
所有研究组的肿瘤体积每周测量2-3次，直到肿瘤体积达到在治疗开始时体积的4倍时止。计算各组小鼠的存肿瘤体积：肿瘤体积＝0.5
×
长
×
宽2；相对瘤体积＝当天所测瘤体积(vt)/给药第一天的瘤体积(v0)x100％。
[0107]
2.4统计学方法
[0108]
数据分析采用统计程序软件包(spss 21.0 for windows)进行统计分析，绘制相对瘤体积-时间曲线，运用单因素方差分析不同测试组间的统计学差异，p＜0.05为差异具有显著性。
[0109]
3.结果
[0110]
参考图1至图3，其中，图1示出了藏红花酸或tsc联合放疗对hela皮下瘤的抑制作用；图2示出了藏红花酸或tsc联合放疗对hct116皮下瘤的抑制作用，图3示出了藏红花酸或tsc联合放疗对hepg2皮下瘤的抑制作用。与control组比较，给药或放疗结束后(5d后)其它治疗组均能有效抑制皮下瘤的增大(p＜0.05)；与rt组比较，rt联合tsc或藏红花酸，的治疗效果(6d后)均不同程度提高(p＜0.01)；与tsc rt组比较，rt联合藏红花酸(灌胃或静脉注射)的治疗效果(6d后)均优于rt联合tsc的治疗效果(p＜0.01)，综上，藏红花酸联合放疗对人瘤体外模型的抑制作用较其它治疗组具有统计学显箸的优势(p＜0.05)。
[0111]
4.结论
[0112]
上述试验证明，本发明藏红花酸能显著增强放疗对多种实体瘤生长的抑制作用，延缓皮下瘤的增长。
[0113]
实施例3藏红花酸联合替莫唑胺对balb/c裸小鼠c6原位胶质瘤模型的抑制作用
[0114]
1.实验材料
[0115]
c6胶质瘤细胞株(atcc)。
[0116]
藏红花酸：砖红色粉末，hplc检测纯度大于98％(绍兴天康生物科技有限公司)。
[0117]
静脉注射藏红花酸采用实施例1制备的脂质体制剂，灌胃给药藏红花酸用0.5％羧甲基纤维素钠配制成一定浓度的藏红花酸悬浊液。
[0118]
tsc：按照专利方法(us6060511)，用藏红花酸制备，hplc检测纯度大于98％。
[0119]
替莫唑胺，纯度大于99％(广州糖姆氏生命科技有限公司)。
[0120]
4-8周龄的雄性balb/c裸小鼠，由浙江省医学科学院试验动物中心提供。
[0121]
2.方法
[0122]
2.1造模
[0123]
取生长良好的c6胶质瘤细胞株，用pbs悬成浓度为2x106/10ul悬液，每只小鼠颅内接种2.5ul(5x105个细胞)，接种时保证每只小鼠接种部位以及接种肿瘤细胞数量一致，共接种50只。
[0124]
2.2给药干预
[0125]
接种7天后，50只小鼠随机分为6组，每组8-9只；
[0126]
(1).模型对照组(control)；
[0127]
(2).替莫唑胺组(tmz)；；
[0128]
(3).替莫唑胺 静注tsc组(tmz tsc(100ug/kg))；
[0129]
(4).替莫唑胺 静注藏红花酸组(tmz crocetin(100ug/kg))；
[0130]
(5).静注tsc组(tsc(100ug/kg))；
[0131]
(6)静注藏红花酸组(crocetin(100ug/kg))。
[0132]
所有小鼠从10-14天，连续5天先静脉注射tsc、藏红花酸或生理盐水(对照)，20分钟后，再替莫唑胺进行腹腔注射给药(50mg/kg，149mg/m2)。
[0133]
2.3实验观察
[0134]
每日观察小鼠的自主活动、精神状态、毛发、呼吸、饮食、粪便性状及对外界刺激的反应，连续称量生存期间各组小鼠体重，记录全部给药期间各组小鼠的生存期，计算各组小鼠的存活率：存活率＝(各组剩余动物数量/各组动物总数)。
[0135]
2.4统计学方法
[0136]
数据分析采用统计程序软件包(spss 21.0 for windows)进行统计分析，运用kaplan-meier法绘制生存曲线，对数秩检验(log rank(mantel-cox))用于确定不同测试组存活分布间的差异，p＜0.05为差异具有显著性。
[0137]
3.结果
[0138]
图4示出了各组小鼠的生存期随观察天数的变化曲线和各组小鼠生存曲线之间的统计方差；替莫唑胺能明显延长原位种植肿瘤裸鼠的生存期，藏红花酸能更进一步延长替莫唑胺对原位种植肿瘤裸鼠的生存期(p＜0.01)，而tsc无此延长作用。单独静注tsc或藏红
花酸不能延长原位种植肿瘤裸鼠的生存期。
[0139]
4.结论
[0140]
上述试验证明，本发明藏红花酸能显著增强替莫唑胺对balb/c裸小鼠c6原位胶质瘤模型的抑制作用，延长原位种植肿瘤裸鼠的生存期。
[0141]
实施例4藏红花酸联合放疗和替莫唑胺对balb/c裸小鼠c6原位胶质瘤模型的抑制作用
[0142]
1.实验材料
[0143]
c6胶质瘤细胞株(atcc)。
[0144]
藏红花酸：砖红色粉末，hplc检测纯度大于98％(绍兴天康生物科技有限公司)。
[0145]
静脉注射藏红花酸采用实施例1制备的脂质体制剂，灌胃给药藏红花酸用0.5％羧甲基纤维素钠配制成一定浓度的藏红花酸悬浊液。
[0146]
tsc：按照专利方法(us6060511)，用藏红花酸制备，hplc检测纯度大于98％。
[0147]
替莫唑胺，纯度大于99％(广州糖姆氏生命科技有限公司)。
[0148]
4-8周龄的雄性balb/c裸小鼠，由浙江省医学科学院试验动物中心提供。
[0149]
2.方法
[0150]
2.1造模
[0151]
取生长良好的c6胶质瘤细胞株，用pbs悬成浓度为2x106/10ul悬液，每只小鼠颅内接种2.5ul(5x105)，接种时保证每只小鼠接种部位以及接种肿瘤细胞数量一致，共接种50只。
[0152]
2.2给药干预
[0153]
接种7天后，50只小鼠随机分为6组，每组8-9只；
[0154]
(1).模型对照组(control)；
[0155]
(2).替莫唑胺 放疗组(tmz rt)；
[0156]
(3).替莫唑胺 放疗 静注tsc组(tmz rt tsc(100ug/kg))；
[0157]
(4).替莫唑胺 放疗 静注藏红花酸组(tmz rt tk10iv(100ug/kg))；
[0158]
(5).替莫唑胺 放疗 静注藏红花酸组(tmz rt tk10iv(200ug/kg))；
[0159]
(6)替莫唑胺 放疗 口服藏红花酸组(tmz rt tk10po(200ug/kg)。
[0160]
所有小鼠从7-11天，连续5天静脉注射tsc、藏红花酸或生理盐水(对照)，给药20分钟后替莫唑胺进行腹腔注射给药(50mg/kg，149mg/m2)。第5天给药后30分钟内，组2-6的小鼠接受8gy照射(rs-2000-pro-225(rad source))。
[0161]
(3)实验观察
[0162]
每日观察小鼠的自主活动、精神状态、毛发、呼吸、饮食、粪便性状及对外界刺激的反应，连续称量生存期间各组小鼠体重，记录全部给药期间各组小鼠的生存期，计算各组小鼠的存活率：存活率＝(各组剩余动物数量/各组动物总数)。
[0163]
(4)统计学方法
[0164]
数据分析采用统计程序软件包(spss 21.0 for windows)进行统计分析，运用kaplan-meier法绘制生存曲线，对数秩检验(log rank(mantel-cox))用于确定不同测试组存活分布间的差异，p＜0.05为差异具有显著性。
[0165]
3.结果
[0166]
图5示出了各组小鼠的生存期随观察天数的变化曲线和各组小鼠生存曲线之间的统计方差；替莫唑胺 放疗能明显延长原位种植肿瘤裸鼠的生存期，tsc和藏红花酸能更进一步明显提升替莫唑胺 放疗对原位种植肿瘤裸鼠生存期的延长(p＜0.01)。
[0167]
4.结论
[0168]
上述试验证明，本发明藏红花酸能增强放疗和替莫唑胺对balb/c裸小鼠c6原位胶质瘤模型的抑制作用，延长原位种植肿瘤裸鼠的生存期。
[0169]
实施例5连续两个疗程藏红花酸联合放疗和替莫唑胺对balb/c裸小鼠c6原位胶质瘤模型的抑制作用
[0170]
1.实验材料
[0171]
c6胶质瘤细胞株(atcc)。
[0172]
藏红花酸：砖红色粉末，hplc检测纯度大于98％(绍兴天康生物科技有限公司)。
[0173]
静脉注射藏红花酸采用实施例1制备的脂质体制剂，灌胃给药藏红花酸用0.5％羧甲基纤维素钠配制成一定浓度的藏红花酸悬浊液。
[0174]
tsc：按照专利方法(us6060511)，用藏红花酸制备，hplc检测纯度大于98％。
[0175]
替莫唑胺，纯度大于99％(广州糖姆氏生命科技有限公司)。
[0176]
4-8周龄的雄性balb/c裸小鼠，由浙江省医学科学院试验动物中心提供。
[0177]
2.方法
[0178]
2.1造模
[0179]
取生长良好的c6胶质瘤细胞株，用pbs悬成浓度为2x106/10ul悬液，每只小鼠颅内接种2.5ul(5x105)，接种时保证每只小鼠接种部位以及接种肿瘤细胞数量一致。
[0180]
2.2给药干预
[0181]
接种6天后，41只小鼠随机分为5组，每组8-9只；
[0182]
(1).模型对照组(control)
[0183]
(2).替莫唑胺 放疗组(tmz rt)；
[0184]
(3).替莫唑胺 放疗 静注tsc组(tmz rt tsc(100ug/kg))；
[0185]
(4).替莫唑胺 放疗 静注藏红花酸组(tmz rt tk10iv(100ug/kg))；
[0186]
(5)替莫唑胺 放疗 口服藏红花酸组(tmz rt tk10po(200ug/kg))。
[0187]
第一阶段给药：所有小鼠从7-11天，连续5天先静脉注射tsc、藏红花酸或生理盐水(对照)，20分钟后，再替莫唑胺进行腹腔注射给药(50mg/kg，149mg/m2)。第5天给药后30分钟内，组2-6的小鼠接受局部8gy照射(rs-2000-pro-225(rad source))。
[0188]
第二阶段给药：所有小鼠从16-20天，连续5天先静脉注射tsc、藏红花酸或生理盐水(对照)，20分钟后，再替莫唑胺进行腹腔注射给药(50mg/kg，149mg/m2)。
[0189]
2.3实验观察
[0190]
每日观察小鼠的自主活动、精神状态、毛发、呼吸、饮食、粪便性状及对外界刺激的反应，连续称量生存期间各组小鼠体重，记录全部给药期间各组小鼠的生存期，计算各组小鼠的存活率：存活率＝(各组剩余动物数量/各组动物总数)。
[0191]
2.4统计学方法
[0192]
数据分析采用统计程序软件包(spss 21.0 for windows)进行统计分析，运用kaplan-meier法绘制生存曲线，对数秩检验(log rank(mantel-cox))用于确定不同测试组
存活分布间的差异，p＜0.05为差异具有显著性。
[0193]
3.结果
[0194]
图6出示了各组小鼠的生存期随观察天数的变化曲线和各组小鼠生存曲线之间的统计方差；替莫唑胺 放疗能明显延长原位种植肿瘤裸鼠的生存期，连续两个疗程的tsc和藏红花酸能更进一步显著提升替莫唑胺 放疗对原位种植肿瘤裸鼠的生存期(p＜0.01)，且藏红花酸较tsc的提升效果更显著(p＜0.05)。
[0195]
4.结论
[0196]
上述试验证明，本发明藏红花酸能显著增强放疗疗法和替莫唑胺对balb/c裸小鼠c6原位胶质瘤模型的抑制作用，延长原位种植肿瘤裸鼠的生存期。
[0197]
实施例6藏红花酸联合放疗和替莫唑胺对c57bl/6小鼠同源gl261原位胶质瘤模型的抑制作用
[0198]
1.实验材料
[0199]
gl261胶质瘤细胞株(atcc)。
[0200]
藏红花酸：砖红色粉末，hplc检测纯度大于98％(绍兴天康生物科技有限公司)。
[0201]
静脉注射藏红花酸采用实施例1制备的脂质体制剂，灌胃给药藏红花酸用0.5％羧甲基纤维素钠配制成一定浓度的藏红花酸悬浊液。
[0202]
tsc：按照专利方法(us6060511)，用藏红花酸制备，hplc检测纯度大于98％。
[0203]
替莫唑胺，纯度大于99％(广州糖姆氏生命科技有限公司)。
[0204]
4-8周龄的雄性c57bl/6小鼠，由浙江省医学科学院试验动物中心提供。
[0205]
2.方法
[0206]
2.1造模
[0207]
取生长良好的gl261胶质瘤细胞株，用pbs悬成浓度为1x106/10ul悬液，每只小鼠颅内接种2ul(2x105)，接种时保证每只小鼠接种部位以及接种肿瘤细胞数量一致，共接种49只。
[0208]
2.2给药干预
[0209]
接种9天后，49只小鼠随机分为7组，每组5-8只；
[0210]
(1).模型对照组(control)；
[0211]
(2).替莫唑胺 放疗组(tmz rt)；
[0212]
(3).替莫唑胺 放疗 静注tsc组(tmz rt tsc(100ug/kg))；
[0213]
(4).替莫唑胺 放疗 静注藏红花酸组(tmz rt tk10iv(100ug/kg))；
[0214]
(5).替莫唑胺 放疗 静注藏红花酸组(tmz rt tk10iv(300ug/kg))；
[0215]
(6).替莫唑胺 放疗 口服藏红花酸组(tmz rt tk10po(200ug/kg))。
[0216]
所有小鼠从9-11天，连续3天给药：第9天静脉注射tsc、藏红花酸或生理盐水(对照)；第10天先静脉注射tsc、藏红花酸或生理盐水，20分钟后，再替莫唑胺进行腹腔注射给药(100mg/kg，298.5mg/m2)；第11天先静脉注射tsc、藏红花酸或生理盐水后，30分钟内，组2-7的小鼠接受局部5gy照射(rs-2000-pro-225(rad source))。
[0217]
2.3实验观察
[0218]
每日观察小鼠的自主活动、精神状态、毛发、呼吸、饮食、粪便性状及对外界刺激的反应，连续称量生存期间各组小鼠体重，记录全部给药期间各组小鼠的生存期，计算各组小
鼠的存活率：存活率＝(各组剩余动物数量/各组动物总数)。
[0219]
2.4统计学方法
[0220]
数据分析采用统计程序软件包(spss 21.0 for windows)进行统计分析，运用kaplan-meier法绘制生存曲线，对数秩检验(log rank(mantel-cox))用于确定不同测试组存活分布间的差异，p＜0.05为差异具有显著性。
[0221]
3.结果
[0222]
图7示出了各组小鼠的kaplan-meier生存曲线和各组小鼠生存曲线之间的统计学参数；与control组比较，其它治疗组均能有效延长原位胶质瘤小黑鼠的生存期(p＜0.05)，生存中位数从25天延长到36天以上；与tmz rt组比较，联合tsc或藏红花酸后，tmz rt的治疗效果均不同程度提高(p＜0.05)，生存中位数从36天提高到45天以上；与tsc tmz rt组比较，联合藏红花酸(灌胃或静脉注射)的治疗效果均优于联合tsc的治疗效果(p＜0.05)，生存中位数从45天延长到47天以上，综上，crocetin tmz rt组合治疗的动物较其它治疗组具有统计学显着的生存优势(p＜0.05)。
[0223]
4.结论
[0224]
上述试验证明，本发明藏红花酸能显著增强放疗和替莫唑胺对c57bl/6小黑鼠gl261原位胶质瘤模型的抑制作用，延长原位种植肿瘤裸鼠的生存期。
[0225]
实施例7藏红花酸联合放疗和替莫唑胺对c57bl/6小鼠同源gl261原位胶质瘤模型的剂量依赖性抑制作用
[0226]
1.实验材料
[0227]
gl261胶质瘤细胞株(atcc)。
[0228]
藏红花酸：砖红色粉末，hplc检测纯度大于98％(绍兴天康生物科技有限公司)。
[0229]
静脉注射藏红花酸采用实施例1制备的脂质体制剂，灌胃给药藏红花酸用0.5％羧甲基纤维素钠配制成一定浓度的藏红花酸悬浊液。
[0230]
tsc：按照专利方法(us6060511)，用藏红花酸制备，hplc检测纯度大于98％。
[0231]
替莫唑胺，纯度大于99％(广州糖姆氏生命科技有限公司)。
[0232]
4-8周龄的雄性c57bl/6小鼠，由浙江省医学科学院试验动物中心提供。
[0233]
2.方法
[0234]
2.1造模
[0235]
取生长良好的gl261胶质瘤细胞株，用pbs悬成浓度为1x106/10ul悬液，每只小鼠颅内接种2ul(2x105)，接种时保证每只小鼠接种部位以及接种肿瘤细胞数量一致。
[0236]
2.2给药干预
[0237]
接种11天后，42只小鼠随机分为5组，每组8-9只；
[0238]
(1).模型对照组(control)；
[0239]
(2).替莫唑胺 放疗组(tmz rt)；
[0240]
(3).替莫唑胺 放疗 静注藏红花酸组(tmz rt crocetin iv(100ug/kg))；
[0241]
(4).替莫唑胺 放疗 静注藏红花酸组(tmz rt crocetin iv(200ug/kg))；
[0242]
(5).替莫唑胺 放疗 静注藏红花酸组(tmz rt crocetin iv(400ug/kg))；
[0243]
所有小鼠从11-13天，连续3天给药：第11天静脉注射藏红花酸或生理盐水(对照)；第12天先静脉注射藏红花酸或生理盐水，20分钟后，再替莫唑胺进行腹腔注射给药(100mg/
kg，298.5mg/m2)；第13天先静脉注射藏红花酸或生理盐水后，30分钟内，组2-5的小鼠接受局部5gy照射(rs-2000-pro-225(rad source))。
[0244]
2.3实验观察
[0245]
每日观察小鼠的自主活动、精神状态、毛发、呼吸、饮食、粪便性状及对外界刺激的反应，连续称量生存期间各组小鼠体重，记录全部给药期间各组小鼠的生存期，计算各组小鼠的存活率：存活率＝(各组剩余动物数量/各组动物总数)。
[0246]
2.4统计学方法
[0247]
数据分析采用统计程序软件包(spss 21.0 for windows)进行统计分析，运用kaplan-meier法绘制生存曲线，对数秩检验(log rank(mantel-cox))用于确定不同测试组存活分布间的差异，p＜0.05为差异具有显著性。
[0248]
3.结果
[0249]
图8示出了各组小鼠的kaplan-meier生存曲线和各组小鼠生存曲线之间的统计学参数；与control组比较，其它治疗组均能有效延长原位胶质瘤小黑鼠的生存期(p＜0.01)，生存中位数从24天延长到35天以上；与tmz rt组比较，联合藏红花酸后，tmz rt的治疗效果均不同程度提高(p＜0.01)，生存中位数从35天提高到44天以上；且3组不同浓度的藏红花酸联合tmz rt组间存在显著差异(p＜0.05)，表现为藏红花酸剂量越高，生存中位数越长，从44到49天；综上，crocetin tmz rt组合治疗的动物较其它治疗组具有统计学显着的生存优势(p＜0.01)，且藏红花酸能剂量依赖性的延长tmz rt组合治疗的动物生存期。
[0250]
4.结论
[0251]
上述试验证明，本发明藏红花酸能显著增强放疗和替莫唑胺对c57bl/6小黑鼠gl261原位胶质瘤模型的抑制作用，延长原位种植肿瘤裸鼠的生存期。