一种同时分析利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链的色谱方法与流程

一种同时分析利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链的色谱方法
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，属于质量标准的建立和检测方法开发，涉及一种同时分析利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链的色谱方法。


背景技术：

2.糖尿病是一种高发病，全球性的发病都在不断升高，据全球卫生组织公布数据显示：2000年发病人数为1.75亿，2010年发病人数为2.39亿，预计2025年将突破3亿,到2035年发病人数将接近6亿，全球糖尿病发病率正在迅速增长，中国糖尿病人数占据世界的1/4，患病率已高达11.6％，位居世界首位。糖尿病涉及人体各个生命系统，严重影响人们的劳动生活，并威胁人类的生命安全。
3.利拉鲁肽是一种与肠道细胞分泌的肠促胰岛素激素肽类似物，具有高度同源性，因而几乎具备内源物所拥有的全部生理功能，可以用于治疗糖尿病及其对心血管并发症，是一种由丹麦诺和诺德公司开发的一个长效胰高血糖素样肽-1类似物,作为新一代以肠促胰岛素为基础的降血糖药物，可安全有效降糖并可能对多种心血管危害因素起保护作用。利拉鲁肽注射剂经皮下注射给药，每日注射一次，提供24h的血糖控制，其药代动力学特性不受性别或年龄影响，利拉鲁肽绝对是2型糖尿病治疗领域革命性药物。与二甲双胍或磺脲类药物相比具有很好的疗效，而且副作用小，不产生免疫反应等优点，利拉鲁肽的序列为h2n-his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-cooh，在26位的lys上连有一个棕榈酸和一个谷氨酸。市场上对于利拉鲁肽的需求量大,合成方法较多。基因工程的方法技术难度大，易产生副产物以及其他杂质，但来源稳定，产率大，生物活性高，所以采用发酵的方式生产，然后对产物进行结构修饰是比较好的选择，从而对利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链的检测方法也提出更高的要求。
4.在得到利拉鲁肽的过程中，boc-利拉鲁肽主链是重要中间产物，对其含量检测和控制是必不可少的过程，boc-利拉鲁肽主链其序列为h2n-his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-cooh，在26位的lys上有一个bochn-保护基团，为下一步结构修饰做好准备，所以有必要对现有技术中的利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链建立分析方法，以解决上述问题。


技术实现要素：

5.本发明针对以上技术上的需要，公开了一种同时分析利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链的色谱方法，目的在于提供一种稳定性好、重现性好、灵敏度高、操作简单、准确快速，用于利拉鲁肽质量控制方法。
6.本发明提供了一种同时分析利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链的rp-hplc色谱方法，其特征在于，将含有利拉鲁肽及boc-利拉鲁肽主链的样品溶液注入高效液相色谱仪，并
采用如下高效液相色谱条件进行检测；
7.键合硅胶色谱柱；
8.流动相：流动相a为0.05mol/ml-0.15mol/ml磷酸二氢铵水溶液，
9.流动相b为乙腈；
10.其中，流动相b体积占比为15％
→
95％进行梯度洗脱。
11.在另一优选例中，流动相a为0.1mol/ml磷酸二氢铵水溶液。
12.在另一优选例中，所述流动相b体积占比为25％
→
90％。
13.在另一优选例中，所述键合基团选自：c8、c18。
14.在另一优选例中，所述的键合硅胶色谱柱为辛烷基键合硅胶c8柱(4.6
×
250mm)。
15.在另一优选例中，所述色谱条件还包括：
16.进样体积：10-100μl。
17.在另一优选例中，进样体积为20-60μl，较佳地50μl。
18.在另一优选例中，所述色谱条件还包括：
19.检测波长：210-230nm；
20.流速：0.5-1.0ml/min；
21.柱温：30-40℃。
22.在另一优选例中，流动相a磷酸二氢铵水溶液的ph为3.5-4.0。
23.在另一优选例中，所述流动相a磷酸二氢铵水溶液的ph为3.7。
24.在另一优选例中，所述的方法为定量、定性和/或杂质检测方法。
25.在另一优选例中，所述的方法非体外和/或辅助性方法。
26.在另一优选例中，所述的方法为非诊断性方法。
27.在另一优选例中，所述的含有利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链的样品溶液是通过如下步骤制备的：
28.(s1)重组菌发酵得到菌体，
29.(s2)对所述菌体进行破碎、离心、溶解得到大分子蛋白，
30.(s3)加入蛋白酶进行切割所述大分子蛋白，得到boc-利拉鲁肽主链，
31.(s4)对所述boc-利拉鲁肽主链进行化学修饰，得到含有利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链的样品溶液。
32.在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
33.(s5)标准溶液的制备：将已知浓度的利拉鲁肽标准品溶液和经过纯化得到的boc-利拉鲁肽主链溶液混合，得到已知浓度的标准品溶液。
34.在另一优选例中，所述步骤(s5)中，利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链标准物质纯度都在98％以上。
35.在另一优选例中，所述步骤(s5)中，利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链标准品溶液浓度分别为0.8mg/ml，0.5mg/ml。
36.在另一优选例中，样品溶液的进样浓度为0.05～1.5mg/ml。
37.在另一优选例中，所述梯度洗脱，洗脱时间及流动相b体积占比为0～20min从25％
→
60％，20～35min从60％
→
90％，35～40min再从90％
→
25％，然后25％运行至10min。
38.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具
体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
39.图1为boc-利拉鲁肽主链的标准曲线。
40.图2为利拉鲁肽的标准曲线。
41.图3为利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链标准品的hplc色谱图。
42.图4为利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链样品溶液的hplc色谱图。
43.图5为流动相a为0.05％三氟乙酸水溶液的利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链样品溶液hplc色谱图。
44.图6为流动相a为0.5％磷酸水溶液的利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链样品溶液hplc色谱图。
具体实施方式
45.本发明人经过广泛而深入地研究，发现了一种同时分析利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链的色谱方法。该分析方法具有分析速度快、准确、简便、快捷，对于利拉鲁肽生产过程中的质量控制、分析纯化都能发挥良好的作用。在此基础上，完成了本发明。
46.利拉鲁肽
47.利拉鲁肽由诺和诺德公司研制，英文名liraglutide，分子式：c
172h265n43o51
，分子量：3751.2，cas号：204656-20-2，是一种人胰高血糖素样肽-1(glp-1)类似物，序列为：h-his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(nε(nα-pal-γ-glu))-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-oh(seq id no.:1)，与人的天然glp-1的序列同源性达97％。
48.利拉鲁肽的结构是将天然的glp-1(7-37)分子的第28位赖氨酸用精氨酸取代，同时第20位的赖氨酸侧链的ε氨基用十六烷酸谷氨酸酰化。由于该脂肪链的存在能够降低dpp-4的降解作用，延长半衰期，给药频率到达一天一次。能够显著降低2型糖尿病患者空腹或者餐后的血糖而达到调节体内血糖水平，同时能够降低患者体重和降低心血管疾病患者的死亡风险。
49.重组菌
50.本发明所用重组菌是根据专利申请cn 202010066293.9的方法制备得到，优选地为表达利拉鲁肽主链融合蛋白fp-tev-ek-glp-1(20)的重组大肠杆菌菌株。
51.boc-利拉鲁肽主链
52.boc-利拉鲁肽主链其序列为h2n-his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-cooh(seq id no.:1)，在26位的lys上有一个bochn-保护基团，其通过重组菌(如重组大肠杆菌)发酵、破碎、清洗、离心、酶切、纯化等步骤得到。
53.利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链样品
54.本发明中，利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链样品是指主要包含利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链的产品。
55.利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链通过如下步骤制备：
56.从boc-利拉鲁肽主链(化合物1)制备fmoc修饰的化合物2，化合物2脱boc保护后得化合物3，化合物3与活化利拉鲁肽侧链pal-glu-(osu)-otbu反应，得到化合物4，再经脱去fmoc反应得到化合物5，侧链脱除tbu保护基，最后得到利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链。
[0057][0058]
具体地，所述方法包括步骤：
[0059]
(i)提供如上所述的boc修饰的利拉鲁肽主链；
[0060]
(ii)对所述的boc修饰的利拉鲁肽主链进行fmoc修饰，从而制得fmoc和boc修饰的利拉鲁肽主链；
[0061]
(iii)对所述的fmoc和boc修饰的利拉鲁肽主链进行脱boc处理，并将其与利拉鲁肽侧链进行反应，从而制得fmoc修饰的利拉鲁肽；和
[0062]
(iv)对所述的fmoc修饰的利拉鲁肽进行脱fmoc与侧链脱tbu处理，从而制得利拉鲁肽。
[0063]
在另一优选例中，在步骤(ii)中，加入fmoc-osu、nahco3和dmf/h2o，从而进行fmoc修饰。
[0064]
在另一优选例中，加入的fmoc-osu、nahco3与boc修饰的利拉鲁肽主链的摩尔比为(0.8-1.5)：(1.5-2.5)：(0.8-1.2)，较佳地为(1.0-1.2)：(1.8-2.2)：(0.8-1.2)。
[0065]
在另一优选例中，在步骤(ii)和步骤(iii)之间，还包括对制得的fmoc和boc修饰的利拉鲁肽主链进行纯化的步骤，较佳地，利用c8制备柱进行纯化，流动相为tfa的乙腈溶液。
[0066]
在另一优选例中，在步骤(iii)中，还包括步骤：
[0067]
(a)加入tfa溶液，低温搅拌，进行脱boc处理，制得脱boc产物；
[0068]
(b)对脱boc产物进行纯化处理，较佳地进行c8反相纯化处理；
[0069]
(c)任选地，向纯化处理所得纯化收集液中加入有机溶剂，从而制得固体脱boc产物，较佳地所述有机溶剂为甲叔醚：石油醚混合液；
[0070]
(d)将脱boc产物与利拉鲁肽侧链混合，制得fmoc修饰的利拉鲁肽。
[0071]
在另一优选例中，在步骤(i)中，包括步骤：
[0072]
(ia)利用重组菌，制备本发明第二方面的所述的利拉鲁肽主链融合蛋白，
[0073]
(ib)利用肠激酶对所述的利拉鲁肽融合蛋白进行酶切处理，从而获得boc修饰的利拉鲁肽主链。
[0074]
在另一优选例中，在步骤(ia)中，从所述重组菌的发酵液中分离获得利拉鲁肽主链融合蛋白包涵体，对所述的包涵体进行变复性和酶切后，获得boc-利拉鲁肽主链融合蛋白。
[0075]
本发明主要优点：
[0076]
1、可以同时检测利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链，简单、方便，可以减少进样次数，提高监测效率。
[0077]
2、可以同时监测反应效率和产物得率。
[0078]
3、可以通过该分析方法纯化利拉鲁肽和boc-利拉鲁肽主链物质。
[0079]
4、建立良好的产品质量控制方法和生产工艺指纹图谱。
[0080]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0081]
实施例
[0082]
实施例1利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链的制备
[0083]
参照专利申请cn 202010066293.9中实施例的记载。
[0084]
步骤1构建利拉鲁肽表达菌株
[0085]
将融合蛋白fp-tev-ek-glp-1(20)的dna片段，克隆至表达载体质粒pbad/his a(购自ntcc公司，卡那霉素抗性)的arabad启动子下游ncoi-xhoi位点，得到质粒pbad-fp-tev-ek-glp-1(20)。再将pylrs的dna序列，克隆至表达载体质粒pevol-pbpf(购自ntcc公司，氯霉素抗性)的arabad启动子下游spei-sali位点，同时在prok启动子下游，以pcr方法插入赖氨酰-trna合成酶的trna(pyltcua)的dna序列。将构建的质粒pbad-fp-tev-ek-glp-1(20)和pevol-pylrs-pylt共同转化至大肠杆菌top10菌株，筛选获得表达利拉鲁肽主链融合蛋白fp-tev-ek-glp-1(20)的重组大肠杆菌菌株。
[0086]
步骤2boc-利拉鲁肽主链的表达
[0087]
将重组大肠杆菌，按5％的接种量(体积比)接入大肠杆菌种子液(公司培育)，37℃，ph7.0，分批补料至ph上升至7.05，然后开始进行碳氮源分开补料，根据恒ph法进行碳源流加。补料11h-发酵结束，碳氮源质量比1:1.0。补料后通过补料及自动流加7.5m氨水，使ph控制在7.0-7.2。培养至4-6小时左右，开始添加2.5g/l l-阿拉伯糖进行诱导，诱导持续14h，至发酵结束。获得包含利拉鲁肽主链融合蛋白的发酵液。
[0088]
步骤3boc-利拉鲁肽主链包涵体的制备
[0089]
将步骤2所得发酵液离心后，将湿菌体按1：1体积与破菌缓冲液混合，悬浮3h，悬浮液使用高压均质机破菌三次，破菌后离心收集包涵体，对其进行两次清洗，缓冲液成分为：0.5％t-80，1mm edta-2na，100mm nacl，ph7.5。经清洗后称重包涵体的得率为41-45g/l。经菌体破碎、清洗、离心后获得boc-利拉鲁肽主链包涵体。
[0090]
步骤4boc-利拉鲁肽主链包涵体的变复性及酶切
[0091]
向步骤3所得包涵体中以重量体积比1:10的比例加入7.5mol/l尿素溶解缓冲液，
室温搅拌溶解，bradford法测定蛋白浓度，控制包涵体溶解液的总蛋白浓度在25mg/ml左右，naoh调节ph 9.0
±
0.1。将包涵体溶解液滴加至含有5-10mmol/l tris，10mmol/l nacl，10mmol/l na2co
3 0.3-0.5mmol/l edta-2na，的复性缓冲液中，使包涵体溶解液稀释5-10倍复性，维持融合蛋白复性液ph值在9.0-10.0，温度控制在4-8℃，复性时间为10-20h。
[0092]
步骤5boc-利拉鲁肽主链融合蛋白的初步纯化
[0093]
取步骤4得到的融合蛋白复性液，经0.45μm的滤膜过滤，去除未溶解的物质；根据蛋白质等电点的差异，采用阴离子交换柱对融合蛋白进行初步纯化。
[0094]
步骤6boc-利拉鲁肽主链融合蛋白的酶切
[0095]
将步骤5初步纯化的boc-利拉鲁肽主链融合蛋白样本过疏水柱脱盐，纯水洗脱，洗脱体积约为柱体积的5倍。调节融合蛋白溶液的ph值为7.5-8.5，控制温度为25℃，加入肠激酶酶切，酶切时间为5-16h，获得boc-利拉鲁肽主链。
[0096]
步骤7boc-利拉鲁肽主链的反相层析
[0097]
根据多肽和蛋白质的疏水性差异，采用聚合物反相层析技术对boc-利拉鲁肽主链进行纯化，除去一部分杂质。
[0098]
步骤6获得的boc-利拉鲁肽主链融合蛋白的酶切溶液，经过滤澄清后，进行反相层析分离纯化。以含有0.065％三氟乙酸的水溶液作为流动相a；以含有0.065％三氟乙酸的乙腈溶液作为流动相b。boc-利拉鲁肽主链与填料结合，控制boc-利拉鲁肽主链上样量＜10mg/ml，然后梯度洗脱，收集boc-利拉鲁肽主链，可作为boc-利拉鲁肽主链标准品。
[0099]
步骤8利用boc-利拉鲁肽主链制备利拉鲁肽标准品和boc-利拉鲁肽主链样品溶液
[0100]
取步骤7得到的boc-利拉鲁肽主链化合物1，按照表1的摩尔比加入fmoc-osu、nahco3及dmf/h2o，反应8-12小时，制得fmoc和boc保护的glp-1。利用c8柱进行纯化，含有0.065％(v/v)tfa的水溶液为流动相a，含有0.065％(v/v)tfa的乙腈作为流动相b，梯度洗脱。纯化收集溶液中加入甲叔醚，沉淀离心，用甲叔醚洗涤沉淀2～3次，获得fmoc保护的化合物2：difmoc-glp-1(lys
20
boc)。
[0101]
表1投料的摩尔比
[0102] boc-利拉鲁肽主链fmoc-osunahco3dmf/h2o当量或体积1.0eq1.1eq2.0eq30v/30v
[0103]
取纯化后的化合物2，加入tfa溶液，低温搅拌10～20min，c8反相纯化脱保护反应物。纯化收集液中加入20倍体积甲叔醚：石油醚混合液(3:1)，沉淀离心，以混合液洗涤沉淀2～3次，最终获得脱除boc的固体化合物3：difmoc-glp-1(lys
20
nh2)。
[0104]
取boc脱除后的化合物3，加入30eq.edpa、nmp与水混合物(2:1)，室温温和搅拌5min。将当量的pal-glu-(osu)-otbu(23.7μmol)溶解于nmp(303μl)所得溶液，加入到所得混合物中，将反应混合物在室温下温和摇动2小时。向其中加入625μl含甘氨酸(6.5mg，86.9μmol)的50％乙醇水溶液，从而终止反应，获得化合物4：difmoc-glp-1-(pal-glu-(lys
20
nh2)-otbu)。
[0105]
取纯化后的化合物4(300mg)，加入含有20％哌啶的dmf溶液，室温反应30分钟。反应体系中内加入10倍体积的甲叔醚和石油醚混合溶剂，沉淀离心，固体用甲叔醚和石油醚混合溶剂洗涤3～5次，得到脱除fmoc后的化合物5(270mg)：glp-1-(pal-glu-(lys
20
nh2)-otbu)。
[0106]
glp-1取化合物5(270mg)，加入(tfa:tis:h2o＝95:2.5:2.5):dcm(v:v＝1:1)混合溶液10ml，室温震荡反应3～4小时脱除侧链tbu保护基，反应体系内加入10倍体积的甲叔醚和石油醚混合溶剂，沉淀离心，固体用甲叔醚和石油醚混合溶剂洗涤3次，得到250mg的终产物，即利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链溶液。hplc纯化后，得到120mg纯度大于98％利拉鲁肽，即利拉鲁肽标准品。
[0107]
实施例2利拉鲁肽及boc-利拉鲁肽主链的标准曲线制备及含量测定
[0108]
液相色谱条件：仪器：waters 2695；检测器：waters 2487紫外检测器；色谱柱：辛烷基键合硅胶c8柱(4.6
×
250mm)；流动相：流动相a为0.1mol/ml磷酸二氢铵水溶液，ph为3.7，流动相b为乙腈；检测波长：215nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样体积：50μl；梯度洗脱为：洗脱时间及流动相b体积占比为0～20min从25％
→
60％，20～35min从60％
→
90％，35～40min再从90％
→
25％，然后25％运行至10min。
[0109]
标准溶液的制备：将已知浓度的利拉鲁肽标准品溶液，和经过纯化得到的boc-利拉鲁肽主链标准品溶液混合，精密移取标准品溶液，稀释定容，得到五个浓度梯度(即0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml)，连续进样六次，以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到浓度和峰面积的标准曲线，boc-利拉鲁肽主链的标准曲线如图1，利拉鲁肽的标准曲线如图2，标准品boc-利拉鲁肽主链出峰时间为15.742min，利拉鲁肽出峰时间为22.106min，色谱图如图3。
[0110]
取实施例1步骤8中反应30min反应液作为含利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链的待测溶液，取样稀释，定容到合适浓度，测定其含量，样品溶液中boc-利拉鲁肽主链出峰时间为15.806min，利拉鲁肽出峰时间为22.142min，色谱图如图4。
[0111]
实施例3精密度试验
[0112]
液相色谱条件：仪器：waters 2695；检测器：waters 2487紫外检测器；色谱柱：辛烷基键合硅胶c8柱(4.6
×
250mm)；流动相：流动相a为0.1mol/ml磷酸二氢铵水溶液，ph为3.7，流动相b为乙腈；检测波长：215nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样体积：50μl；梯度洗脱为：洗脱时间及流动相b体积占比为0～20min从25％
→
60％，20～35min从60％
→
90％，35～40min再从90％
→
25％，然后25％运行至10min。
[0113]
精密移取一定量的利拉鲁肽(0.4mg/ml)及其boc-利拉鲁肽主链(0.25mg/ml)标准品溶液，稀释到合适浓度，定容，过0.45μm滤膜，连续进样6次，考察精密度，结果见表2。
[0114]
表2
[0115][0116]
由表2可以知，进同一样品6次的峰面积rsd值分别为0.75％、0.91％，符合要求，说明系统精密度良好，试验可信度高。
[0117]
实施例4重复性试验
[0118]
液相色谱条件：仪器：waters 2695；检测器：waters 2487紫外检测器；色谱柱：辛烷基键合硅胶c8柱(4.6
×
250mm)；流动相：流动相a为0.1mol/ml磷酸二氢铵水溶液，ph为3.7，流动相b为乙腈；检测波长：215nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样体积：50μl；梯度洗脱为：洗脱时间及流动相b体积占比为0～20min从25％
→
60％，20～35min从60％
→
90％，35～40min再从90％
→
25％，然后25％运行至10min。
[0119]
取经过小试生产工艺得到的样品溶液6份，分别稀释，定容到合适浓度(0.01mg/ml-0.1mg/ml)，过0.45μm滤膜，得到6个样品含量，结果见表3。
[0120]
表3
[0121][0122]
由表3可以知，boc-利拉鲁肽主链和利拉鲁肽rsd值分别为1.24％和1.06％，符合要求，重复性良好。
[0123]
实施例5加样回收率试验
[0124]
液相色谱条件：仪器：waters 2695；检测器：waters 2487紫外检测器；色谱柱：辛烷基键合硅胶c8柱(4.6
×
250mm)；流动相：流动相a为0.1mol/ml磷酸二氢铵水溶液，ph为3.7，流动相b为乙腈；检测波长：215nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样体积：50μl；梯度洗脱为：洗脱时间及流动相b体积占比为0～20min从25％
→
60％，20～35min从60％
→
90％，35～40min再从90％
→
25％，然后25％运行至10min。
[0125]
取样品溶液6份，分别加入接近浓度的标准品溶液，摇匀定容，过0.45μm滤膜，测6个样品含量，结果见表4
[0126]
表4
[0127]
[0128][0129]
由表4可知，boc-利拉鲁肽主链和利拉鲁肽平均回收率分别为：100.29％，100.74％；rsd值分别为1.99％和1.23％，符合要求，回收率高。
[0130]
对比例1使用流动相a为0.05％三氟乙酸水溶液对利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链样品溶液进行hplc测试
[0131]
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
[0132]
流动相：流动相a为0.05％三氟乙酸水溶液，ph为2.5，流动相b为乙腈，
[0133][0134]
检测波长：215nm；
[0135]
流速：1.0ml/min；
[0136]
柱温：30℃；
[0137]
进样体积：20μl。
[0138]
实验结果如图5所示，出峰时间为7.8min左右的为boc-利拉鲁肽主链。结果表明使用流动相a为三氟乙酸水溶液只能检测boc-利拉鲁肽主链，不能检测利拉鲁肽，及反应得率。
[0139]
对比例2使用流动相a为0.5％磷酸水溶液对利拉鲁肽及其boc-利拉鲁肽主链样品溶液进行hplc测试
[0140]
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
[0141]
流动相：流动相a为0.5％磷酸水溶液，ph为4.3，流动相b为乙腈，
[0142][0143]
检测波长：215nm；
[0144]
流速：1.0ml/min；
[0145]
柱温：30℃；
[0146]
进样体积：20μl。
[0147]
实验结果如图6所示，出峰时间为16.0min左右的为利拉鲁肽。结果表明使用流动相a为0.5％磷酸水溶液只能检测利拉鲁肽，不能检测boc-利拉鲁肽主链及反应效率。
[0148]
本发明所述的分析方法，具有高效、专属性好和灵敏度高的特点，能够有效分离利拉鲁肽及boc-利拉鲁肽主链。
[0149]
以上实施例仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进试验参数，均应包含在本发明的保护范围之内。