白芷提取物在调节更年期血脂异常方面的应用的制作方法

1.本发明涉及药物制备领域，具体涉及白芷提取物在调节更年期血脂异常方面的应用。


背景技术：

2.血脂异常和炎症是更年期代谢综合征的主要特征。对人类更年期和啮齿动物生殖衰老的研究表明，体内雌激素水平下降和生殖器官萎缩可导致脂质代谢紊乱，增加肥胖和心血管疾病的发病率。绝经期脂质代谢紊乱的临床表现主要为腹部脂肪堆积和总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平升高。雌激素和其他性类固醇激素与炎症的调节也有密切的关系。更年期和雌激素的丧失会导致炎症水平升高。绝经期e2的消耗可增加促炎细胞因子的释放，使机体炎症风险升高，并可能增加炎症相关疾病的发病率。此外，在更年期过渡期间内脏脂肪增多可能导致促炎脂肪因子的增加。激素替代疗法(hrt)是治疗更年期代谢综合征的传统疗法，但是，它也有一定的局限性和副作用。
3.肠道菌群已成为调节代谢功能障碍和炎症的关键因素之一。研究表明，胆汁酸对营养吸收、肝毒性和各种疾病(包括高胆固醇血症、炎症、癌症和代谢性疾病)的发生有显著影响。胆汁酸稳态与身体健康状况密切相关，可受到肠道微生物群和多种胆汁酸信号通路的影响，包括法尼醇类x受体(fxr)、肝脏x受体(lxr)和过氧化物酶体增殖物激活受体α (pparα)。因此，肠道微生物和胆胆酸信号是有希望的治疗策略，以改善血脂异常和炎症在更年期。
4.中医认为，更年期血脂异常与肝血虚、痰堵、血瘀有关。因此，活血化瘀是治疗更年期血脂异常的重要中医理论之一。白芷（radix angelicae dahuricae, rad），为伞型科植物白芷angelica dahurica（fisch.ex hoffm.） benth. et hook.f.或杭白芷angelica dahurica（fisch.ex hoffm.） benth.et hook.f. var.formosana（boiss.）shan et yuan 的干燥根，归肝、大肠经，具有祛风除湿、活血化瘀、排脓止痛的作用。使用历史悠久，始载于《神农本草经》。新的药理学研究揭示了rad的抗炎和脂质代谢调节作用[25-28]，rad乙醇提取物可抑制诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶2基因的表达，降低白细胞介素(il)-6和肿瘤坏死因子α (tnf-α)的水平，抑制nf-κb向核的转移。rad可显著降低粘液生成、降低il-4、il-5和tnf-α等细胞因子水平。lu等报道rad可降低高脂血症小鼠肝脏tc、tg水平，降低体重，提高肝总脂肪酶活性。呋喃香豆素，包括欧前胡素、异欧前胡素等，具有雌激素样活性，是白芷药理作用的主要活性成分之一。


技术实现要素：

[0005]
发明人经探究发现，白芷提取物可用于调节更年期血脂异常，为雌激素缺乏所致脂代谢紊乱提供了一种新的药剂。
[0006]
具体的：白芷提取物可显著上调肠肝循环中hmg-coa还原酶(hmgcr)和细胞色素p450 7a1(cyp7a1)的基因表达，并调节相关受体和蛋白的基因表达。
[0007]
白芷提取物可降低血清和肝脏总胆固醇（tc）和甘油三酯（tg）水平，减轻肝脏脂肪变性和炎症。
[0008]
白芷提取物可显著调节ovx肠道微生物组成，显著提高胆汁盐水解酶(bsh)活性，重建scfa谱和胆酸代谢谱。
[0009]
进一步地，所述的白芷提取物通过以下方法制备所得：取白芷药材饮片2.5kg，粉碎，用80%乙醇（1:10,w:v）超声提取三次，每次半小时，减压过滤得提取液，旋转蒸发浓缩成棕褐色浸膏。
[0010]
综上所述，白芷可用于治疗雌激素缺乏引起的血脂异常。
附图说明
[0011]
图1rad对ovx大鼠体重(a)和增重(b)的影响；图中：
###
p《0.001vs.shamgroup;
**
p《0.01,
***
p《0.001vs.ovxgroup。
[0012]
图2rad对ovx大鼠血清生化指标的影响；图中：
#
p《0.05,
##
p《0.01,
###
p《0.001vs.sham组;
*
p《0.05,
**
p《0.01,
***
p《0.001vs.ovx组。
[0013]
图3rad对ovx大鼠肝脏脂质的影响；图中：
##
p《0.01,
###
p《0.001vs.sham组;
**
p《0.01,
***
p《0.001vs.ovx组。
[0014]
图4rad对ovx大鼠肝脏tnf-α、il-6和il-1β的影响；图中：
#
p《0.05,
##
p《0.01vs.sham组;
*
p《0.05,
**
p《0.01vs.ovx组。
[0015]
图5he染色（
×
20）。
[0016]
图6油红o染色（
×
20）；图中：(a)和肝脂脂肪变性面积百分比(b)
###
p《0.001vs.shamgroup;
***
p《0.001vs.ovxgroup。
[0017]
图7rad对ovx大鼠肠道菌群组成在门水平的影响；图中：(a)在门水平的相对丰度(b)组间差异性分析
#
p《0.05vs.shamgroup;
*
p《0.05vs.ovxgroup。
[0018]
图8属水平肠道菌群组成；图中：(a)opls-da散点图；(b)荷载图；(c)组间差异性分析；
#
p《0.05,
##
p《0.01vs.shamgroup;
*
p《0.05,
**
p《0.01vs.ovxgroup。
[0019]
图9rad对ovx大鼠肠道菌群在种水平的影响；图中：
#
p《0.05vs.shamgroup;
*
p《0.05,
***
p《0.001vs.ovxgroup。
[0020]
图10rad对ovx大鼠bsh活性的影响；图中：
###
p《0.05vs.shamgroup;
*
p《0.05vs.ovxgroup。
[0021]
图11rad对ovx大鼠代谢表型的影响；图中：(a)各组胆汁酸组成.(b)opls-da散点图.(c)组间差异性分析.
#
p《0.05,
##
p《0.01vs.shamgroup;
*
p《0.05,
**
p《0.01vs.ovxgroup。
[0022]
图12rad对ovx大鼠胆汁酸代谢通路的影响；图中：(a) 设计的通路及蛋白. (b) 肝脏cyp7a1蛋白表达. (c) qrpcr. #
p 《 0.05, ##
p 《 0.01, vs. sham group; **
p 《 0.01, ***
p 《 0.001, vs. ovx group。
[0023]
图 13分子对接。
具体实施方式
[0024]
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
[0025]
材料和方法1.1 试剂和材料短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸和己酸)和2-乙基丁酸(内标，is)，购于sigma aldrich (poole, dorset, uk)。白芷（rad）药材，由陕西兴盛德药业有限公司提供。所有有机试剂均为色谱级。超纯水由milli-q integral 5 超纯水一体化智能系统(millipore, bedford, ma, usa)制备。
[0026]
白芷浸膏的制备取白芷药材饮片2.5 kg，粉碎，用80%乙醇（1:10, w:v）超声提取三次，每次半小时，减压过滤得提取液，旋转蒸发浓缩成棕褐色浸膏（约202 g）。取适量白芷提取液浸膏，用超纯水配制给药浓度为0.042 g/ml的给药制剂，每只大鼠灌胃10 ml/kg。
[0027]
动物实验雌性sd大鼠(280
±
20 g)，购自西安交通大学动物研究中心(批准号: no. scxk 2018-001)。大鼠单笼饲养，自由进食和饮水。经过1周的适应期后，将大鼠随机分为假手术(sham)组、ovx组和rad组(n=8)。对ovx组和rad组大鼠实施双侧卵巢切除模型[34]。sham组大鼠除卵巢切除外，均进行相同的手术暴露。恢复1周后，rad组大鼠每天灌胃rad提取物420 mg/kg(相当于原料4.2 g/kg、im 5.8 mg/kg、iim 2.35 mg/kg、oxyh 1.51 mg/kg、oxy 0.042 mg/kg)，连续12周。在一周的恢复期后，每周记录体重和摄食量。在处死前一天采集粪便样本。实验结束后，麻醉大鼠进行腹主动脉采血。收集血清并在
−
80
°
c下保存，直到进一步分析。收集盲肠和结肠内容物，立即用液氮冷冻。将组织切除、称重，并保存在
−
80
°
c或立即保存在4%多聚甲醛溶液中以供进一步分析。
[0028]
血清指标和肝脏脂质测定采用迈瑞bs-330e生化分析仪(中国深圳)测定血清生化指标。采用试剂盒测量肝脏中的tc和tg水平(applygen technologies, inc.)。
[0029]
肝脏tnf-α、il-6和il-1β基因表达采用trizol法提取肝脏标本中总rna。根据反转录酶试剂盒(天根生物技术，北京)进行cdna合成。rt-pcr检测肝脏tnf-α、il-6和il-1β mrna的表达。引物序列为:tnf-α，正向5 '
ꢀ‑ꢀ
accacgctcttctgtctactg
ꢀ‑
3 '，反向5 '
ꢀ‑ꢀ
cttggtggtttgctacgac
ꢀ‑
3 '；il-6，正向5 '
ꢀ‑ꢀ
agttgccttcttgggactgatgt
ꢀ‑
3 '和反向5 '
ꢀ‑ꢀ
tgctctgaatgactctggctttg
ꢀ‑
3 '；
il-1β，正向5 '
ꢀ‑ꢀ
gcaatggtcgggacatagtt
‑ꢀ
3 '反向5 '
ꢀ‑ꢀ
agacctgacttggcagagga
ꢀ‑
3 '；β-actin正向5 '
ꢀ‑ꢀ
tcaggtcatcactatcggcaat
ꢀ‑
3 '反向5 '
ꢀ‑ꢀ
aaagaaagggtgtaaaacgca
ꢀ‑
3 '。
[0030]
苏木精-伊红(h&e)和油红o染色肝、盲肠和子宫组织浸泡在4%多聚甲醛溶液中，石蜡包埋。按标准程序处理后，切5
µ
m厚的石蜡包埋切片，进行h&e染色。对固定的肝组织按照厂家说明进行油红o染色。
[0031]
基因提取、扩增及测序按照试剂盒说明书提取盲肠内容物菌群总dna。利用引物341f (5 '
ꢀ‑ꢀ
cctaygggrbgcascag
ꢀ‑
3 ')和806r (5 '
ꢀ‑ꢀ
ggactacnngggtatctaat
ꢀ‑
3 ')对16s rrna的v3-v4可变区进行pcr扩增。16s rrna基因测序程序参照我们前期研究[34]。
[0032]
胆汁盐水解酶(bsh)的测定将100毫克肝组织加入900ml超纯水中，充分匀浆，13000 rpm/min离心10分钟。取上清液，按elisa试剂盒指示测定大鼠肝脏中bsh酶水平。
[0033]
粪便scfa测定采用气相色谱-火焰离子化检测(gc-fid)对sham组、ovx组和rad组大鼠粪便scfas(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸、己酸)进行定量。
[0034]
胆汁酸谱测定将血清样品(100 μl)加入500 μl预冷甲醇和10 μl内标液中漩涡混合，-20℃孵育20 min沉淀蛋白。4℃、14000 rpm/min离心15 min，收集上清，真空干燥。加入甲醇-水(1:1,v/v)复溶，4℃、14000 rpm/min离心15 min。收集上清样品进行超高效色谱-串联质谱(uplc-ms /ms)分析。
[0035]
分析采用western blot法检测各组大鼠肝脏中cyp7a1蛋白的表达。取肝脏样品(200 mg)，用ripa裂解缓冲液提取总蛋白。以4:1的比例将蛋白液加入5*蛋白负载缓冲液中，沸水浴变性15 min。经sds-page电泳、膜转移、封膜后，分别用一抗(抗cyp7a1抗体、β-actin抗体)和二抗孵育。洗涤后，根据制造商的说明用ecl试剂显色。采用bio-rad凝胶成像系统(gel imaging system, bio-rad)对胶片进行扫描和定量。
[0036]
胆汁酸代谢相关基因表达的rt-pcr分析采用trizol总rna提取试剂盒提取盲肠和肝脏样本中总rna。根据逆转录酶试剂盒(天根生物技术)进行cdna合成。采用rt-pcr(lightcycler 480 ii)测定肝脏中hmgcr、cyp7a1 cyp27a1、shp、fgf15、lxr、pparα、ntcp、bsep、mrp2、ostα和ostβ和盲肠中asbt的基因表达。cdna(2μl)加入到总量为20μl的rt-pcr定量反应体系（2x sg fast qpcr master mix，b639271, bbi, roche)。rt-pcr反应条件：95
°
c孵育初始变性5 s，然后95
°
c 5 s和60
°
c 30 s循环45次。所用引物序列如表1所示。结果归一化到β-actin mrna水平。
[0037]
表 1 引物序列
1.13数据分析所有数据均用平均值
±
sd表示。采用student t检验评估两组间的差异。p值《 0.05为显著差异。使用simca-p软件(version 14.1, umetrics, san jose, ca, usa)对潜在结构进行正交投影判别分析(opls-da)。采用spearman秩相关检验进行相关分析，p《0.05 (α水平)认为差异显著[35]。使用graphpad prism 5(美国)对结果进行可视化。
[0038]
实验结果2.1 体重、增重及内脏指数各组体重和增重见图1，脏器指数见表2。与sham组相比，ovx组每周体重(图1a)和12周体重增重(图1b)显著增加(p 《 0.001)；脏器指数的值包括心脏、肝、左肾、右肾、脑和子宫的脏器指数明显降低(p 《 0.05) (表2)。rad给药显著减少了ovx大鼠体重和体重增加(p 《 0.01) (图1)，与ovx组相比，心脏、肝、脑的脏器指数明显增加(p 《 0.05)(表2)。
[0039]
表 2. 各组大鼠脏器指数.
###
p 《 0.001 vs. sham组; *
p 《 0.05, **
p 《 0.01 vs. ovx组.2.2 血清生化指标血清生化指标结果如图2所示，与sham组比较，ovx组血清tc、tg、ldl-c、alt、alp、尿素、crea等指标明显升高(p 《 0.05)， tp、alb明显降低(p 《 0.05)。与ovx组比较，rad组
血清tc、tg、ldl-c、alt、alp、尿素和crea水平显著改善(p 《 0.05)。
[0040]
肝脏脂质如图3所示，切除卵巢后大鼠肝脏中tc、tg水平明显升高(p 《 0.01)。与ovx组大鼠相比，rad治疗组大鼠肝脏tc、tg水平显著升高(p 《 0.01)。
[0041]
rad对肝脏tnf-α、il-6和il-1β的影响与sham组大鼠相比，ovx组大鼠的tnf-α、il-6和il-1β基因表达显著增加(p 《 0.05)(图4)。与ovx组大鼠相比，rad组大鼠的tnf-α、il-6和il-1β基因表达显著降低(p 《 0.05)(图4)。
[0042]
rad对ovx大鼠病理结构的影响如图5所示，假药组大鼠未见明显病理改变。大鼠卵巢切除后出现不同程度的病理改变，如子宫萎缩、核浆比增高、肝细胞脂肪变性、脂肪空泡、盲肠粒细胞浸润、粘膜下水肿等。与ovx大鼠相比，rad能明显改善肝脏和盲肠的病理变化；但子宫内的萎缩程度及核质比均无明显改善。
[0043]
rad对ovx大鼠肝脏脂肪变性的影响油红o染色结果显示，与sham组大鼠相比，ovx组大鼠的肝脂沉积严重(图6a)。采用image-pro plus 6.0软件(media cybernetics, inc.， rockville, md, usa)测量脂滴面积。与sham组相比，卵巢切除术后大鼠的平均脂滴面积百分比显著增加(p 《 0.001)(图6b)。与ovx大鼠相比，rad给药明显降低了肝脂沉积和肝脂面积百分比(p 《 0.05)(图6b)。
[0044]
门水平的肠道菌群组成在门水平，各组肠道菌群组成如图7a所示。由图7a可知，sham组、ovx组和rad组厚壁菌门相对丰度最高，为66.86 ~ 80.65%;其次是拟杆菌门(16.6-27.24%)和变形菌门(1.56-4.97%)。与sham组相比，ovx组firmicutes和verrucomicrobia的相对丰度显著降低(p《0.05)，而bacteroidetes、melainabobacteria和elusimicrobia的相对丰度显著升高(p《0.05)(图7b)。与sham组相比，卵巢切除术显著降低了厚壁菌门/拟杆菌门(f/b)比值(p《0.05)。与ovx组相比，rad给药后firmicutes和verrucomicrobia的相对丰度显著升高(p《0.05)， bacteroidetes、melainabbacteria和elusimicrobia的相对丰度显著降低(p《0.05)(图7b)。与ovx大鼠相比，rad给药组的大鼠f/b比值也显著增加(p《0.05)(图7b)。
[0045]
属水平的肠道菌群组成通过opls-da分析各组肠道菌群在属水平上的结构。opls-da评分结果显示，根据两个主成分的r2y = 0.951, q2 = 0.486做散点图，sham组、ovx组和rad组的样本显示出清晰的分离(图8a)。进一步通过加载散点图鉴定重要的属，包括乳酸菌（lactobacillus）, parabacteroides, akkermansia, peptococcus, acinetobacter和psychrobacter (图8b)。t检验进一步验证组间差异有统计学意义(p《0.05)(图8c)。与假处理大鼠相比，ovx大鼠的乳酸菌（lactobacillus）、akkermansia、peptococcus和psychrobacter的相对丰度显著降低，而不动杆菌的相对丰度显著升高。与ovx组相比相比，rad给药显著提高了乳酸菌（lactobacillus）、parabacteroides、akkermansia和psychrobacter水平(p《0.05)，显著降低了不动杆菌水平(p《0.05)(图8c)。
[0046]
种水平的肠道微生物群与假处理大鼠相比，ovx组大鼠罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri和溴瘤胃球
菌ruminococcus bromii的相对丰度显著降低(p《0.05)。与ovx组相比，rad组显著逆转了罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri和溴瘤胃球菌ruminococcus bromii的相对水平(p《0.05)，显著提高了parabacteroides distasonis的相对水平(p《0.05) (图9)。
[0047]
rad对ovx大鼠bsh活性的影响结果如图10所示，与假手术sham组相比，ovx大鼠的bsh活性明显降低(p《0.05)。与ovx组相比，rad组大鼠的bsh活性明显恢复(p《0.05)。
[0048]
对ovx大鼠scfas的影响采用gc-fid测定粪便中7种scfas的含量，结果见表3。各组中乙酸含量最高，丁酸和丙酸次之。与sham组相比，ovx组大鼠体内乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸和总scfas含量均显著降低(p《0.05)。rad给药可明显逆转ovx大鼠scfa的下降。与ovx大鼠相比，rad组大鼠的scfas(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸)和总scfas含量均显著升高(p《0.01)。
[0049]
表 3. rad对ovx大鼠粪便scfa的影响
#
p 《 0.05, ##
p 《 0.01 vs. sham group; **
p 《 0.01, ***
p 《 0.001 vs. ovx group.2.12 rad对ovx大鼠血清胆汁酸的影响 血清中各胆汁酸成分的含量比例见图11a，由图11a可知，shan组中初级胆汁酸cdca和ca的含量占比最高，分别占到26.1%和26%，其次是tca（13.5%）和hdca（11.3%）。与sham组相比，ovx组中各胆汁酸结构组成有明显变化，ovx组中tca的含量占比最高（31.5%），其次是hdca（17.4%）和ca（11.8%）。rad组中各胆汁酸成分的含量比例接近于sham组，与模型组相比，ca和cdca的含量占比增加，分别升高至26.2%和17.8%，tca的含量占比明显下降，降至17.5%。
[0050]
opls-da分析结果（图11b）表明sham、ovx和rad三组很好的区分开来，rad组介于sham和ovx组之间并向sham组靠近。进一步采用vip和t-test确定差异胆汁酸，结果共发现7个差异胆汁酸（图11c），与sham组相比，ovx组中ca、cdca、glca、gcdca的相对含量显著降低（p《0.05），牛磺结合型胆酸tca、tudca和thdca的相对含量显著升高（p《0.05）；与ovx组相比，rad给药组显著扭转了ca、cdca、glca、gcdca、tca、tudca和thdca的相对含量（p《0.05）。另外，与sham组相比，ovx组的游离胆酸和甘胺结合型胆酸的相对含量均显著下降，牛磺结合型胆酸的相对含量显著升高；甘胺结合型胆酸与牛磺结合型胆酸的比值显著降低。与ovx组相比，rad给药组的游离胆酸和甘胺结合型胆酸的相对含量均显著升高，牛磺结合型胆酸的相对含量显著降低；甘胺结合型胆酸与牛磺结合型胆酸的比值显著升高。
[0051]
的蛋白表达采用western blot法检测cyp7a1蛋白表达，结果如图12b所示。与sham组相比，ovx组cyp7a1蛋白水平显著降低(p《0.05)。与ovx组相比，rad组cyp7a1蛋白水平显著升高(p《0.05)。
[0052]
胆汁酸代谢和转运相关基因的表达通过pcr检测胆汁酸代谢运输相关基因在肝脏和盲肠中的表达情况，结果如图12c所示。与sham组比较，ovx组小鼠hmgcr、cyp7a1、lxrα水平显著下调，asbt水平显著上调(p《0.05)。与ovx组比较，rad给药后，hmgcr、cyp7a1、cyp27a1、 shp、fgf15、lxrα、pparα、asbt、ntcp和bsep水平均显著升高。胆汁酸信号通路图如图12a所示。
[0053]“成分-靶点”分子对接将白芷的主要活性成分im和iim，与参与胆汁酸代谢的关键受体fxrα、lxr和pparα进行分子对接和结合能力预测。分子对接结合自由能越小，则表示受体与配体之间的亲和力越大，见表4。并用 pymol 软件进行可视化处理，见图13。结果显示，im和iim与受体对接的结合自由能均小于－5.65 kcal/mol，表明各活性成分与fxr、lxr、和pparα受体有较高的亲和力。
[0054]
表4 分子对接结合能结论rad可降低ovx大鼠体重，减轻血清和肝脏脂质积聚，缓解雌激素缺乏引起的炎症反应。此外，rad可调节ovx大鼠肠道菌群结构的改变，增加了乳酸菌lactobacillus、parabacteroides、akkermansia和psychrobacter的比例，降低acinetobacter的比例。rad还显著逆转了卵巢切除术引起的scfa谱变化。此外，rad重建了ovx大鼠体内胆汁酸代谢谱，并调控了相关信号通路。综上所述，本研究提示rad可能具有作为膳食补充剂调节更年期血脂异常和炎症的潜力，其潜在机制可能与肠道菌群和胆汁酸信号有关。
[0055]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。