基于HRP标记蛋白的工作浓度检测方法与流程

基于hrp标记蛋白的工作浓度检测方法
技术领域
1.本发明涉及标记蛋白工作浓度检测技术领域，尤其涉及一种基于hrp标记蛋白的工作浓度检测方法。


背景技术：

2.辣根过氧化物酶（hrp）是一种糖蛋白，其名称的由来是因为在辣根中该酶的含量很高，它是目前使用最广泛的一种标记酶，用来标记抗体或其它蛋白质，既能用于定位检测，也能于定量测定。辣根过氧化物酶结构稳定且催化性能特殊，可以在宽泛的条件下对氧化吩类及苯胺类芳香族化合物的氧化反应均有良好的催化功能。而且它的反应温和、活性高、选择性高且无污染，常用于医学诊断生化检测等各个领域。而石墨烯量子点是一种准零维的纳米材料，尺寸可以在几个纳米以下，具有一层、两层或者几层的石墨烯结构，石墨烯量子点表现出生物低毒性、优异的水溶性、化学惰性、稳定的光致发光、良好的表面修饰，在生物、化学、药理等领域有着广泛的应用，本文建立利用石墨烯量子点作为荧光探针构建辣根过氧化物酶检测的新方法。
3.在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。
4.然而，在现有技术中，无法针对用作标记蛋白的hrp的工作浓度进行快速精准的测量，从而导致在使用hrp标记蛋白进行标记时易出现偏差，无法对标记物进行精准测量，导致hrp标记蛋白针对标记物的测量精度低。


技术实现要素：

5.为此，本发明提供一种基于hrp标记蛋白的工作浓度检测方法，用以克服现有技术中无法针对hrp标记蛋白的工作浓度进行精准检测的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供一种基于hrp标记蛋白的工作浓度检测方法，包括：步骤a，使用包被缓冲液将抗原稀释至预设浓度后将稀释后抗原分成多组，将各组抗原分别物理吸附于不同的固相载体并在预设静置温度环境下将各组抗原静置预设时长；步骤b，使用洗涤缓冲液依次洗涤所述步骤a中静置预设时长的多组抗原并在洗涤完成后备用；步骤c，将hrp标记蛋白分成多组，使用bsa-pbs溶液依次对各组hrp标记蛋白进行稀释以制备多组不同浓度的hrp标记蛋白；步骤d，依次将所述步骤c中制备的不同浓度的hrp标记蛋白滴入至对应组的所述抗原内以形成标定混合物，将固相载体加热至预设孵育温度以对标定混合物进行孵育并在标定混合物的孵育时长达到预设值时向各组标定混合物所在固相载体内加入底物夜，加入完成后实时监测各组固相载体中标定混合物的反应情况，当判定标定混合物反应完成时，
使用比色仪依次检测不同组标定混合物的亮度值，根据标定混合物中的hrp标记蛋白浓度和亮度值绘制曲线图并根据曲线图确定hrp抗体的工作浓度；在针对第i组所述标定混合物的反映情况进行监测时，设定i=1，2，3，...n，建立预设反映情况矩阵qi，设定qi（si，fi，ni，tmaxi），其中，si为第i组标记蛋白的稀释浓度，fi为针对第i组标定混合物亮度的检测周期，ni为针对第i组标定混合物亮度的预设判定周期数量，tmaxi为针对第i组标定混合物的最大监测时长；当针对所述第i组标定混合物的反映情况进行监测时，记录反应总时长并使用比色仪周期性检测该组标定混合物的亮度li，当反应时长达到fi时，使用比色仪检测检测标定混合物的亮度li1并在检测完成时重新记录反应时长，当重新记录的反应时长达到fi时，使用比色仪检测检测标定混合物的亮度li2，重复上述过程以依次检测各周期内标定混合物的亮度；在记录过程中，设定比色仪在第j个监测周期测得的标定混合物亮度为lij，若比色仪在第j 1个监测周期测得的标定混合物亮度值lij 1＜lij，则判定该组标定混合物反应完成并将该组标定混合物的反应亮度记为lij，若比色仪在第j 1个监测周期测得的标定混合物亮度值lij 1=lij，则将判定周期数量n记为2，当比色仪在检测过程中测得该组标定混合物的亮度值为lij的检测周期数量n=ni时，判定该组标定混合物反应完成并将该组标定混合物的反应亮度记为lij；在检测过程中，当监测总时长达到tmaxi时，判定该组标定混合物反应完成并从测得的多个亮度值中选取最大值作为该组标定混合物的亮度值。
7.进一步地，当完成对所述各组含有不同浓度hrp标记蛋白的标定混合物的亮度的判定时，以亮度值为纵坐标，hrp标记蛋白浓度为横坐标，根据针对上述标定混合物的检测结果绘制曲线并计算曲线中各点的斜率，将曲线斜率最大值所处点位代表的hrp标记蛋白浓度确定为hrp标记蛋白的工作浓度。
8.进一步地，在所述步骤a中，建立预设抗原浓度矩阵r0和预设组数矩阵n0，对于所述预设抗原浓度矩阵r0，设定r0（r1，r2，r3），其中，r1为第一预设抗原浓度，r2为第二预设抗原浓度，r3为第三预设抗原浓度，r1＜r2＜r3，对于所述预设组数矩阵n0，设定n0（n1，n2，n3），其中，n1为第一预设组数，n2为第二预设组数，n3为第三预设组数，n3＞n2＞n1；当使用包被缓冲液完成对抗原的稀释时，检测稀释后抗原的浓度r，若r≤r1，则将稀释后抗原分为n1组，若r1＜r≤r2，则将稀释后的抗原分为n2组，若r2＜r≤r3，则将稀释后的抗原分为n3组。
9.进一步地，当完成对所述抗原的分组时，建立hrp标记蛋白稀释参数矩阵h，设定h（s，d），其中，s为hrp标记蛋白初始稀释浓度，d为hrp标记蛋白浓度稀释梯度，在针对所述各组hrp标记蛋白的浓度的确定时，根据所述抗原的浓度r确定hrp标记蛋白的初始浓度并根据抗原的组数n确定各相邻组hrp标记蛋白之间的浓度梯度。
10.进一步地，在所述hrp标记蛋白稀释参数矩阵h（s，d）中嵌套hrp标记蛋白预设初始浓度矩阵s0，设定s0（s1，s2，s3），其中，s1为hrp标记蛋白第一预设初始浓度，s2为hrp标记蛋白第二预设初始浓度，s3为hrp标记蛋白第三预设初始浓度，s1＜s2＜s3，在判定hrp标记蛋白初始浓度时，若抗原的浓度r≤r1，则将hrp标记蛋白的初始浓度设为s1，若r1＜r≤r2，则将hrp标记蛋白的初始浓度设为s2，若r2＜r≤r3，则将hrp标记蛋白的初始浓度设为s3。
11.进一步地，在所述hrp标记蛋白稀释参数矩阵h（s，d）中嵌套hrp标记蛋白预设浓度梯度矩阵d0，设定d0（d1，d2，d3），其中，d1为hrp标记蛋白第一预设浓度梯度，d2为hrp标记
蛋白第二预设浓度梯度，d3为hrp标记蛋白第三预设浓度梯度，d1＜d2＜d3，在判定各组hrp标记蛋白间的浓度梯度时，若所述抗原的组数为nk，设定k=1，2，3，则将各组hrp标记蛋白间的浓度梯度设置为dk。
12.进一步地，当判定hrp标记蛋白的初始浓度设为sx并将各组hrp标记蛋白间的浓度梯度设置为dk时，设定x=1，2，3，则对于所述第i组hrp标记蛋白的浓度si，设定si=sx i
×
dk。
13.进一步地，在所述步骤d中，针对所述第i组标定混合物进行孵育时，建立预设孵育参数矩阵fi，设定fi（ei，ti），其中，ei为标定混合物预设活性值，ti为预设孵育温度；在针对第i组标定混合物进行孵育时，将孵育温度调节至ti并实时检测标定混合物的活性值ei，若ei＜ei，则升高孵育温度，若ei＞ei，则降低孵育温度，若升高温度后的标定混合物活性值ei’仍小于ei且ei’逐渐降低，则降低孵育温度，当ei=ei时，开始计时并在记录时长达到孵育时长时向该组标定混合物内添加底物液。
14.进一步地，在建立所述预设孵育参数矩阵fi时，建立标记蛋白活性修正矩阵g，设定g（b，a），其中，b为活性比，a为孵育温度修正系数，在标记蛋白活性修正矩阵g（b，a）中嵌套预设活性比矩阵b0，设定b0（b1，b2），其中，b1为第一预设活性比，b2为第二预设活性比，b1＜b2，在标记蛋白活性修正矩阵g（b，a）中嵌套预设孵育温度修正系数矩阵a0，设定a0（a1，a2），其中，a1为第一预设孵育温度修正系数，a2为第二预设孵育温度修正系数，0.5＜a1＜1＜a2＜1.5；在针对所述i组标定混合物建立预设孵育参数矩阵fi前，确定该组标定混合物在添加hrp标记蛋白前的抗原浓度r并计算标定混合物预设活性值ei与抗原浓度r之间的比值b，设定b=ei/r，若b1＜b＜b2，则不对该组标定混合物的预设孵育温度ti进行修正，若b≤b1，则使用a1对该组标定混合物的预设孵育温度ti进行修正，修正后的预设孵育温度为tia，设定tia=ti
×
a1，若b≥b2，则使用a2对该组标定混合物的预设孵育温度ti进行修正，修正后的预设孵育温度为tib，设定tib=ti
×
a2。
15.进一步地，所述固相载体为聚苯乙烯板，在聚苯乙烯板上设有多个凹孔，用以装载各组抗原。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果在于，本发明通过实时监测各组hrp标记蛋白与抗原之间的反应情况从而精准确定各组标定混合物在反应过程中释放的实际亮度值并得到精准的浓度-亮度对应关系，在绘制亮度-浓度曲线时，能够使曲线更加符合hrp标记蛋白的实际浓度-亮度对应关系，并精准计算出hrp标记蛋白的工作浓度，从而有效提高了本发明所述方法针对hrp标记蛋白的工作浓度的检测精度。
17.进一步地，在针对第i组所述标定混合物的反映情况进行监测时，建立预设反映情况矩阵qi（si，fi，ni，tmaxi），通过依次确定监测过程中的标记蛋白稀释浓度、标定混合物亮度检测周期、判定周期数量以及最大监测时长，在反应过程中发生不同情况时，均能够针对该组标定混合物的实际反应亮度做出精准判断，从而得到精准的浓度-亮度对应关系并进一步提高了本发明所述方法针对hrp标记蛋白的工作浓度的检测精度。
18.进一步地，当使用包被缓冲液完成对抗原的稀释时，建立预设抗原浓度矩阵r0和预设组数矩阵n0，根据抗原的实际浓度确定分组的数量，通过根据抗原的浓度将抗原的组数设定为对应值，能够有效避免抗原浓度过低时分组过多导致单组内抗原的实际含量过少
导致的检测不清晰的情况发生，从而进一步提高了本发明所述方法针对hrp标记蛋白的工作浓度的检测精度。
19.进一步地，当完成对所述抗原的分组时，建立hrp标记蛋白稀释参数矩阵h（s，d），在h（s，d）中分别嵌套hrp标记蛋白预设初始浓度矩阵s0和hrp标记蛋白预设浓度梯度矩阵d0，通过根据抗原的实际浓度r确定hrp标记蛋白的初始浓度并通过抗原的组数n设置各组hrp标记蛋白间的浓度梯度，能够在使hrp标记蛋白的最低浓度能够与抗原发生反应的同时，保证各组间的数值的连贯性，在绘制曲线图时，能够更加精准和平滑的完成对曲线的绘制，能够使曲线更加符合hrp标记蛋白的实际浓度-亮度对应关系，从而进一步提高了本发明所述方法针对hrp标记蛋白的工作浓度的检测精度。
20.进一步地，在针对所述第i组标定混合物进行孵育时，建立预设孵育参数矩阵fi（ei，ti），在监测过程中，通过根据标定混合物的实际活性值调节实际孵育温度，能够使标定混合物的活性保持在最佳值，从而有效提高针对标定混合物反应的亮度的检测精度，同时，在升高温度后，会根据标定混合物的活性值的增降判定温度是否过高或过低，从而进一步提高针对标定混合物反应的亮度的检测精度，在进一步提高计算hrp标记蛋白的工作浓度的精度的同时，进一步提高了本发明所述方法针对hrp标记蛋白的工作浓度的检测精度。
21.进一步地，在建立所述预设孵育参数矩阵fi时，建立标记蛋白活性修正矩阵g（b，a），通过根据标定混合物在添加hrp标记蛋白前的抗原浓度r并计算标定混合物预设活性值ei与抗原浓度r之间的比值b对孵育温度进行针对性调节，能够进一步保证反应过程中标定混合物活性值，从而进一步提高了本发明所述方法针对hrp标记蛋白的工作浓度的检测精度。
附图说明
22.图1为本发明所述基于hrp标记蛋白的工作浓度检测方法的流程图。
具体实施方式
23.为了使本发明的目的和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明作进一步描述；应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
24.下面参照附图来描述本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解的是，这些实施方式仅仅用于解释本发明的技术原理，并非在限制本发明的保护范围。
25.请参阅图1所示，其为本发明所述基于hrp标记蛋白的工作浓度检测方法的流程图。本发明所述基于hrp标记蛋白的工作浓度检测方法包括：步骤a，使用包被缓冲液将抗原稀释至预设浓度后将稀释后抗原分成多组，将各组抗原分别物理吸附于不同的固相载体并在预设静置温度环境下将各组抗原静置预设时长；步骤b，使用洗涤缓冲液依次洗涤所述步骤a中静置预设时长的多组抗原并在洗涤完成后备用；步骤c，将hrp标记蛋白分成多组，使用bsa-pbs溶液依次对各组hrp标记蛋白进行稀释以制备多组不同浓度的hrp标记蛋白；步骤d，依次将所述步骤c中制备的不同浓度的hrp标记蛋白滴入至对应组的所述抗原内以形成标定混合物，将固相载体加热至预设孵育温度以对标定混合物进行孵育并在
标定混合物的孵育时长达到预设值时向各组标定混合物所在固相载体内加入底物夜，加入完成后实时监测各组固相载体中标定混合物的反应情况，当判定标定混合物反应完成时，使用比色仪依次检测不同组标定混合物的亮度值，根据标定混合物中的hrp标记蛋白浓度和亮度值绘制曲线图并根据曲线图确定hrp抗体的工作浓度；在针对第i组所述标定混合物的反映情况进行监测时，设定i=1，2，3，...n，建立预设反映情况矩阵qi，设定qi（si，fi，ni，tmaxi），其中，si为第i组标记蛋白的稀释浓度，fi为针对第i组标定混合物亮度的检测周期，ni为针对第i组标定混合物亮度的预设判定周期数量，tmaxi为针对第i组标定混合物的最大监测时长；当针对所述第i组标定混合物的反映情况进行监测时，记录反应总时长并使用比色仪周期性检测该组标定混合物的亮度li，当反应时长达到fi时，使用比色仪检测检测标定混合物的亮度li1并在检测完成时重新记录反应时长，当重新记录的反应时长达到fi时，使用比色仪检测检测标定混合物的亮度li2，重复上述过程以依次检测各周期内标定混合物的亮度；在记录过程中，设定比色仪在第j个监测周期测得的标定混合物亮度为lij，若比色仪在第j 1个监测周期测得的标定混合物亮度值lij 1＜lij，则判定该组标定混合物反应完成并将该组标定混合物的反应亮度记为lij，若比色仪在第j 1个监测周期测得的标定混合物亮度值lij 1=lij，则将判定周期数量n记为2，当比色仪在检测过程中测得该组标定混合物的亮度值为lij的检测周期数量n=ni时，判定该组标定混合物反应完成并将该组标定混合物的反应亮度记为lij；在检测过程中，当监测总时长达到tmaxi时，判定该组标定混合物反应完成并从测得的多个亮度值中选取最大值作为该组标定混合物的亮度值。
26.具体而言，当完成对所述各组含有不同浓度hrp标记蛋白的标定混合物的亮度的判定时，以亮度值为纵坐标，hrp标记蛋白浓度为横坐标，根据针对上述标定混合物的检测结果绘制曲线并计算曲线中各点的斜率，将曲线斜率最大值所处点位代表的hrp标记蛋白浓度确定为hrp标记蛋白的工作浓度。
27.具体而言，在本发明所述步骤a中，建立预设抗原浓度矩阵r0和预设组数矩阵n0，对于所述预设抗原浓度矩阵r0，设定r0（r1，r2，r3），其中，r1为第一预设抗原浓度，r2为第二预设抗原浓度，r3为第三预设抗原浓度，r1＜r2＜r3，对于所述预设组数矩阵n0，设定n0（n1，n2，n3），其中，n1为第一预设组数，n2为第二预设组数，n3为第三预设组数，n3＞n2＞n1；当使用包被缓冲液完成对抗原的稀释时，检测稀释后抗原的浓度r，若r≤r1，则将稀释后抗原分为n1组，若r1＜r≤r2，则将稀释后的抗原分为n2组，若r2＜r≤r3，则将稀释后的抗原分为n3组。
28.具体而言，当完成对所述抗原的分组时，建立hrp标记蛋白稀释参数矩阵h，设定h（s，d），其中，s为hrp标记蛋白初始稀释浓度，d为hrp标记蛋白浓度稀释梯度，在针对所述各组hrp标记蛋白的浓度的确定时，根据所述抗原的浓度r确定hrp标记蛋白的初始浓度并根据抗原的组数n确定各相邻组hrp标记蛋白之间的浓度梯度。
29.具体而言，在本发明所述hrp标记蛋白稀释参数矩阵h（s，d）中嵌套hrp标记蛋白预设初始浓度矩阵s0，设定s0（s1，s2，s3），其中，s1为hrp标记蛋白第一预设初始浓度，s2为hrp标记蛋白第二预设初始浓度，s3为hrp标记蛋白第三预设初始浓度，s1＜s2＜s3，在判定hrp标记蛋白初始浓度时，若抗原的浓度r≤r1，则将hrp标记蛋白的初始浓度设为s1，若r1
＜r≤r2，则将hrp标记蛋白的初始浓度设为s2，若r2＜r≤r3，则将hrp标记蛋白的初始浓度设为s3。
30.具体而言，在本发明所述hrp标记蛋白稀释参数矩阵h（s，d）中嵌套hrp标记蛋白预设浓度梯度矩阵d0，设定d0（d1，d2，d3），其中，d1为hrp标记蛋白第一预设浓度梯度，d2为hrp标记蛋白第二预设浓度梯度，d3为hrp标记蛋白第三预设浓度梯度，d1＜d2＜d3，在判定各组hrp标记蛋白间的浓度梯度时，若所述抗原的组数为nk，设定k=1，2，3，则将各组hrp标记蛋白间的浓度梯度设置为dk。
31.具体而言，当判定hrp标记蛋白的初始浓度设为sx并将各组hrp标记蛋白间的浓度梯度设置为dk时，设定x=1，2，3，则对于所述第i组hrp标记蛋白的浓度si，设定si=sx i
×
dk。
32.具体而言，在本发明所述步骤d中，针对所述第i组标定混合物进行孵育时，建立预设孵育参数矩阵fi，设定fi（ei，ti），其中，ei为标定混合物预设活性值，ti为预设孵育温度；在针对第i组标定混合物进行孵育时，将孵育温度调节至ti并实时检测标定混合物的活性值ei，若ei＜ei，则升高孵育温度，若ei＞ei，则降低孵育温度，若升高温度后的标定混合物活性值ei’仍小于ei且ei’逐渐降低，则降低孵育温度，当ei=ei时，开始计时并在记录时长达到孵育时长时向该组标定混合物内添加底物液。
33.具体而言，在建立本发明所述预设孵育参数矩阵fi时，建立标记蛋白活性修正矩阵g，设定g（b，a），其中，b为活性比，a为孵育温度修正系数，在标记蛋白活性修正矩阵g（b，a）中嵌套预设活性比矩阵b0，设定b0（b1，b2），其中，b1为第一预设活性比，b2为第二预设活性比，b1＜b2，在标记蛋白活性修正矩阵g（b，a）中嵌套预设孵育温度修正系数矩阵a0，设定a0（a1，a2），其中，a1为第一预设孵育温度修正系数，a2为第二预设孵育温度修正系数，0.5＜a1＜1＜a2＜1.5；在针对所述i组标定混合物建立预设孵育参数矩阵fi前，确定该组标定混合物在添加hrp标记蛋白前的抗原浓度r并计算标定混合物预设活性值ei与抗原浓度r之间的比值b，设定b=ei/r，若b1＜b＜b2，则不对该组标定混合物的预设孵育温度ti进行修正，若b≤b1，则使用a1对该组标定混合物的预设孵育温度ti进行修正，修正后的预设孵育温度为tia，设定tia=ti
×
a1，若b≥b2，则使用a2对该组标定混合物的预设孵育温度ti进行修正，修正后的预设孵育温度为tib，设定tib=ti
×
a2。
34.具体而言，本发明所述固相载体为聚苯乙烯板，在聚苯乙烯板上设有多个凹孔，用以装载各组抗原。
35.至此，已经结合附图所示的优选实施方式描述了本发明的技术方案，但是，本领域技术人员容易理解的是，本发明的保护范围显然不局限于这些具体实施方式。在不偏离本发明的原理的前提下，本领域技术人员可以对相关技术特征做出等同的更改或替换，这些更改或替换之后的技术方案都将落入本发明的保护范围之内。
36.以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明；对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。