一种香辛料中7种兴奋剂的检测方法与流程

1.本发明属于食品中兴奋剂检测技术领域，具体为一种香辛料中7种兴奋剂的检测方法。


背景技术：

2.为维护竞技体育的公平和纯洁，保证运动员的身体健康，兴奋剂检测已成为所有体育比赛中不可或缺的重要环节。香辛料具有刺激性香味，利用植物的种子、花蕾、叶茎、根块等，或其提取物，赋予食物以风味，增进食欲，帮助消化和吸收，会在烹饪和中成药中使用。运动员在食用食品和药品过程中会存在误服误用的现象。
3.香辛料中含有7种常见的兴奋剂，即曲托喹酚、去甲乌药碱、罂粟碱、可待因、那可丁、吗啡、蒂巴因。在香辛料、调味料、火锅底料中都有含罂粟碱、可待因、那可丁、吗啡、蒂巴因的风险；曲托喹酚是一种植物源性成分，经研究发现在莲子、香叶、胡椒粉中含有大量的去甲乌药碱，近几年在我国频繁出现运动员去甲乌药碱阳性事件。
4.为了降低运动员误服的风险，在香辛料中检测这7种成分刻不容缓。因此为了满足这7种兴奋剂检测的需要，技术人员尝试了高效液相色谱法(hplc)、气相色谱法(gc)、气相色谱-质谱联用(gc/msd)等方法进行检测，但是它们在检测过程中需要衍生化，会产生操作复杂、检测周期长、灵敏度较差等问题，使用更为先进的、灵敏度更高的气相色谱-质谱和液相色谱-质谱联用检测方法也不能对消除这些问题。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种香辛料中7种兴奋剂的检测方法，解决了目前无法同时测定香辛料中7种兴奋剂的难题。
6.本发明是通过以下技术方案来实现：
7.一种香辛料中7种兴奋剂的检测方法，所述的兴奋剂为曲托喹酚、去甲乌药碱、罂粟碱、可待因、那可丁、吗啡和蒂巴因，包括如下步骤：
8.步骤1，在待测样品中加入所述7种兴奋剂对应的同位素内标中间液，之后用去离子水和甲酸的乙腈溶液提取，从得到的提取液中分离出第一上清液，将提取液的剩余部分用相同的方式进行提取，与第一上清液合并得到第二上清液，然后加入无水硫酸镁进行涡旋振荡、离心，得到第三上清液，将第三上清液吹近干，用乙腈、甲酸和水形成的混合溶液溶解，最后过滤，得到待测液；
9.步骤2，将待测液用高效液相色谱串联质谱仪进行测定，得到相应的谱图信息；将由所述7种兴奋剂的混合标准中间液和与所述7种兴奋剂对应的同位素内标混合中间液用空白基质溶液配制的混合标准工作液，用与待测液相同的条件进行测定，得到相应的谱图信息；
10.步骤3，将步骤2形成的两组谱图信息进行比对，得到所述待测液和混合标准工作液中所有兴奋剂的色谱峰峰面积，以及混合标准工作液和所述待测液中对应的内标物的峰
面积；
11.步骤4，结合混合标准工作液中待测组分的含量与峰面积、以及待测液中待测组分的峰面积、待测样品质量、去离子水和甲酸的乙腈溶液的总体积、稀释倍数，采用基质外标法，求出去甲乌药碱、曲托喹酚、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的含量；
12.结合混合标准工作液中待测组分的含量与峰面积、内标物的峰面积与浓度，以及待测液中内标物的浓度与峰面积、待测液中待测组分的峰面积、待测样品质量、去离子水和甲酸的乙腈溶液的总体积、稀释倍数，采用基质内标法，求出吗啡和可待因的含量。
13.优选的，步骤1中所述的待测样品为固体样品、半固体样品或液体样品，固体样品经粉碎后混匀得到，半固体样品或液体样品经搅拌均匀后得到。
14.优选的，步骤1中所述的待测样品、同位素内标中间液、去离子水和甲酸的乙腈溶液的比例为(1.99-2.01)g：0.075ml：(1-3)ml：15ml。
15.优选的，步骤1将所述的同位素内标中间液加入到待测样品中后，先加去离子水涡旋10-20s，再加入甲酸的乙腈溶液涡旋混匀后，振荡提取10-15min，之后超声提取10-15min，最后在6000-8000r/min下离心4-6min，得到第一上清液。
16.优选的，步骤1中加入的无水硫酸镁与待测样品的质量比为(3-5)g：(3-5)g，加入无水硫酸镁后涡旋振荡1-2min，之后在6000-8000r/min下离心4-6min，得到第三上清液。
17.优选的，步骤2中的高效液相色谱采用c18色谱柱，流动相a为甲酸的水溶液，甲酸的体积占整个溶液体积的0.1％，流动相b为乙腈，梯度洗脱程序如下：
18.0-1min内，流动相a的体积比例保持95％；1-2min内，流动相a的体积比例由95％线性减小至80％；2-3min内，流动相a的体积比例由80％线性减小至40％；3-4min内，流动相a的体积比例由40％线性减小至20％；4-8.5min内，流动相a的比例由20％线性减小至10％，8.5-10.5min内，流动相a的比例保持10％，10.5-11min内，流动相a的比例由10％线性增加至95％，11-15min内，流动相a的比例保持95％；
19.步骤2所述的质谱仪采用如下参数进行工作：
20.扫描方式为多反应监测，毛细管电压为3.5kv，鞘气温度为400℃，干燥器温度为300℃，鞘气流量为11l/min，干燥器流量为7l/min。
21.优选的，步骤2采用如下过程配制混合标准工作液：
22.用去离子水和甲酸的乙腈溶液对权利要求1步骤1所述待测样品对应的空白样品进行提取，从得到的提取液中分离出第四上清液，将提取液的剩余部分用相同的方式进行提取，与第四上清液合并得到空白基质溶液，分别移取所述7种兴奋剂对应的混合标准中间液和同位素内标混合中间液，用空白基质溶液稀释，得到混合标准工作溶液。
23.优选的，步骤2和步骤3中所述的谱图信息为色谱峰、定性离子对和每个离子的信噪比；
24.步骤3在进行谱图信息比对时，采用如下标准：
25.待测液中兴奋剂的保留时间与混合标准工作液中对应兴奋剂的保留时间偏差在
±
5％以内，且不超过0.5min；待测液中兴奋剂的定性离子对的相对离子丰度与混合标准工作液中对应兴奋剂的相对离子丰度一致，且每个离子的信噪比≥3。
26.优选的，步骤4采用如下公式求出去甲乌药碱、曲托喹酚、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的含量：
[0027][0028]
式中：
[0029]
xi为待测样品中各待测物的含量，单位为微克每千克；
[0030]
c为混合标准工作液中待测组分的含量，单位为纳克每毫升；
[0031]
a为待测液中待测组分的峰面积；
[0032]as
为混合标准工作液中待测组分的峰面积；
[0033]
v为去离子水和甲酸的乙腈溶液的总体积，单位为毫升；
[0034]
m为待测样品质量，单位为克；
[0035]
f为稀释倍数。
[0036]
优选的，步骤4采用如下公式求出吗啡和可待因的含量：
[0037][0038]
式中：
[0039]
xi为待测样品中各待测物的含量，单位为微克每千克；
[0040]
c为混合标准工作液中待测组分的含量，单位为纳克每毫升；
[0041]ci
为待测液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升；
[0042]
a为待测液中待测组分的峰面积；
[0043]asi
为混合标准工作液中内标物的峰面积；
[0044]
v为去离子水和甲酸的乙腈溶液的总体积，单位为毫升；
[0045]csi
为混合标准工作液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升；
[0046]ai
为待测液中内标物的峰面积；
[0047]as
为混合标准工作液中待测组分的峰面积；
[0048]
m为待测样品质量，单位为克；
[0049]
f为稀释倍数。
[0050]
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0051]
本发明一种香辛料中曲托喹酚、去甲乌药碱、罂粟碱、可待因、那可丁、吗啡和蒂巴因的检测方法，先在待测的香辛料样品中加入待检测7种兴奋剂对应的同位素内标中间液，之后用去离子水和甲酸乙腈溶液分别进行提取，可进一步可分离出上清液，提取液的剩余部分用相同的方式进行提取，合并后得到总的上清液，其中含有待检测的7种兴奋剂，然后再用无水硫酸镁进一步涡旋振荡、离心，将不需要的杂质去除，最后将得到的上清液吹干，得到含有这些成分的残渣，用乙腈、甲酸和水形成的混合溶液溶解，最后过滤得到待测液，再利用液相色谱串联质谱仪测定待测液和混合标准工作液中的兴奋剂，通过得到的谱图信息进行比对，可判断试样中存在相应的目标物，进而得到待测兴奋剂和对应内标物的峰面积，结合混合标准工作液中待测组分的含量与峰面积、以及待测液中待测组分的峰面积、待测样品质量、去离子水和甲酸的乙腈溶液的总体积、稀释倍数，采用基质外标法即可求出去甲乌药碱、曲托喹酚、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的含量；另外，再利用基质内标法，结合混合标准工作液中待测组分的含量与峰面积、内标物的峰面积与浓度，以及待测液中内标物的
浓度与峰面积、待测液中待测组分的峰面积、待测样品质量、去离子水和甲酸的乙腈溶液的总体积、稀释倍数，采用基质内标法，求出吗啡和可待因的含量。本发明前处理简单，分析时间短，灵敏度高，检测种类全面，能够保障体育赛事对兴奋剂检测的需要。
附图说明
[0052]
图1为本发明所述的7种兴奋剂混合标准溶液的总离子流图(10ng/ml)。
具体实施方式
[0053]
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0054]
本发明一种对香辛料中曲托喹酚、去甲乌药碱、罂粟碱、可待因、那可丁、吗啡和蒂巴因这7种兴奋剂进行检测的方法，包括以下步骤：
[0055]
步骤1)标准溶液的制备
[0056]
1，标准储备液：
[0057]
a)去甲乌药碱标准储备液：准确称取适量去甲乌药碱标准物质(精确至0.01mg)，用甲醇溶解，配制成1mg/ml的标准储备液，于-18℃以下避光冷冻保存。
[0058]
b)曲托喹酚标准储备液：准确称取适量盐酸曲托喹酚标准物质(精确至0.01mg)，用乙腈溶解，配制成1mg/ml的标准储备液，于-18℃以下避光冷冻保存。
[0059]
c)罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡、可待因的混合标准储备液(商品化的混合标准储备液)：罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡、可待因的浓度分别为10mg/l、10mg/l、10mg/l、50mg/l、50mg/l。
[0060]
2，混合标准中间液：
[0061]
分别移取去甲乌药碱标准储备液、曲托喹酚标准储备液和罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡、可待因的混合标准储备液适量于10ml容量瓶中，用甲醇分别稀释至刻度，配成曲托喹酚、去甲乌药碱、罂粟碱、可待因、那可丁、吗啡和蒂巴因浓度均为100ng/ml-500ng/ml的混合标准中间液。现配现用。
[0062]
3，同位素内标混合储备液：
[0063]
(商品化的同位素内标混合储备液)：吗啡-d3,可待因-d3浓度均为20μg/ml。
[0064]
4，同位素内标混合中间液(吗啡-d3,可待因-d3)：
[0065]
精确移取同位素内标混合储备液1ml于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，吗啡-d3、可待因-d3浓度均为2μg/ml。现配现用。
[0066]
5，混合标准工作液：
[0067]
分别准确移取适量的混合标准中间液和同位素内标混合中间液，用空白基质溶液稀释成标准工作溶液，现配现用。
[0068]
空白基质溶液：选取不含待测物的样品，按照步骤3进行提取(不添加同位素内标混合工作液)，得到的空白基质溶液。
[0069]
步骤2，试样制备
[0070]
取所有待测固体样品(＞50g)，置于粉碎机中粉碎混匀；取所有半固体样品(＞50g)，置于塑料烧杯中，搅拌均匀成匀浆；取所有待测液体样品(＞50g)，置于玻璃烧杯中，
搅拌均匀。制备好的所有样品均分成两份，密封并标明标记，0-4℃条件下保存。
[0071]
步骤3试样提取，
[0072]
称取上述固体样品、半固体样品或液体样品1.99-2.01g于50ml离心管中，加入75μl上述同位素内标混合工作液，加1-3ml去离子水，涡旋10-20s，加入15.0ml甲酸体积占比为1％的甲酸乙腈溶液，涡旋混匀后，振荡提取10min，再超声提取10-15min，之后6000-8000r/min离心5min，取上清液于另一50ml离心管，剩余部分重新加入15.0ml1％甲酸乙腈溶液，重复提取一次，合并上清液，加3-5g无水硫酸镁，立即涡旋振荡1-2min，再6000-8000r/min离心5min，取上清液2.0ml，于35-45℃下氮吹近干，准确加入1.0ml甲酸、乙腈和水的混合液溶解后定容，该混合液中甲酸：乙腈：水的体积比为0.1：5：94.9，乙腈水溶液中乙腈的体积浓度为5％，过0.22μm尼龙微孔滤膜，得到待测液上机测定。
[0073]
步骤4，液相色谱-串联质谱仪测定
[0074]
1，色谱条件
[0075]
a)色谱柱：c18(粒径：5μm，规格为2.0mm
×
150mm)；
[0076]
b)柱温：30℃；
[0077]
c)进样量：5μl；
[0078]
d)流速：0.3ml/min
[0079]
e)流动相：a相：甲酸体积浓度为0.1％的水溶液，b相：乙腈，梯度洗脱程序见表1。
[0080]
表1色谱柱的梯度洗脱程序
[0081]
时间(min)a(％)b(％)095519552802034060420808.5109010.510901195515955
[0082]
2，质谱参考条件
[0083]
a)离子源：电喷雾离子源(esi)；
[0084]
b)扫描方式：正离子扫描(esi )，多反应监测(简写为mrm)；
[0085]
c)喷雾电压：3.5kv；
[0086]
d)鞘气温度：400℃；
[0087]
e)干燥气温度：300℃；
[0088]
f)鞘气流量：11l/min；
[0089]
g)干燥气流量：7l/min；
[0090]
通过以上方法，得到了如表2所述的这7种兴奋剂的相关数据。
[0091]
表2 7种兴奋剂的相关数据
[0092][0093]
步骤5，含量测定
[0094]
a，定性测定
[0095]
根据试样中目标物的含量情况，选择浓度一致的混合标准工作液按照上述条件用色谱柱及其相应的梯度洗脱程序进行液相色谱-串联质谱仪分析。若检测的色谱峰对应的保留时间与混合标准工作液的保留时间偏差在
±
5％以内，且不超过
±
0.5min；质谱得到的定性离子对的相对离子丰度与混合标准工作液的相对离子丰度一致，相对离子丰度的偏差不超过表3的规定，且每个离子的信噪比≥3，则可判断样品中存在相应的目标物。
[0096]
表3定性测定时相对离子丰度的允许偏差
[0097]
相对离子丰度，％允许偏差，％＞50
±
2020～50
±
2510～20
±
30≤10
±
50
[0098]
10ng/ml的7种兴奋剂混合标准工作液的总离子流图如图1，可以看到峰型很好，说明可以将它们进行分离。
[0099]
b，定量测定
[0100]
根据试样中目标物的含量情况，选取浓度相近的混合标准工作液进行液相色谱-串联质谱仪分析。混合标准工作液和待测液中目标物的响应值均应在仪器线性响应范围内，如表2所示。以峰面积之比做单点校正定量。
[0101]
c，空白试验
[0102]
除不加试样外，均按上述测定步骤进行。
[0103]
d，结果计算和表述
[0104]
去甲乌药碱、曲托喹酚、罂粟碱、那可丁、蒂巴因，采用基质外标法定量，按照(1)式计算，计算结果需扣除空白值。
[0105][0106]
xi为试样中各待测物的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
[0107]
c为混合标准工作液中待测组分的含量，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
[0108]
a为待测液中待测组分的峰面积；
[0109]as
为混合标准工作液中待测组分的峰面积；
[0110]
v为样液的提取体积，此处为30，单位为毫升(ml)；
[0111]
m为样品的称样量，单位为克(g)；
[0112]
f为稀释倍数，此处为0.5。
[0113]
吗啡、可待因采用基质内标法定量，按照(2)式计算，计算结果需扣除空白值。
[0114][0115]
式中：
[0116]
xi为试样中各待测物的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
[0117]
c为混合标准工作液中待测组分的含量，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
[0118]ci
为待测液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
[0119]
a为待测液中待测组分的峰面积；
[0120]asi
为混合标准工作液中内标物的峰面积；
[0121]
v为样液的提取体积，此处为30，单位为毫升(ml)；
[0122]csi
为混合标准工作液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
[0123]ai
为待测液中内标物的峰面积；
[0124]as
为混合标准工作液中待测组分的峰面积；
[0125]
m为样品的称样量，单位为克(g)；
[0126]
f为稀释倍数，此处为0.5。
[0127]
用重复条件下获得两次独立测定结果的算数平均值表示，计算结果保留三位有效数字。
[0128]
本发明在实际应用中，提取试样时，按以下步骤：
[0129]
称取固体样品制备的试样2g(准确至
±
0.01g)于50ml离心管中，加入75μl上述同位素内标混合储备液，加3ml去离子水，涡旋10s，加入15.0ml甲酸体积占比为1％的甲酸乙腈溶液，涡旋混匀后，振荡提取10min，再超声提取10min，6000r/min离心5min，取上清液于另一50ml离心管，剩余部分重新加入15.0ml甲酸体积占比为1％的甲酸乙腈溶液，重复提取一次，合并上清液，加3g无水硫酸镁，立即涡旋振荡1min，之后6000r/min离心5min，取上清液2.0ml，于40℃下氮吹近干，准确加入1.0ml甲酸：乙腈：水的体积比为0.1：5：94.9的甲酸、腈和水的混合溶液溶解后定容。过0.22μm尼龙微孔滤膜。
[0130]
方法实际应用结果
[0131]
使用本发明建立的方法对从陕西省各地抽取的10批次市售香辛料进行检测分析，结果去甲乌药碱检出3批次不合格，其它项目均未检出，剩余7批次7种兴奋剂项目均未检出。详见表4。
[0132]
表4检出样品的种类及结果
[0133][0134]
在空白辣椒面、芥末油、芥末等样品中分别添加150μl混合标准工作液和75μl同位素内标混合工作液，使样品中化合物浓度分别为定量限，进行回收率测定，平行做6次，按照上述试样提取方法进行处理并上机测定，得到本方法的回收率及精密度。
[0135]
结果表明芥末中7种化合物的回收率范围为74.3％～100.0％，精密度(用相对标准偏差rsd表示)为1.4％～3.4％；辣椒面7种化合物的回收率范围为63.6％～96.0％，rsd为3.0％～8.1％；芥末油中7种化合物的回收率范围为64.1％～98.4％，rsd为3.8％～12.8％，其中芥末中7种兴奋剂回收率及精密度的详细结果如表5所示。
[0136]
表5芥末中7种化合物的回收率及精密度
[0137][0138]
实验结果表明，该方法回收率均能够在国家现行有效标准gb/t 27404－2008中规定的60％～120％内，精密度均在20％以内，表明该方法具有良好的准确度和精密度。该方法在实际应用中，检测效果良好，可用于芥末等香辛料中7种兴奋剂的检测。
[0139][0140]