MOGS抑制剂在制备促周围神经再生药物中的应用的制作方法

mogs抑制剂在制备促周围神经再生药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，特别涉及mogs抑制剂在制备调节周围神经再生药物中的应用。


背景技术：

2.周围神经损伤是临床上常见的神经损伤类型之一，相比于中枢神经系统，周围神经系统具有一定内源性再生能力，但损伤后神经元轴突的再生和功能恢复效果并不理想，因此探索安全有效的修复手段一直是临床研究的重点。周围神经再生过程由一系列细胞事件组成，包括神经胶质细胞的重新编程、细胞毒性自然杀伤细胞的浸润、巨噬细胞的激活、内皮细胞形成内皮小管和神经元细胞的轴突延伸。由于神经再生和伤口修复是高耗能的过程，所以这些生物进程的发生和发展依赖于旺盛的细胞代谢。例如，主要细胞代谢调节剂mtor和akt激酶是神经元轴突再生的重要增强因子；巨噬细胞代谢增强可以刺激巨噬细胞活化，促进周围神经再生；施万细胞是周围神经中独特的胶质细胞，其代谢改变影响周围神经的髓鞘形成和成熟。此外，施万细胞还通过操纵糖酵解来调节受损轴突的命运，并通过轴突-胶质细胞代谢偶联来维持轴突的完整性。
3.除了糖酵解代谢，胶质细胞的脂质代谢在轴突生长和周围神经再生中也发挥着重要作用。周围神经损伤后，卫星胶质细胞(位于背根神经节周围的胶质细胞)中许多脂质代谢相关基因的表达上调。卫星胶质细胞中脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,fasn)的条件性缺失会损害神经突起的生长并阻碍轴突的延伸。在受损的周围神经段中，还发现脂质代谢相关的经典信号通路的激活和代谢相关基因的上调。
4.甘露糖基低聚糖葡萄糖苷酶(mannosyl-oligosaccharide glucosidase,mogs)，也称为gcs1，是一种位于内质网内腔的蛋白质，可以对n-连接低聚糖的加工进行催化。mogs还能够减轻内质网应激并抑制内质网应激相关脂肪生成基因(如fasn)的升高，表明其在脂质代谢中的关键作用。


技术实现要素：

5.本发明研究发现编码甘露糖基低聚糖葡萄糖苷酶(mogs)的基因mogs在损伤的大鼠坐骨神经中存在显著变化。干扰mogs的表达会影响施万细胞的表型，这意味着mogs在周围神经损伤再生中起着关键作用。本发明首次揭示了mogs与施万细胞增殖、迁移和分化之间的关系，证明了mogs能通过调节施万细胞的表型调控周围神经损伤后再生。
6.本发明具体技术方案如下：mogs在制备促周围神经损伤再生调控药物中的应用。
7.mogs基因在人和大鼠间相对保守，所述mogs核苷酸序列如seq id no:1所示。
8.本发明所述的应用，以mogs作为靶点设计基因水平或蛋白水平抑制mogs表达的抑制剂，所述mogs抑制剂能够促进施万细胞的增殖、迁移和分化。
9.本发明一个示例，所述抑制剂是mogs基因的小干扰rna(sirna)。
10.小干扰rna(sirna)是化学修饰的专门针对细胞中特异性的靶基因的抑制剂，在本发明中使用了靶基因mogs的mrna目的片段的反义核酸。双链sirna的正义链核苷酸序列为5’gtctatttcggcatgaaga 3’(seq id no:2)、5'tcggcaacatatctatgat 3'(seq id no:4)或5’gtaaagagccacctaaaca 3’(seq id no:6)。本发明另一目的在于提供上述mogs抑制剂在制备促进施万细胞增殖、迁移、分化和治疗神经损伤相关疾病药物中的应用。
11.施万细胞是周围神经系统中特有的神经胶质细胞，作为周围神经中数量最多的细胞群，可为神经元提供必要的物理和营养支持，并围绕轴突形成髓鞘，对维持周围神经的正常生理功能十分重要。周围神经受到损伤后，施万细胞开始大量增殖，随后增殖的细胞开始迁移形成条索，引导新生轴突延伸，并进行再分化包绕轴突形成新的髓鞘。这些生物学过程依赖于细胞内的代谢调节，施万细胞的表型可以被代谢过程相关因子所调节。当神经遭受损伤后，加速施万细胞增殖、迁移和分化将有益于神经再生和功能恢复。
12.为了评价mogs在周围神经再生中的生物学功能，本发明检测了大鼠坐骨神经损伤后受损神经段中mogs基因的表达，发现坐骨神经损伤后mogs的基因表达显著升高(图1)。进一步培养并获得了高纯度的原代大鼠施万细胞，采用针对mogs的sirna片段转染培养的施万细胞，利用体外分化实验、edu增殖实验、transwell迁移实验、划痕愈合实验和活细胞动态成像实验发现，sirna-mogs具有促进施万细胞体外分化、增殖和迁移能力(图2、图3和图4)。
13.本发明所述mogs可以直接作为药物的靶点设计其抑制剂，通过与药物的相互作用，抑制机体mogs的表达，进而发挥调节周围神经再生的作用。
14.本发明的优点：本发明研究表明，mogs的抑制剂能够影响施万细胞的行为，从而促进周围神经再生，可以广泛用于临床上有促进周围神经再生需求疾病的治疗。由于很多大分子药物不能进入神经内发挥作用，而小干扰rna由于分子较小，容易通过血脑和血神经屏障；另外还可以有效的避免某些促神经再生的因子直接应用而引起的副作用。
附图说明
15.图1周围神经损伤后mogs的表达模式。(图1a为测序数据中坐骨神经损伤后0天、1天、4天和7天神经损伤段中mogs随时间的表达变化；图1b为real-time rt-pcr定量测定坐骨神经损伤后0、1、4、7和14天坐骨神经中mogs的相对表达水平。)图2为体外抑制mogs表达对施万细胞分化的影响。(图2a为sirna-mogs三个不同干扰片段在施万细胞中的敲降效率；图2b为采用db-camp和hrg刺激施万细胞体外分化后p0和p75的表达变化；图2c为在施万细胞体外分化模型中转染sirna-mogs可增加p0的表达丰度，降低p75的表达丰度。)图3为体外抑制mogs表达对施万细胞增殖效率的影响。(图3a为sirna对照和sirna-mogs转染施万细胞的典型edu增殖图像，红色代表edu标记的增殖细胞，蓝色为hoechst 33342染色的细胞核；图3b为归一化平均增殖率统计图。)图4为体外抑制mogs表达对施万细胞迁移效率的影响。(图4a&b为sirna对照和sirna-mogs转染施万细胞的典型transwell迁移图像和归一化平均迁移率统计，紫罗兰色代表发生迁移的施万细胞；图4c&d为sirna对照和sirna-mogs转染施万细胞后代表性划痕愈合图像和空白区域面积的统计；图4e&f为sirna对照和sirna-mogs转染施万细胞后活细
胞成像拍摄细胞平均迁移距离和平均迁移速率的统计图。)
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
16.在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
17.下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
18.在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
19.下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
20.实施例1mogs的抑制剂和抑制剂对照均由广州市锐博生物科技有限公司合成。序列如下：sirna-mogs-1：5’gtctatttcggcatgaaga 3’(seq id no:2)；3’cagataaagccgtacttct 5’(seq id no:3)；sirna-mogs-2：5'tcggcaacatatctatgat 3'(seq id no:4)；3'agccgttgtatagatacta 5'(seq id no:5)；sirna-mogs-3：5’gtaaagagccacctaaaca 3’(seq id no:6)；3'catttctcggtggatttgt 5'(seq id no:7)。
21.抑制剂对照为无意义随机序列。
22.实施例2大鼠坐骨神经夹伤实验取健康成年雄性sd大鼠(180-220g)，腹腔内注射复合麻醉剂，暴露坐骨神经，构建大鼠左后肢坐骨神经3mm夹伤模型，分别在夹伤后0、1、4、7和14天收集大鼠坐骨神经损伤段，取材神经段保留坐骨神经夹伤处3mm及上下各1mm组织，液氮速冻储存。
23.实施例3施万细胞培养和转染取新生1天的sd大鼠的坐骨神经，剥除血管膜后将神经组织剪碎，加入1ml 3mg/ml胶原酶i，于37℃水浴中消化30min。去除胶原酶加入0.25％的胰酶1ml，37℃水浴消化5-10min后加入3ml完全培养基终止消化，用移液器轻柔吹打至肉眼基本看不到组织块。离心(800rpm
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5min、常温)，弃上清，用完全培养基清冼两次，以1
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106个/ml的细胞密度种至预先用pll包被中皿中，放入37℃、5％co2培养箱中。培养24h后换成含有10mm阿糖胞苷的完全培养基。继续培养36h-48h后，pbs清洗2遍，换成含有2μm forskolin和10ng/ml hrg的完全培养基，每3-4d换一次液。待细胞长至融合时，弃去培养皿中的培养基，用pbs清冼两遍，加入0.25％的胰酶，轻轻摇晃，使消化液流遍所有细胞表面，镜下观察发现细胞胞体回缩，细胞间隙增大后，加入2ml完全培养基终止消化，吹散后用完全培养基清冼2遍，加入anti-thy1.1(1：1000)冰上孵育2h，离心弃上清，加入含有250μl rabbit complement和750μl dmem培养液(1：3)的混合液，37℃孵育45min。完全培养基清冼2遍后吹散细胞以2-4
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105个/ml的密度种至预先pll包被好的培养皿中，并放入培养箱。培养24h后换成含有2μm forsokolin和10ng/ml hrg的完全培养基，每隔2-3d换一次液，待细胞长满培养皿即可使用。化学合成的mogs抑制剂和抑制剂对照物由ribobio technlogy(中国广州)合成，转染使用lipofectamine rnaimax试剂(invitrogen，carlsbad，ca，usa)，根据说明书操作。
24.实施例4real-time rt-pcr(qrt-pcr)从坐骨神经损伤段和体外培养的施万细胞中提取总rna，采用oligo dt primer(invitrogen)进行逆转录。real-time rt-pcr采用sybr green premix ex taq(takara)在applied biosystems stepone real-time pcr system上进行操作。mogs,p0和p75基因特异性引物序分别由一对qrt-pcr引物组成，序列如下：mogs(forward)：5
’‑
cttctgccaccaaccactcc-3’(seq id no:8)；mogs(reverse)：5
’‑
ccaggcaagccaaggtatcg-3’(seq id no:9)；p0(forward)：5
’‑
cgtgatcggtggcatcctc-3’(seq id no:10)；p0(reverse)：5
’‑
ggcatacagcactggcgtct-3’(seq id no:11)；p75(forward)：5
’‑
ctgctgattctagggatgtcct-3’(seq id no:12)；p75(reverse)：5
’‑
atgtaacactgtccaggcagg-3’(seq id no:13)。
25.qrt-pcr反应程序：95℃预变性2min；40个pcr循环(95℃，5s；60℃，10s)，在每个循环的延伸阶段收集荧光值；pcr扩增反应结束后，进行产物的溶解曲线分析，以确保pcr产物的质量。用δδct法分析结果，ct设为反应达到域值时的循环数，则每个基因相对于标准内参的表达量可以用方程2-δδct
表示，所有反应设置三个复孔，gapdh作为内参。
26.结果如图1b所示，坐骨神经损伤后0、1、4、7和14天，坐骨神经中mogs的相对表达水平持续上调，与图2a测序数据中mogs的表达趋势一致，表明mogs对施万细胞的表型存在潜在的调节作用。
27.结果如图2a所示，结果显示转染mogs抑制剂(si-mogs)的施万细胞中mogs的相对表达量明显低于抑制剂对照(si-ctr)组，结果表明本发明设计的mogs抑制剂能够抑制mogs的表达。
28.实施例5施万细胞体外分化实验取实施例3所获得的施万细胞构建施万细胞体外分化模型，通过添加hrg和camp体外诱导施万细胞分化。对照组的细胞种在含5％胎牛血清和1％的青霉素和链霉素的dmem/f12培养基中。分化组细胞培养基中另外加入20ng/ml hrg和1mm db camp(sigma,st louis,mo)。每天更新培养基，连续培养细胞3天。采用qrt-pcr检测施万细胞中p0和p75的表达丰度。
29.如图2b所示，采用施万细胞体外分化培养基刺激细胞后，与对照组相比，分化刺激后的施万细胞中髓鞘相关蛋白p0(p0阳性细胞特异性分化成施万细胞)表达明显升高，而p75(p75阳性细胞具有多向分化潜能)的表达丰度显著降低。图2c为将转染mogs抑制剂或抑制剂对照的施万细胞培养在分化培养基中，以检测其对施万细胞分化的影响，结果显示，与转染抑制剂对照组的细胞相比，转染mogs抑制剂的施万细胞中p0的表达量相对较高，而p75的表达量相对较低，表明mogs抑制剂促进施万细胞分化。
30.实施例6细胞edu增殖实验取实施例3所获的施万细胞(3
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103个)重悬于100μl完全培养基中，并接种到经多聚l-赖氨酸包被的96孔板上。加入100μm edu，并于12小时后用4％多聚甲醛固定。根据cell-light edu dna cell proliferation kit(ribibio)说明书进行操作。分别统计edu阳性细胞和总细胞数，计算edu阳性细胞数与总细胞数的比值，确定细胞增殖速率。
31.图3a为高倍显微镜下细胞edu增殖图像(比例尺为50μm)，图3b为转染mogs抑制剂
的施万细胞的增殖速率统计，结果显示，转染mogs抑制剂的施万细胞的增殖速率高于抑制剂对照组，结果表明mogs抑制剂能促进施万细胞的增殖。
32.实施例7transwell迁移实验transwell小室的下室表面包被fibronectin，收取实施例3转染mogs抑制剂和抑制剂对照的施万细胞，用dmem培养基调整细胞密度为1
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104个/ml，在transwell上室中加入100μl细胞悬液。下室加入500μl含10％胎牛血清的完全培养基。常规培养24小时后结晶紫染色，染色后leica dc300f正置显微镜进行观察和拍照，随机选取10个视野计数细胞个数。最后用33％冰醋酸将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm，测其od值，间接反映迁移细胞数。
33.图4a为高倍显微镜下细胞迁移实验图(比例尺为50μm)，图4b为转染mogs抑制剂的施万细胞的迁移速率统计，结果显示，转染mogs抑制剂的施万细胞的迁移速率高于抑制剂对照组，结果表明mogs抑制剂能促进施万细胞的迁移。
34.实施例8细胞划痕愈合实验取实施例3获得的施万细胞，调整细胞密度为2
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105个/ml，接种到置于6孔板中的1mm宽的模型室中。在移除模型室后的0h和9h分别拍摄相对空白区域，并采用image pro plus(media cybernetics,rockville,md,usa)来统计相对空白区域的面积。
35.图4c为高倍显微镜下细胞划痕实验图(比例尺为100μm)，图4d为转染mogs抑制剂的施万细胞的迁移速率统计，结果显示，转染mogs抑制剂的施万细胞的迁移速率高于抑制剂对照组，结果表明mogs抑制剂能促进施万细胞的迁移。
36.实施例9活细胞成像实验取实施例3获得的施万细胞，调整细胞密度为10
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104个/ml，接种到活细胞成像专用培养皿nunc
tm lab-tek
tm chamber(thermofisher scientific,waltham,ma,usa)中，在olympus ix81(olympus,tokyo,japan)显微镜下拍摄施万细胞活动延时图像，在12小时的观察期间，每5分钟拍摄一次图像，采用xcellence sequence(olympus)软件和image j(national institutes of health,bethesda,md,usa)软件分别对延时摄影图像进行分析，测定施万细胞的移动距离和移动速率。
37.图4e为xcellence sequence软件分析活细胞成像测定施万细胞在延时拍摄期间的移动距离，结果显示，转染mogs抑制剂的施万细胞的迁移距离大于抑制剂对照组。图4f为imagej软件分析施万细胞平均迁移速率统计图，结果显示，转染mogs抑制剂的施万细胞的迁移速率快于抑制剂对照组。结果表明mogs抑制剂能加快施万细胞的移动速率。