快速定量检测三七皂苷的方法与流程

1.本发明涉及化学分析测试领域，具体而言，涉及快速定量检测三七皂苷的方法。


背景技术：

2.三七[panax notoginseng(burk.)f.h.chen]为五加科人参属植物，味甘、微苦、性温，是我国特有的名贵中药材，具有散瘀止血，消肿定痛、止血、降脂和保护肝脏等功效(国家药典委员会,2015)。在中医药行业中，三七已成为仅次于人参的中药材大品种，是云南白药、复方丹参滴丸、血塞通等中成药品种的主要原材料(李品汉,2016；李倩,2018；赵娜娜et al.,2018)。据统计，全国以三七为原料的中成药品种有540多种，药品批号3600多个，涉及制药企业1350多家(刘立红et al.,2017)。三七总皂苷(pnss)在中医药中起着重要的作用，是三七主要的功效成分。越来越多的体内和体外研究表明，pnss广泛用于治疗各种疾病，如动脉粥样硬化、急性肺损伤、癌症和心血管疾病(xu et al.,2014；chen et al.,2016；fan et al.,2016；liao et al.,2016；yang et al.,2016；huang et al.,2017；jin et al.,2017；kitamura et al.,2017；ratno budiarto and chan,2017；tian x.-p.et al.,2017)。然而三七品质定量检测技术比较滞后，主流上仍以《药典》2015版中通过薄层色谱法定性检测三七皂苷r1、人参皂苷rg1、rb1和re，液相色谱法定量检测三七皂苷r1、人参皂苷rg1和rb1，且三者的总量不得少于5％。该方法的样品前处理方法操作繁琐、且耗时，大约需要14小时，液相检测时间也需要1个小时，大大制约了三七品质的检测效率。专利文献cn 109061001a公开了一种采用液相色谱-质谱法检测血浆中人参皂苷的方法，不适用于三七品质检测。现有技术通过uplc-ms/ms法检测三七中的多种皂苷，但仪器操作要求高，且仪器本身成本非常高，不适用于基层市场推广的检测。


技术实现要素：

[0003]
本发明旨在建立一种三七种皂苷的快速定量检测方法，适用于三七多样化产品的检测，不仅包括以三七根为主的三七粉，三七饮片等，还有三七花，三七叶为原料的产品的品质检测。
[0004]
本发明提供的一种三七中的皂苷的快速定量检测方法，包括：
[0005]
用甲醇提取三七样品，获得所述三七样品的甲醇提取液；以及
[0006]
采用超高效液相色谱-二极管阵列检测器系统分析所述三七样品的甲醇提取液；
[0007]
所述超高效液相色谱的条件如下：所述超高效液相色谱采用acquity uplc@beh-c18色谱柱(1.7um
×
2.1
×
50mm)；所述超高效液相色谱的条件如下：流动相a：甲醇，流动相b：水；梯度洗脱：0-5min，20％a；5-10min,20％a-45％a；所述二极管矩阵检测器的采集波长为203nm。
[0008]
其中，所述流动相的流速为0.25ml/min。
[0009]
其中，所述色谱柱的柱温为30℃。
[0010]
其中，所述二极管矩阵检测器的光电分离度为1.2nm，采样速率为10pt/s。
[0011]
其中，所述三七中的皂苷为三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、人参皂苷re、人参皂苷rc、人参皂苷rb3、人参皂苷rd、人参皂苷rg2中一种或几种。
[0012]
其中，用甲醇提取三七样品时进行超声处理。
[0013]
其中，所述超高效液相色谱中使用酸枣皂苷b作为内标。
[0014]
其中，所述超高效液相色谱中使用三七皂苷r1标准曲线、人参皂苷rg1标准曲线、人参皂苷rb1标准曲线、人参皂苷re标准曲线、人参皂苷rc标准曲线、人参皂苷rb3标准曲线、人参皂苷rd标准曲线和人参皂苷rg2标准曲线。
[0015]
本发明的三七中皂苷的快速定量检测方法除了能检测《药典》2015版要求的4种皂苷三七皂苷r1、人参皂苷rg1、rb1和re的基础上，还可检测三七地上部分的特征人参皂苷rc和rb3以及三七皂苷rd和稀有皂苷rg2，因此能够检测共计8种三七皂苷。本发明的三七中皂苷的快速定量检测方法能够同时检测三七样本中的8种三七皂苷，检测结果精确可靠。
[0016]
本发明的三七中皂苷的快速定量检测方法，利用超高效液相色谱-光电二极管矩阵检测器(uplc-pda)系统，并结合超声快速提取皂苷技术，大大节省了检测时间，样品前处理时间加检测时间，共计20min，远远小于《药典》2015版中的15h，且整体操作简单，适用于推广检测。
附图说明
[0017]
图1示出了使用beh hilic 1.7um 2.1x100mm色谱柱的色谱图；
[0018]
图2示出了使用acquity uplcrhss t31.8um2.1x100mm色谱柱的色谱图；
[0019]
图3示出了使用acquity uplc@beh-c18色谱柱(1.7um
×
2.1
×
50mm)色谱柱的色谱图；
[0020]
图4示出了采用梯度洗脱1)的色谱图；
[0021]
图5示出了采用梯度洗脱2)的色谱图；
[0022]
图6示出了采用梯度洗脱3)的色谱图；
[0023]
图7示出了采用193nm检测波长的色谱图；
[0024]
图8示出了采用203nm检测波长的色谱图；
[0025]
图9示出了采用213nm检测波长的色谱图；
[0026]
图10示出了采用223nm检测波长的色谱图；
[0027]
图11示出了针对混合标品溶液1通过uplc-pda测定的9种皂苷的色谱图；
[0028]
图12示出了针对混合标品溶液2通过uplc-pda测定的9种皂苷的色谱图；
[0029]
图13示出了三七皂苷r1的标准曲线；
[0030]
图14示出了人参皂苷rg1的标准曲线；
[0031]
图15示出了人参皂苷re的标准曲线；
[0032]
图16示出了人参皂苷rb1的标准曲线；
[0033]
图17示出了人参皂苷rc的标准曲线；
[0034]
图18示出了人参皂苷rg2的标准曲线；
[0035]
图19示出了人参皂苷rb3的标准曲线；
[0036]
图20示出了人参皂苷rd的标准曲线；
[0037]
图21示出了酸枣皂苷b的标准曲线；
[0038]
图22示出了三七根样品的色谱图；和
[0039]
图23示出了三七叶样品的色谱图。
具体实施方式
[0040]
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0041]
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0042]
三七中皂苷的快速定量检测方法的建立
[0043]
标准曲线配制
[0044]
分别精确称取20mg皂苷标品(皂苷标品分别为：三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、人参皂苷re、人参皂苷rc、人参皂苷rb3、人参皂苷rd、人参皂苷rg2、酸枣皂苷b)，溶于200μl甲醇中，制成单标品的储存液，置于-20℃保存。性质与三七皂苷相似的酸枣皂苷b作为内标物，保证建立的三七中皂苷的快速定量检测方法批次间的准确性。
[0045]
浓度计算公式：c＝m*b/v(c表示溶液浓度；m表示标品质量；b表示标品纯度；v表示溶剂体积)。然后将储存液依次梯度稀释至1000μg/ml、400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml的系列标准曲线工作液。其中以酸枣皂苷b为内标物，标准曲线工作液的配制重复上述方法。
[0046]
混合标品溶液
[0047]
分别精确称取三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、人参皂苷re、人参皂苷rc、人参皂苷rb3、人参皂苷rd、人参皂苷rg2、酸枣皂苷b，将其全部溶于200μl甲醇中制成每种皂苷标品浓度均为400μg/ml的混合标品溶液1。
[0048]
分别精确称取三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、人参皂苷re、人参皂苷rc、人参皂苷rb3、人参皂苷rd、人参皂苷rg2、酸枣皂苷b，将其全部溶于200μl甲醇中制成每种皂苷标品浓度均为25μg/ml的混合标品溶液2。
[0049]
仪器方法
[0050]
利用400μg/ml的混合标品溶液1作为样品对色谱柱、洗脱条件和检测条件进行优化。
[0051]
采用仪器waters acquity uplc。色谱柱分别使用：acquity uplc@beh-c18色谱柱(1.7um
×
2.1
×
50mm)、beh hilic 1.7um2.1x100mm和acquity uplcrhss t3 1.8um 2.1x100mm。流动相a：乙腈，流动相b：水，流速0.25ml/min。上样量2ul。梯度洗脱分别为1)0-7min，20％a；7-13.5min,20％a-60％a；2)0-6min，20％a；6-13min,20％a-50％a；3)0-5min，20％a；5-10min,20％a-45％a。柱温30℃，光电二极管矩阵检测器(pda)的采集波长分别为193nm、203nm、213nm和223nm。分离度1.2nm。采样速率10pt/s。
[0052]
色谱柱
[0053]
使用beh hilic 1.7um 2.1x100mm色谱柱没有产生信号(图1)。使用acquity uplcrhss t3 1.8um 2.1x100mm色谱柱，人参皂苷rg1和人参皂苷re没有区分开，其他峰形前拖尾(图2)。使用acquity uplc@beh-c18色谱柱(1.7um
×
2.1
×
50mm)，人参皂苷rg1和人
参皂苷re基本分离，人参皂苷rc和人参皂苷rg2分离不好(图3)，但在真实样品中人参皂苷rc主要存在于三七茎叶中，而人参皂苷rg2主要为三七根部，不影响检测。因此，选择beh-c18色谱柱用于三七中皂苷的快速定量检测方法。
[0054]
洗脱条件
[0055]
采用梯度洗脱条件1(0-7min，20％a；7-13.5min,20％a-60％a)，后面五种皂苷出现重叠峰(图4)。采用梯度洗脱条件2(0-6min，20％a；6-13min,20％a-50％a)(图5)；人参皂苷rb3和人参皂苷rd未能区分开。采用梯度洗脱条件3(0-5min，20％a；5-10min,20％a-45％a)(图6)；8种皂苷基本分离。因此，选择梯度洗脱条件3用于三七中皂苷的快速定量检测方法。
[0056]
检测波长
[0057]
在四个检测波长193nm(图7)、203nm(图8)、213nm(图9)、223nm(图10)中，发现213nm波长下波形稳定，峰高较合适。因此，选择213nm检测波长用于三七中皂苷的快速定量检测方法。
[0058]
通过优化确定用于三七中皂苷的快速定量检测方法的仪器方法为：
[0059]
采用仪器waters acquity uplc；色谱柱acquity uplc@beh-c18色谱柱(1.7um
×
2.1
×
50mm)；流动相a：乙腈，流动相b：水；流速0.25ml/min；上样量2ul；梯度洗脱：0-5min，20％a；5-10min,20％a-45％a；柱温30℃；光电二极管矩阵检测器(pda)的采集波长分别为；213nm；分离度1.2nm；采样速率10pt/s。
[0060]
结果
[0061]
采用优化条件对混合标品溶液1快速定量检测的色谱图如图11所示。进一步采用优化的条件对混合标品溶液2为样品进行快速定量检测的色谱图如图12所示。结果表明，人参皂苷rg1和人参皂苷re基本达到峰基线分离，人参皂苷rc、rg2和rb3虽未完全达到基线分离，但rc和rb3主要存在三七的地上部分，地下部分基本不含有，而rg2主要存在于三七的地下部分，而地上部分基本不含有，且试验验证也基本符合要求。
[0062]
9种皂苷的标准曲线图如图13-21所示，检测的9种皂苷中8种为三七中含有的皂苷，1种作为内标物的外源皂苷-酸枣皂苷b，标准曲线线性良好，r2均达0.999以上，同时依据空白背景 3*s/n和10*s/n确定检出限lod和定量限loq值，并对理论值进行验证(n＝6)，对不稳定浓度进行调整，确定9种标准皂苷的实际检出限和定量限。
[0063]
9种皂苷的标准曲线、线性范围、检出限、定量限和样本检测重复性如
[0064]
表1所示。
[0065]
[0066][0067]
表1
[0068]
注：ds为三七地上部分，dx为三七地下部分。
[0069]
三七地上部分和地下部分检测
[0070]
从云南省三七不同种植地区以三点采样法采集三七样品，每个采样点共采集20-30株，清洗干净，60℃烘箱烘干至恒重，分别分为三七地上部分(叶)，三七地下部分(根)，通过三七中皂苷快速定量检测方法进行检测。
[0071]
同时向三七地上部分和地下部分的样品中添加酸枣皂苷b进行回收实验：分别称量0.2g三七地上部分和地下部分(精确到mg)，加入甲醇5.0ml，加入适量外源酸枣皂苷b，振荡混匀，超声处理10min，8000rpm/min离心5min，取1ml上清过0.22um滤膜过滤，待用。
[0072]
通过三七中皂苷快速定量检测方法进行检测三七根主要含有三七皂苷人参皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷re、人参皂苷rg2、人参皂苷rb1和人参皂苷rd六种皂苷(图22)；三七叶主要含有人参皂苷rb1、人参皂苷rc和人参皂苷rb3三种皂苷(图23)。
[0073]
通过对三七地上部分和地下部分的样品进行重复实验(n＝6)，测定所建立的三七中皂苷快速定量检测方法的稳定性，分析结果发现rsd％均小于10％。
[0074]
地上部分和地下部分的回收率分别为93.19％和99.37％，表明所建立的三七中皂苷快速定量检测方法准确稳定，可进行三七样本中8种皂苷种类和含量的检测。
[0075]
实施例1
[0076]
三七样品检测
[0077]
2019年7月份从云南省三七不同种植地区以三点采样法采集三七样品，每个采样点共采集20-30株，清洗干净，60℃烘箱烘干至恒重，分别分为三七地上部分(茎和叶，简称ds)，三七地下部分(剪口，主根和须根，简称dx)，通过三七中皂苷快速定量检测方法进行检测。
[0078]
结果如表2所示，显示出三七不同部分皂苷种类和含量的差异，能很好的代表三七品质特征，且与《药典》2020版对三七品质要求相符合。
[0079]
表2
[0080][0081][0082]
注：ds为三七地上部分，dx为三七地下部分。