一种高催化活性钼基纳米酶及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及纳米酶技术领域，尤其涉及一种高催化活性钼基纳米酶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.无机纳米材料尤其是过渡金属氧化物具有特殊的物理化学性质，因其制备简单，价格便宜，且具有类似贵金属的可调的局部等离子体共振现象而引发了人们对其进行深入研究。氧化钼是一种典型的过渡金属半导体无机纳米材料，由于它优异的电致变色、光致变色、催化活性、电极插层性能而在显色器、光催化、电池以及气敏传感器等领域具有广泛的应用。近年来，随着纳米技术和纳米医学的发展，人们发现纳米氧化钼具有生物毒性低、表面易于修饰、氧空穴多、近红外光热转换能力强等特性，这些特性使得纳米氧化钼在生物医学领域如抗菌、抗肿瘤、生物分子检测、生物催化等方面展现出广阔的应用前景。
3.肿瘤微环境(tumor micro-environment,tme)介导的纳米催化治疗主要是利用无毒或低毒的纳米材料，通过选择性地催化、触发tme内部的特定化学反应，在局部产生数量可观的特定反应产物如活性氧物种(reactive oxygen species,ros)的肿瘤治疗策略，从而实现一系列的生物学和病理学响应，并降低对正常组织的副作用，是一种肿瘤特异性的治疗方式。但是，tme介导的纳米催化治疗效率一般会受肿瘤内h2o2水平、酸度不足和乏氧等的限制。因此，能否通过调节tme而增强肿瘤催化治疗效果成为当前研究的热点之一。具有潜在的高效类酶催化活性的无机纳米酶(如：过氧化物酶peroxidase(pod)、氧化物酶oxidase(oxd)、过氧化氢酶catalase(cat)等)的研制为肿瘤催化治疗提供了新契机。例如：类cat的纳米酶可以催化分解tme中高表达的h2o2(浓度范围：100μm-1.0mm)为氧气，从而缓解瘤内乏氧。然而，构建用于精准tme响应且对正常组织毒副作用小的高催化活性无机纳米酶来实现高效的肿瘤抑制依旧面临着巨大挑战。
4.铜是一种人体内的微量金属元素，在维护人体心血管系统的健康中发挥着重要的作用。铜离子已经被证明具有刺激血管生成、胶原蛋白沉积过程以促进伤口愈合的优异性能；除此之外，铜的化合物或离子的一些新的性质被挖掘出来并用于生物医学领域。例如，cu的多金属氧酸盐催化剂(cu-mof)具有良好的生物相容性以及优异的催化性能并可用于药物递送和肿瘤治疗(如：cu
2
的放疗增敏、光热治疗等)。但是由于铜离子的生物毒性相对较高，使用剂量过大会对人体产生较大副作用。


技术实现要素：

5.鉴于上述的分析，本发明旨在提供一种高催化活性钼基纳米酶及其制备方法和应用，具有毒副作用小和高催化活性，至少能解决以下技术问题之一：(1)单独的氧化钼的类过氧化氢酶催化效果较差；(2)铜离子的生物毒性相对较高，在抗肿瘤过程中使用剂量过大会对人体产生较大副作用。
6.本发明的目的主要是通过以下技术方案实现的：
7.一方面，本发明提供了一种高催化活性钼基纳米酶，含有氧化钼纳米颗粒和铜离子，所述铜离子锚定在氧化钼纳米颗粒表面。
8.进一步的，所述高催化活性钼基纳米酶的制备原料包括氧化钼纳米颗粒、半胱氨酸、铜离子和表面活性剂。
9.进一步的，所述表面活性剂为生物相容性良好的聚合物。
10.另一方面，本发明提供了一种高催化活性钼基纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
11.步骤s1、制备氧化钼纳米颗粒；
12.步骤s2、将半胱氨酸和水溶性铜盐加入二次水中超声搅拌螯合成白色絮状物l-cys-cu；
13.步骤s3、将氧化钼纳米颗粒与l-cys-cu混合溶液置于离心管中，在超声池中超声，随后放于磁力搅拌器上搅拌，在搅拌过程中，均匀缓慢加入表面活性剂；
14.步骤s4、反应结束后，离心取出沉淀，将沉淀用二次水反复离心洗2-3次，再用乙醇洗并离心，吸掉多余的乙醇，得到高催化活性钼基纳米酶。
15.进一步的，所述步骤s1中，制备氧化钼纳米颗粒的步骤包括：
16.s101、按比例称取钼酸铵粉末，将钼酸铵粉末溶于去离子水中，超声溶解得到钼酸铵水溶液；
17.s102、使用移液枪向s101得到的钼酸铵水溶液中加入无水乙醇，超声分散并在室温下搅拌得到混合均匀的混合溶液；
18.s103、将混合溶液转入水热反应釜中，反应釜拧紧后放置于烘箱中，设置反应温度为160-200℃，反应时间为10-15h；
19.s104、反应结束后，待自然冷却至室温，离心取出沉淀，将沉淀用二次水反复离心洗涤2-5次，置于冷冻干燥机中冻干，得到氧化钼纳米颗粒。
20.进一步的，其特征在于，所述s101和s102中，钼酸铵：无水乙醇：去离子水＝0.7-1mmol：10-15ml：20-25ml。
21.进一步的，所述步骤s2中，所述水溶性铜盐为氯化铜，半胱氨酸和氯化铜的摩尔比为2：1-1.5。
22.进一步的，所述步骤s3中，氧化钼纳米颗粒与l-cys-cu的摩尔比为1：1-3。
23.进一步的，所述步骤s3中，所述表面活性剂为聚乙烯基吡咯烷酮，氧化钼纳米颗粒与聚乙烯基吡咯烷酮的质量比为1：1-2。
24.本发明还提供了一种高催化活性钼基纳米酶的应用，将高催化活性钼基纳米酶用作抗肿瘤材料。
25.与现有技术相比，本发明至少可实现如下有益效果之一：
26.(1)本发明利用简单的一步水热法，水热条件下分解钼酸铵并重新成核生长为多孔的moo2纳米颗粒，该纳米颗粒具有高的类过氧化氢酶催化活性，在催化过程中具有降解行为且能够避免纳米材料对生物体的长期毒性，这是一种安全高效的tme中h2o2响应的纳米酶催化剂，并可以改善肿瘤内乏氧，增敏放疗；在moo2纳米颗粒表面锚定铜离子的过程中，只有室温下的简单安全的超声搅拌，并没有其它高温高压过程来改变moo2纳米颗粒的形貌和结构，并且通过半胱氨酸l-cys作为中间链接剂进行离子锚定，这为其它过渡金属氧化物锚定金属离子提供了一种简单的合成思路的参考依据，制备方法简单安全。
27.(2)本发明的高催化活性钼基纳米酶moo
2-l-cys-cu-pvp(简称mccp)的类过氧化氢酶催化活性和放疗增敏功能远远高于单独的氧化钼和单独的l-cys-cu，并且h2o2的使用量100μm-1.0mm，处于tme中h2o2的高表达剂量范围内，在提高mccp对相对低浓度h2o2的类过氧化氢酶催化能力的同时，还降低了生物毒性相对较高的铜离子的使用剂量和h2o2的使用剂量，最终获得了具有优异类过氧化氢酶拟酶催化活性的钼基纳米酶。mccp催化h2o2产生氧气后，在放疗过程中的x-ray照射下容易在tme中解组装，l-cys-cu从复合材料上释放并开始进行类芬顿反应，从而产生了更多的羟基自由基
·
oh，因而，mccp改善肿瘤乏氧的同时还提高了放疗中肿瘤的敏感性，具有协同增强的类过氧化氢酶催化分解h2o2产生氧气改善瘤内乏氧和增敏放疗的效果，从而在肿瘤的放疗增敏方面具有广阔的应用前景。
28.(3)本发明的高催化活性钼基纳米酶在测试剂量范围内无明显的细胞毒性，使用安全且效果显著，适用范围广。
29.在本发明中，上述各技术方案之间还可以相互组合，以实现更多的优选组合方案。本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书以及附图中所特别指出的来实现和获得。
附图说明
30.附图仅用于示出具体实施例的目的，而并不认为是对本发明的限制，在整个附图中，相同的参考符号表示相同的含义。
31.图1中，a为本发明的mccp的扫描电子显微镜图；b为本发明的mccp的透射电子显微镜图；c为mccp的元素能谱图；d为mccp的x射线粉末衍射图；
32.图2中，a为不同浓度mp纳米颗粒的溶解氧测试结果；b为mccp对双氧水的消耗曲线；c为三种材料mp，mccp，l-cys-cu的类过氧化氢酶催化活性催化分解h2o2效果的比较；d为温度对mccp催化效果的影响；
33.图3为mp，mccp在细胞层次的活性氧自由基(ros)检测的激光共聚焦扫描显微(confocal laser scanning microscopy，clsm)图片；
34.图4为体外dna双链断裂试验的激光共聚焦扫描显微图片；
35.图5中，a为不同浓度的mccp纳米颗粒在相同时间内gsh的消耗曲线；b为mp、pbs和mccp的对照实验；c为同一mccp纳米颗粒浓度下gsh随时间的消耗曲线；d为x-ray照射下，铜离子与h2o2的类芬顿反应中的产物
·
oh的荧光发射谱；
36.图6为mccp纳米颗粒与人脐静脉上皮细胞huvec共孵育24小时后的细胞毒性数据；
37.图7为mccp催化h2o2产生羟基自由基的体外检测的反应机理。
具体实施方式
38.下面结合附图来具体描述本发明的优选实施例，其中，附图构成本发明一部分，并与本发明的实施例一起用于阐释本发明的原理，并非用于限定本发明的范围。
39.本发明提供了一种高催化活性钼基纳米酶，高催化活性钼基纳米酶的制备原料包括氧化钼纳米颗粒、半胱氨酸和铜离子。
40.具体的，高催化活性钼基纳米酶的制备原料还包括表面活性剂。
41.具体的，上述表面活性剂为生物相容性良好的聚合物，例如，聚乙烯基吡咯烷酮
(pvp)。
42.本发明还提供了一种高催化活性钼基纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
43.步骤s1、制备氧化钼纳米颗粒；
44.步骤s2、将半胱氨酸(l-cys)和水溶性铜盐加入20ml二次水溶液中，超声搅拌螯合成白色絮状物l-cys-cu；其中，水溶性铜盐为氯化铜(cucl2)；半胱氨酸(l-cys)的量为2mmol，氯化铜(cucl2)的量为1mmol；
45.步骤s3、将氧化钼纳米颗粒与l-cys-cu混合置于离心管中，置于超声池中超声3-8min，随后放于磁力搅拌器上搅拌，在搅拌过程中，均匀缓慢加入表面活性剂pvp并进行自组装；
46.步骤s4、反应结束后，离心取出沉淀，将沉淀用二次水反复离心洗2-3次，再用乙醇离心1次，吸掉多余的乙醇，得到高催化活性钼基纳米酶(moo
2-l-cys-cu-pvp)。
47.具体的，上述步骤s1中，制备氧化钼纳米颗粒的步骤包括：
48.s101、按比例称取钼酸铵粉末，将钼酸铵粉末溶于去离子水中，超声溶解得到钼酸铵水溶液；
49.s102、使用移液枪向s101得到的钼酸铵水溶液中缓慢加入无水乙醇，超声分散并在室温下搅拌30-40min得到混合均匀的混合溶液；
50.s103、将混合溶液转入聚四氟乙烯内胆的水热反应釜中，反应釜拧紧后放置于烘箱中，设置反应温度为160-200℃，反应时间为10-15h；
51.s104、反应结束后，待自然冷却至室温，离心取出沉淀，将沉淀用二次水反复离心洗涤2-5次，置于冷冻干燥机中冻干45-50h，得到氧化钼(moo2)纳米颗粒。
52.需要说明的是，上述s101和s102中，钼酸铵：无水乙醇：去离子水＝0.7-1mmol：10-15ml：20-25ml。
53.具体的，上述s104中，氧化钼(moo2)纳米颗粒的表面为粗糙多孔结构。
54.具体的，上述步骤s2中，控制半胱氨酸和氯化铜的摩尔比为2：1-1.5。优选的，半胱氨酸和氯化铜的摩尔比为2：1。
55.具体的，上述步骤s3中，控制氧化钼纳米颗粒与l-cys-cu的摩尔比为1：1-3。
56.具体的，上述步骤s3中，控制氧化钼纳米颗粒与pvp的质量比为1：1-2。
57.具体的，上述步骤s4中，高催化活性钼基纳米酶的结构为氧化钼纳米颗粒表面分散吸附有铜离子，即实现了多孔氧化钼纳米颗粒与半胱氨酸(l-cys)-铜离子的有效锚定。
58.另一方面，本发明还提供了一种高催化活性钼基纳米酶作为抗肿瘤材料的应用。
59.与现有技术相比，本发明利用简单的一步水热法，水热条件下分解钼酸铵并重新成核生长为多孔的moo2纳米颗粒，该纳米颗粒具有高的类过氧化氢酶催化活性，在催化过程中具有降解行为且能够避免纳米材料对生物体的长期毒性，这是一种安全高效的tme中h2o2响应的纳米酶催化剂，并可以改善肿瘤内乏氧，增敏放疗；在moo2纳米颗粒表面锚定铜离子的过程中，只有室温下的简单安全的超声搅拌，并没有其它高温高压过程来改变moo2纳米颗粒的形貌和结构，通过半胱氨酸l-cys作为中间链接剂进行离子锚定，这为其它过渡金属氧化物锚定金属离子提供了一种简单的合成思路的参考依据。
60.本发明的高催化活性钼基纳米酶(简称：mccp)具有协同增强的类过氧化氢酶催化分解h2o2产生氧气改善瘤内乏氧和增敏放疗的效果。在同等moo2质量含量的两种水溶液中
(mp,mccp)，mccp在相同时间内催化分解h2o2含量约是不含l-cys-cu的单独mp实验组的两倍；在同等h2o2实验浓度下的单独l-cys-cu的水溶液并没有明显的类过氧化氢酶拟酶催化效果，这可能是由于l-cys-cu颗粒较大，暴露的活性位点较少的原因，而将其吸附在表面积大的moo2纳米颗粒表面之后，实现了l-cys-cu的高分散性，暴露出更多的与h2o2接触的铜活性位点，从而实现了低浓度下的mccp的有效类过氧化氢酶催化活性，并产生了大量氧气，改善了瘤内乏氧，实现放疗增敏。
61.本发明提供的高催化活性钼基纳米酶的过氧化氢酶催化活性和放疗增敏功能远远高于单独的氧化钼和单独的l-cys-cu，并且h2o2的使用剂量为100μm-1.0mm，处于tme中h2o2的高表达剂量范围内，在提高mccp对相对低浓度h2o2的类过氧化氢酶催化能力的同时，还降低了生物毒性相对较高的铜离子的使用剂量和h2o2的使用剂量，最终获得了具有优异类过氧化氢酶拟酶催化活性的钼基纳米酶。mccp催化h2o2产生氧气后，在放疗过程中的x-ray照射下容易在tme中解组装，l-cys-cu从复合材料上释放并开始进行类芬顿反应，从而产生了更多的羟基自由基
·
oh，因而，mccp改善肿瘤乏氧的同时还提高了放疗中肿瘤的敏感性，从而在肿瘤的放疗增敏方面具有广阔的应用前景。
62.值得注意的是，本发明提供的高催化活性钼基纳米酶作为抗肿瘤材料的应用的原理为：利用肿瘤内高表达的h2o2或外源提供的h2o2(例如：放疗中x-ray辐射过程会提高肿瘤内h2o2的表达)，并结合cu
2
与cu
1
两者的价态转换(即：类芬顿反应)可循环催化h2o2的分解反应产生具有高毒性的羟基自由基(
·
oh),
·
oh具有极强的氧化性，能够更有效地杀伤癌细胞，而且该反应过程能够产生o2。
63.铜离子的类芬顿反应：
64.cu
2
h2o2＝cu
1
o2 h2o
65.cu
2
h2o2＝cu
1

·
oh
66.实施例1
67.本实施例提供了一种氧化钼纳米颗粒，制备方法如下：
68.(1)称取0.7mmol(0.0865g)钼酸铵粉末溶于20ml去离子水中，超声溶解得到钼酸铵水溶液；
69.(2)使用5ml的移液枪向步骤(1)的钼酸铵水溶液中缓慢加入10ml无水乙醇，超声分散并在室温下搅拌30分钟得到完全混合均匀的混合溶液；其中，无水乙醇和水的体积比为1:2，混合溶液总体积为30ml；
70.(3)将30ml的上述混合溶液转入50ml的聚四氟乙烯内胆的水热反应釜中，反应釜拧紧后放置于烘箱中，设置反应温度为160℃，反应时间为12h；
71.(4)反应结束后，待自然冷却至室温，离心取出沉淀，用二次水反复离心洗涤三次，置于冷冻干燥机中冻干48小时，得到氧化钼纳米颗粒(moo2)。
72.实施例2
73.本实施例提供了一种高催化活性钼基纳米酶，制备方法如下：
74.(1)将实施例1合成的moo2与l-cys-cu以摩尔比为1：1混合于20ml水溶液中，在离心管中超声3分钟，随后放于磁力搅拌器上搅拌；
75.(2)在搅拌过程中，均匀缓慢加入表面活性剂pvp(moo2与pvp的质量比为1：1)；
76.(3)反应结束后，离心取出沉淀，用二次水反复离心洗2-3次，再用乙醇洗并离心，
吸掉多余的乙醇，得到高催化活性钼基纳米酶(moo
2-l-cys-cu-pvp，简称mccp)。
77.需要说明的是，(3)中包括将所得离心管底部的moo2置于4℃冰箱保存待用。
78.对比例1
79.本对比例提供了一种moo
2-pvp，制备方法如下：
80.在室温下，将实施例1合成的100-300mg的moo2粉末加入20ml的二次水溶液中，搅拌的过程中均匀缓慢地加入表面活性剂pvp，得到moo
2-pvp(简称：mp)。其中，moo2与pvp的质量比为1：1。
81.测试例1
82.扫描电子显微镜和透射电子显微镜观测。
83.如图1所示：a和b分别为本发明的mccp纳米粒子的扫描电子显微镜和透射电子显微镜图，可以看出纳米粒子的尺寸在150nm左右，每个纳米粒子由更小尺寸的颗粒组成，小颗粒之间具有一定的间隙，从而显示出明显的多孔结构；c为mccp的元素能谱图(edx)，表明mccp的主要元素有mo和cu的存在；d为mccp的x射线粉末衍射(xrd)图，其峰位可与moo2的标准卡片(jcpds:50-0739)对应。
84.测试例2
85.moo2、l-cys-cu和mccp的类过氧化氢酶催化活性评估。
86.首先，将不同质量(最终浓度为2.5，5，10，20μg/ml)的mp超声溶解在去离子水中，将重置后的溶解氧测试仪探针浸入mp水溶液中，待仪器读数稳定后，记录此时仪器的读数，即为水溶液中原始含氧量，也即催化产氧过程中的初始零时刻点，然后加入最终浓度为1.0mm的双氧水，催化过程开始进行后，每间隔15秒进行数据记录。如图2中a所示，不同浓度mp纳米颗粒的溶解氧测试结果表明，mp纳米颗粒的类过氧化氢酶催化活性与mp的浓度呈现正相关；为了证明负载l-cys-cu后所得到的mccp比mp具有增强的类过氧化氢酶催化效果，进行了如下对比实验：设置三个实验组，分别为mp，mccp和l-cys-cu，具体过程如下：将相同体积的50μg/ml的moo2水溶液以及400μg/ml的l-cys-cu水溶液等体积各分为两份置于离心管中，然后从两种溶液中各取一份进行搅拌合成为mccp纳米粒子(mccp纳米粒子组成中moo2浓度变为25μg/ml，l-cys-cu变为200μg/ml)，随后将剩余的一份moo2水溶液合成为mp纳米粒子，并添加去离子水至moo2浓度为25μg/ml，剩余的一份400μg/ml的l-cys-cu水溶液只需加入等体积的去离子水使浓度降低为200μg/ml，此时三组溶液分别为mccp(moo225μg/ml和l-cys-cu200μg/ml)，mp(moo225μg/ml)，l-cys-cu水溶液(200μg/ml)，然后，按照之前的步骤进行溶解氧测试仪产氧测定。如图2中，b为利用硫酸钛为指示剂，mccp对双氧水的消耗曲线，其中，插图为硫酸钛指示下，mccp对h2o2消耗过程中，指示剂的颜色变化的比色光学照片(硫酸钛溶液本身为无色，h2o2与硫酸钛反应后为黄色(紫外可见吸收峰为407nm)，随着h2o2被mccp的消耗，硫酸钛保持无色)，插图颜色随着时间延长从黄色变为无色，这表明随着时间的延长，h2o2不断被消耗；图2中，c为三种材料mp，mccp，l-cys-cu的类过氧化氢酶催化活性催化分解h2o2效果的比较；结果表明l-cys-cu与moo2的复合所得的mccp能明显增强两者的类过氧化氢酶活性，即催化分解h2o2的能力；图2中，d为温度对mccp催化效果的影响；表明该反应是一个吸热反应，随着温度升高，反应速率加快。
87.测试例3
88.细胞内活性氧(ros)含量评估。
89.使用ros探针2
′
,7
′-
dichlorodihydrofluorescein diacetate(h2dcf-da,10μm,beyotime co,sigma-aldrich,usa)来评估mccp纳米颗粒在x-ray照射下的催化活性，ros能够将h2dcf-da去乙酰化，并被氧化为具有高荧光特性的2
′
,7
′-
dichlorofluorescein(dcf)。首先，使用完全培养基将腺癌人类肺泡基底上皮细胞(a549细胞)以2
×
105/皿的细胞浓度进行24小时贴壁培养，然后将其中两组细胞中分别加入mccp：50μg/ml，mp：50μg/ml，另一组细胞中不加材料，只加同等体积的完全培养基并作为对照组，5小时后，使用pbs洗两遍，每个小皿加入200μl探针溶液(1μldcfh-da 999μl的rpmi细胞培养基)在培养箱中孵育20分钟，然后再用pbs进行洗涤，同时将实验组进行x-ray(50kv，49μa)照射15分钟，之后使用hoechst33342(beyotime)进行细胞核染色15分钟。最后，再使用pbs清洗两次后在激光共聚焦显微镜(a1/lsm-kit,nikon/pico quant gmbh,japan/germany)下进行观察。
90.图3为mp，mccp在细胞层次的活性氧自由基(ros)检测的激光共聚焦扫描显微(confocal laser scanning microscopy，clsm)图片，表明mccp中在x-ray的激发下具有最强的自由基产生能力，这可能是由于铜离子与氧化钼的协同催化双氧水产生o2水平的提高，改善了肿瘤乏氧，进而促进ros的产生，另外一个原因是l-cys-cu上的铜离子从逐渐降解的氧化钼表面释放出来后在x-ray的活化下发生光激发的类芬顿反应而产生更多的
·
oh，从而增敏了对癌细胞的放射治疗。
91.测试例4
92.体外dna双链断裂试验对癌细胞的杀伤评估。
93.首先，将a549细胞种植在24孔板中，细胞浓度为3
×
104/孔，在孵育24小时细胞贴壁以后，分为三组，包括：其中两组细胞中分别加入mccp：50μg/ml，mp：50μg/ml，另一组细胞中不加材料，只加同等体积的完全培养基并作为对照组，5小时后，进行x-ray(50kv，49μa)照射15分钟。使用pbs洗细胞两次，并用4％多聚甲醛固定细胞，然后使用pbs洗三次，每次在摇床上摇动3分钟，加入0.2％的triton-x-100(300μl,10分钟)溶液进行预处理来增加膜的通透性，用封闭液(5％fbs、1％triton-x-100)稀释一抗(β-actin，骨架蛋白抗体)、稀释比例为1：100，配置成一抗稀释液，稀释结束后弃去孔中封闭液，每孔加入200μl一抗稀释液，最后将24孔板包入pbs浸湿的纱布中，于4℃冰箱中过夜。将24孔板从冰箱中取出，用pbs在摇床中反复洗涤三次，每次3分钟。随后，加入二抗稀释液(anti-rabbitalexafluor-488conjugatedigg：pbs＝1：500，每孔200μl，温度37℃,持续时间1小时)，再用pbs洗涤三次后进行hoechst染细胞核，最后再用pbs洗涤三次后用盖玻片封片，置于激光共聚焦显微镜下观察，成像，记录数据。
94.图4为体外dna双链断裂试验的激光共聚焦扫描显微图片，结果表明，与体外ros分析一致，mccp纳米粒子具有更强的dna损伤能力，即更强的抗肿瘤能力。
95.测试例5
96.mccp催化h2o2产生羟基自由基的体外检测。
97.设计考虑：考虑到肿瘤内不仅是h2o2高表达，而且gsh作为一种抗氧化剂，也在肿瘤内表达，因此，本实验中模拟了肿瘤微环境中高表达的gsh，gsh可以作用还原剂，将mccp中的cu
2
还原为cu
1
，而cu
1
在x-ray作用下具有更强的类芬顿反应能力，从而可将h2o2分解为羟基自由基。首先，先配置浓度为0.1mol/l碳酸盐缓冲溶液(bbs)，然后用bbs溶液配置浓度为100mm的dtnb(检测-sh的一种探针)溶液，1.0mm的谷胱甘肽(gsh)溶液，以及不同浓度的
mp和mccp溶液，再用二次水配置100mm的tris hcl溶液，将所有溶液配置完成后，进行ellman
′
s分析，先将225μl的gsh溶液与225μl的mccp/mp溶液混合，避光摇动3小时，然后再加入tris稀释液785μl和dtnb溶液15μl，每一组体积为1250μl，在412nm处检测吸光度。反应机理如图7所示。
98.mccp在x-ray作用下产生的
·
oh是通过
·
oh探针(terephthalic acid,ta,5mm,alfaaesar)进行检测的，ta可与
·
oh反应生成2-羟基对苯二甲酸(taoh，最大荧光峰为435nm)。首先，配置的ta溶液分别加入分好的加/不加h2o2的组别(control，mp，mccp)，双氧水为1.0mm，其中mccp溶液先与过量的gsh反应，确保cu
2
全部转化为cu
1
，然后，再置于37℃的摇床中过夜，然后在435nm处记录荧光发射锋的变化。
99.如图5所示：a为不同浓度的mccp纳米颗粒在相同时间内gsh的消耗曲线，表明gsh的消耗速度与mccp纳米颗粒的浓度呈正相关；b为mp、pbs和mccp的对照实验，表明只有mccp实验组才能消耗gsh，即有cu
2
的存在而与gsh发生氧化还原反应；c为同一mccp纳米颗粒浓度下gsh随时间的消耗曲线，表明gsh的消耗与时间呈正相关；d为x-ray照射下，cu
2
与h2o2的类芬顿反应中的产物
·
oh的荧光发射谱，ta h2o2 mccp组比ta h2o2 mp明显具有更高的荧光强度，说明x-ray照射下，mccp中的铜离子的类芬顿反应产生了
·
oh，但是比ta h2o2低的原因可能是部分h2o2被催化产生o2。从而导致总量已经固定的h2o2的含量降低，进而产生相对少的
·
oh。
100.如图6所示，图6为mccp纳米颗粒与人脐静脉上皮细胞huvec共孵育24小时后的细胞毒性数据，测试结果表明，在测试的剂量范围内mccp无明显细胞毒性。
101.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。