一种基于免疫沉淀法提取生物样品中免疫多肽的分析方法与流程

1.本发明属于免疫多肽分析技术领域，具体涉及一种基于免疫沉淀法提取生物样品中免疫多肽的分析方法。


背景技术：

2.癌症作为恶性肿瘤，无论在发达国家还是发展中国家中，均是致死率极高的疾病之一，且毎年新增患病人数都在增加。因此，全世界的科研人员都在寻找治疗癌症的手段。由于传统的化疗和放疗副作用大，此前伴随对癌症相关通路的研究，有较多的分子靶向治疗应用于癌症治疗。随着免疫治疗技术的不断发展完善，是近年来研究最为火热最有希望的治疗癌症的方法。肿瘤疫苗技术，被《mit科技评论》评为2019年十大技术突破之一。
3.新生抗原是由肿瘤特异性突变编码，并通过主要组织相容性复合物(mhc)蛋白呈递在肿瘤细胞表面上的多肽抗原，其中由mhc 1类分子呈递的免疫多肽长度普遍为8～12个氨基酸，其中最多的为9个长度氨基酸组成，如果是基因突变形成的肽段被呈递到癌细胞表面则就称其为新生抗原。它们可以被t细胞识别为“外源”(非自身)，从而来触发免疫反应。由于新抗原带有肿瘤特异性突变，并且在正常组织中未发现，因此它们是免疫系统区分癌细胞与非癌症细胞的理想靶标。一系列证据支持了新抗原在癌症疫苗中的潜力，包括突变量与对免疫检查点抑制剂疗法的反应之间的相关性，甚至在接种疫苗之前检测到的新抗原特异性t细胞反应。确实，三项独立研究表明了针对黑色素瘤患者的个性化新抗原疫苗的成功临床试验，发现该疫苗可增强先前存在的t细胞反应并诱导针对新抗原的新t细胞群体，证实了其治疗癌症的潜力。除了在开发癌症疫苗中的用途外，新抗原还可以帮助确定过继性t细胞疗法的靶标或改善对免疫检查点抑制剂疗法反应的预测。因此鉴定这些多肽抗原的方法对于新疫苗的开发是至关重要的，其目标是产生有效的适应性免疫应答和持久的免疫记忆。
4.目前，很多科学家开始了对新抗原鉴定的深入研究。当前鉴定候选新抗原的主要方法通常包括两个主要阶段：(1)对癌症和正常组织进行外显子组测序以发现体细胞突变；(2)通过算法预测哪些突变的肽段，最有可能由mhc蛋白呈现细胞表面，并引起t细胞的识别。第一阶段得到高通量测序技术和生物信息学流水线的大力支持，在过去十年中，几个基因组测序项目已经很好地建立了这一技术。但是，由于我们缺乏有关mhc抗原加工途径的知识，第二阶段仍然面临挑战：突变蛋白如何加工成肽段，这些肽段如何通过与抗原加工相关的转运蛋白传递到内质网以及它们如何结合mhc蛋白。更复杂的是，人类白细胞抗原(hla)(一种编码mhc蛋白的基因)系统是所知人体最复杂的多态系统,位于遗传变异最严重的区域之中，不同个体之间的等位基因相差很大。也就是，目前新生抗原的筛选技术集中在已知患者的hla等位基因的情况下，通过基因测序的方式预测哪些突变的肽段与mhc蛋白结合。然而，大量的实验结果证实，通过这种方式预测的肽段很少(在数千种预期候选物中少于十二种)会被证实存在于肿瘤细胞表面，并且能触发t细胞反应的甚至更少，更不用说真正的新抗原可能并不为预测列表的最优选项。此外，预测模型在不同的hla等位基因上的表现不
尽相同，在一些较不常见的hla等位基因上其预测能力会更差，因为缺乏相关的数据。最近，已经有人提出了利用蛋白质组学方法来检测新生抗原，使用质谱(ms)技术直接鉴定从mhc蛋白中分离出的新生抗原，从而克服仅依靠测序数据预测新生抗原的局限性。该技术的主要优势是：通过dna和rna测序得到的片段，不一定会最终真实表达在细胞表面，而质谱技术可以直接鉴定到真实细胞表面的免疫多肽。这类方法主要是通过进行外显子组(dna)测序以建立包括正常和突变蛋白序列的定制蛋白数据库，进一步采用搜索引擎使用该数据库来识别通过质谱测序获得的免疫多肽，其中对应于外显子组突变信息的免疫多肽即为新生抗原，从而达到提高预测新生抗原的准确性。
5.近十年来，随着对免疫多肽提取效率的提高，以及更高灵敏度、更高分辨力和更快采集速率的质谱检测仪器发展，以及数据分析算法的速度和准确度的提高，极大地促进了免疫多肽组学的发展。目前已知，主要可以采取如下3种方法从细胞系和组织中提取与hla结合的免疫多肽。首先是最简单的方法，使用等渗酸性缓冲液从细胞表面直接剥离下来免疫多肽，但会存在容易引入污染蛋白的风险，进而妨碍对免疫多肽组的深入分析。另一种方法通过工程化细胞表达感兴趣的单一可溶性hla分子，这种方法可以产生大量的hla-肽段复合物。在质谱分析之前，可以将该复合物轻易地从培养基中纯化出来。但是，使用这种方法来分析来自临床样品或组织的hla结合肽段是不可行的。第三种是采用免疫沉淀的方法直接从细胞系或组织裂解物中分离出可溶性hla-肽段复合物，其免疫沉淀使用的抗体会特异性的识别hla分子，将细胞系或组织裂解物中的hla-肽段复合物富集出来，再采用酸洗将抗体、hla分子以及肽段复合体分开，最后再通过纯化除杂等方式得到仅含有肽段成分的样品，待脱盐处理后对该样品进行免疫多肽的质谱鉴定。这种思路由engelhard和hunt，natheson和rammensee组等人率先提出。常见的纯化除杂做法主要是两种，1、采用分子量滤膜将肽段与hla蛋白分子分离，但这种操作会导致富集到肽段的损失，还可能引入聚合物污染。2、通过反相hplc设置液相梯度从而从较大的复杂组分中分离出肽段，但该操作需要配备液相色谱仪等大型仪器和馏份收集器。


技术实现要素：

6.基于现有技术中存在上述问题，本发明提供一种基于免疫沉淀法提取生物样品中免疫多肽的分析方法，通过交联试剂制备免疫亲和柱，再对生物样本的裂解物进行免疫沉淀，从而富集得到hla-肽段复合物，再通过c18小柱进行一个简单的两步洗脱，该步骤可以同时实现免疫多肽的除杂和脱盐，回收的成分即可在浓缩后进行质谱检测，可以实现无论是细胞还是组织等生物样本中免疫多肽的高效提取，样品前处理过程不依赖复杂的仪器，即可完成免疫多肽的纯化和除盐，大大缩短操作所需时长。
7.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
8.一种基于免疫沉淀法提取生物样品中免疫多肽的分析方法，其先通过交联试剂将目标免疫多肽对应的特异性抗体包被到磁珠，继而通过磁珠沉淀富集目标免疫多肽，将富集后的目标免疫多肽从磁珠上洗脱，并取洗脱液进行质谱检测。
9.根据以上方案，所述的交联试剂是dmp(二甲基吡咪酯)；所述的磁珠是protein a beads(蛋白a磁珠)。
10.根据以上方案，所述的一种基于免疫沉淀法提取生物样品中免疫多肽的分析方法
包括以下详细步骤：
11.步骤s1，采用化学交联试剂dmp将对应的特异性抗体交联包被到protein a beads上，并将protein a beads制备成hla免疫亲和柱；
12.步骤s2，采用温和的裂解试剂对细胞或者组织样品进行裂解，获得蛋白质裂解液；
13.步骤s4，将蛋白质裂解液引入到交联有特异性抗体的protein a beads，混匀孵育,在4
°
下进行1小时以上的混匀孵育，过夜效果更佳，从而使裂解液中的hla-肽段复合物与protein a beads上的抗体特异性结合；
14.步骤s5，回收交联有抗体的protein a beads并依次采用4种含有不用盐溶度的缓冲液进行清洗，依次去除去污剂、非特异性结合的物质、盐等成分；
15.步骤s6，向步骤s5中被清洗完的protein a beads加入洗脱试剂，收集洗脱protein abeads后的液体，为洗脱液，洗脱液即为hla-肽段复合物，抗体因为有交联剂的作用，所以不会被酸洗下来，该亲和柱待用缓冲溶液平衡后可以重复进行使用；
16.步骤s8，将洗脱液浓缩后进行质谱检测，并采用搜库软件对质谱采集数据进行结果搜库分析。
17.根据以上方案，所述的一种基于免疫沉淀法提取生物样品中免疫多肽的分析方法还包括步骤s3，向蛋白质裂解液中加入没有结合抗体的protein a beads，在室温下进行混匀孵育,以除去裂解液中非特异性结合的成分，再除去没有结合抗体的protein a beads。
18.根据以上方案，所述的一种基于免疫沉淀法提取生物样品中免疫多肽的分析方法还包括步骤s7，步骤s6中收集到的洗脱液为第一洗脱液，将第一洗脱液采用c18脱盐小柱进行分级脱盐和纯化，对脱盐柱依次进行活化、平衡、上样、脱盐和洗脱，收集到的洗脱液为第二洗脱液；所述的第二洗脱液用于步骤s8中进行质谱检测。
19.根据以上方案，所述的步骤s2中的裂解试剂中添加有表面活性剂；裂解过程中通过机械手段辅助裂解。
20.根据以上方案，所述的表面活性剂包括np40或者legalca630或者脱氧胆酸钠；所述的机械手段包括细胞超声碎裂或者使用组织匀浆仪搅拌。
21.根据以上方案，所述的步骤s6中的洗脱试剂是乙酸或者三氟乙酸。
22.本发明的有益效果是：本发明中提供的免疫多肽提取和检测方法，通过亲和柱的制备和基于免疫沉淀法的生物样本前处理，可以实现对细胞系和组织样品中免疫多肽的有效提取，再结合质谱技术进行检测和分析。结果显示该技术对免疫多肽提取具有极高的特异性和有效性，免疫多肽的鉴定数目均属于文献中的高水平，在肿瘤新生抗原筛选和应用方面具有极高的应用前景。
附图说明
23.图1，实施例一中的搜库结果图。
24.图2，实施例一三个分型丰度较高的motif对比结果。
25.图3，实施例二中的鉴定数量图。
26.图4，实施例三中的免疫印迹分析图。
27.附图均为实施例中的结果展示，会根据每一次检测分析的结果发生变化，即图中文字与能否重复实施本发明提供的检测方法无关，图中文字不清晰不影响本领域技术人员
重复实施本发明提供的检测方法。
具体实施方式
28.下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行说明。
29.实施例一：hcc1937细胞免疫多肽的提取和质谱鉴定方法。
30.本实施例中所使用的试剂无特别标注均采购于sigma，包括三乙醇胺、dmp交联剂、tris、乙腈、三氟乙酸和乙酸等。protein a sepharose 4b、蛋白酶抑制剂、pepstatin protease抑制剂和pbs采购于thermo fisher scientific公司。脱盐柱seppak c18 cartridges采购于waters公司。econo-column空柱采购于bio-rad公司。
31.一种基于免疫沉淀法提取生物样品中免疫多肽的分析方法，其先通过交联试剂将目标免疫多肽对应的特异性抗体(w6/32抗体)包被到磁珠，继而通过磁珠沉淀富集目标免疫多肽(hcc1937细胞裂解液中的hla-肽段)，将富集后的目标免疫多肽从磁珠上洗脱，再通过c18柱对免疫多肽进行纯化和富集后，采用质谱对纯化富集后的洗脱液进行检测，包括以下详细步骤：
32.步骤s1，采用化学交联试剂dmp(二甲基吡咪酯)将对应的特异性抗体交联包被到protein a beads(蛋白a磁珠)上，并将protein a beads制备成hla免疫亲和柱，具体是：取w6/32抗体添加到pbs(牛血液蛋白)中，使w6/32抗体在pbs溶液中的浓度为1mg/ml，再将抗体溶液添加到protein a sepharose(磁珠凝胶溶液)中，在室温下，360℃首尾倒置旋转孵育30min，或者4℃过夜孵育使抗体与protein a sepharose进行结合。一般对于分析5e8个细胞，需要1ml的protein a sepharose柱床体积，将对应液体转移到econo-column空柱中，通过该空柱下端的十字开关进行不同溶液置换，打开十字开关，使抗体溶液在重力作用下流过。再在4℃层析柜中，先后用10倍柱床体积(colume volumn，cv)的硼酸盐缓冲液和10cv的0.2m三乙醇胺(ph 8.2,rt)对柱子进行依次清洗，除去残留的游离胺。再转移到室温下，用5cv新鲜制备的dmp交联剂进行清洗，然后仅在protein a sepharose柱床上方留下dmp弯液面。关上十字开关，使反应在室温下进行1小时。再加入10cv冰冷的终止缓冲液(0.2m tris，ph 8.0)来终止交联反应。最后采用10cv甚至更多体积的pbs(ph 7.4)清洗柱床，直至流出液的ph》7，并保留部分pbs避免protein a sepharose干燥，即完成了免疫亲和柱的制备；
33.步骤s2，采用温和的裂解试剂对细胞或者组织样品进行裂解，获得蛋白质裂解液，具体如下，消化回收hcc1937细胞，用pbs进行至少3遍清洗，保证每次实验的细胞数目在5e7个以上。取4份个数均为5e7个的hcc1937细胞，加入约10ml细胞裂解液在冰上孵育1h，可每间隔10min对溶液进行吹打或者倒置，使裂解充分,裂解试剂中添加有表面活性剂脱氧胆酸钠。将裂解完成后的细胞，在冰上用细胞超声破碎仪以100watt功率，超10s，停5s，共20个循环进行超声处理，即得到蛋白质裂解液；
34.步骤s3，将蛋白质裂解液在4℃，以7000g离心30min分离出细胞核等杂质，取上清转移到新的离心管中，向蛋白质裂解液中加入约0.5ml没有结合抗体的protein a beads，在室温下旋转孵育30分钟后离心，取走纯化后的上清液，即为除去部分杂质后的蛋白质裂解液；
35.步骤s4，将步骤s3最后获得的蛋白质裂解液转移到免疫亲和柱中，即引入到交联
a*24:02、hla b*81:03、hla b*40:16、hla c*07:02和hla c*03:04，通过对搜库得到的肽段在gibbscluster-2.0server软件上进行motif分型分析，结果表面鉴定到的肽段motif分布于细胞理论hla分型的理论motif完全一致，如图2所示，三个分型丰度较高的motif对比结果，进一步证实了本发明的结果可靠性。
44.通过对搜库得到的肽段在netmhcpan4.1软件进行与对应分型的亲和力打分，结果显示至少于其中一种hla分型具有亲和力(0-500mm)的比例高达95％，其中强亲和力sb(0-50mm)的比例接近90％。
45.实施例二：5例病人组织免疫多肽鉴定结果和肽段长度分布图。
46.本实施例二所使用的方法与实施例一一致，仅将细胞系样本更换为病人组织样本。
47.取病人组织样品5例(肝癌组织)进行免疫多肽的提取。其中除了组织裂解方式和细胞系不一样，免疫亲和柱的制备，裂解液的免疫亲和结合、洗脱、纯化脱盐，质谱的检测和数据分析都和实施例1一致，其组织的裂解方式具体如下：
48.每份组织需要200mg以上，加入约20ml细胞裂解液，然后用组织磁珠匀浆后，放在冰上孵育1h，可每间隔10min对溶液进行吹打或者倒置。然后，再将裂解完成后的组织样品，放在冰上用细胞超声破碎仪以100watt功率，超10s，停5s，共40个循环进行超声处理。因为组织中可能还有脂类或者影响亲和结合的物质，裂解液需在4℃，以100,000g离心75min，取组织样品的上清经过0.22um滤膜后，再进行免疫沉淀处理。
49.如图3所示，本实施例中对实施例二中的5组组织样本(每例都有癌和癌旁样本)，鉴定量范围为800～4150条免疫多肽，其中9个氨基酸长度的肽段占总鉴定数目的约60％左右，结果显示了该发明实现了对组织样本中免疫多肽的强特异性提取和鉴定，其鉴定数目达到了目前文献中报道的高值。
50.实施例三：实施例一和实施例二中对富集到的hla的验证。
51.本实施例使用的丙烯酰胺电泳凝胶10％nupage预制胶、10
×
还原剂、4
×
上样液、20
×
电泳缓冲液、western blot印记膜和滤纸均购自于thermo公司；预染蛋白分子量marker购于bio-rad公司；一抗抗β2-微球蛋白兔重组抗体(anti-beta 2microglobulin)采购于abcam公司；二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔igg采购于碧云天公司；电泳仪mini gel tank和iblot2干式转印系统采购于thermo公司。
52.取实施例一和二中的流出液2各一份，溶解到pbs中，用od280测定蛋白质浓度，并且均取200ng进行sds-page跑胶和wb分析，以验证该发明中免疫沉淀的方法成功富集到了样品中的mhc-i蛋白，mhc-i蛋白由α链(分子量为43kda)和β链(分子量为43kda)组成，该wb实验中对β链进行验证。结果如图4所示，结果显示在流出液2中均含有mhc-i蛋白的β链，证实了该发明中免疫沉淀方法对细胞系和组织等生物学样本的结果可靠性。
53.本发明提供以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。