戊酸在防治南方根结线虫中的应用的制作方法

1.本发明属农业病害防治技术领域。具体涉及戊酸在防治南方根结线虫中的应用。


背景技术：

2.植物寄生线虫（plant parasitic nematodes, ppns）是制约全球粮食生产的重要因素之一，每年对全球的经济损失高达1250亿美元。植物寄生线虫主要包括根结线虫、胞囊线虫、根腐线虫、茎线虫和松材线虫。自1855年根结线虫在黄瓜根际被发现后，我国也陆续在其他植物发现了其相关种，如：象耳豆根结线虫、南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫等。其中，南方根结线虫是东北三省的大棚温室、甘肃省番茄根结线虫的优势种和河北省番茄与黄瓜根结线虫病的主要病原种群。而根结线虫生物防治主要是利用捕食真菌、内寄生真菌、机会真菌、产毒素菌代谢物、植物源杀线虫剂和植物内源激素等生物制剂来进行杀灭线虫的方法。因此，开发绿色、高效的南方根结线虫防治方法成为了农业技术领域的一大研究热点。
3.根系分泌物是多种化合物的混合物，包括初级和次级代谢物。其中，初级代谢物包括碳水化合物、氨基酸和有机酸，比次级代谢物如黄酮类化合物、生长素等的分泌量更大。研究表明，植物会利用根系分泌物来应对线虫胁迫，包括吸引根瘤菌bacillus firmus i-1582使其定植于根部，可以保护拟南芥免受甜菜胞囊线虫的侵染；辣椒根系分泌中的化感物质邻苯二甲酸二丁酯会抑制南方根结线虫的生长和繁殖。因此，从根系分泌物中筛选获得杀线虫剂，成为了一种潜在的研究方向。
4.论文《七种植物根系分泌物对南方根结线虫趋化性的作用》（丁正蛟，云南大学，2018-05），该论文中发现了戊酸对南方根结线虫趋化性有作用，且戊酸在0.929 mg/ml时趋化指数为0.194，有吸引活性，但是戊酸是否能够杀灭南方根结线虫，是否能够应用于南方根结线虫的防治中，目前并无任何文献记载。


技术实现要素：

5.本发明为了解决目前戊酸对南方根结线虫的具体作用问题，提供了戊酸在防治南方根结线虫中的应用。戊酸对南方根结线虫的作用表现为：高浓度趋避，低浓度吸引。此外，10-1 mol/l戊酸对南方根结线虫的杀线虫活性效果较其他浓度显著。
6.本发明由如下技术方案实现的：戊酸在防治南方根结线虫中的应用，所述戊酸为正戊酸，溶于纯水中，戊酸浓度为92.9 mg/ml和 9.29 mg/ml，作为趋避剂，趋避南方根结线虫；戊酸浓度为0.929 mg/ml和 0.0929 mg/ml，作为引诱剂，吸引南方根结线虫。
7.优选：戊酸浓度为92.9 mg/ml，作为趋避剂，趋避南方根结线虫；戊酸浓度为0.929 mg/ml作为引诱剂，吸引南方根结线虫。
8.戊酸在防治南方根结线虫中的应用，所述戊酸为正戊酸，溶于水中，戊酸浓度为10-1
mol/l-10-5
mol/l ，作为杀线虫剂，杀灭南方根结线虫。
9.优选：戊酸浓度为10-1 mol/l，处理南方根结线虫24h-48h，杀南方根结线虫。
10.进一步的，戊酸浓度为10-1 mol/l，处理南方根结线虫48h，杀南方根结线虫。
11.本发明选取戊酸进行其对南方根结线虫的趋化作用和杀线虫活性测定，发现戊酸对南方根结线虫具有趋化作用和杀线虫活性。戊酸对南方根结线虫的作用表现为：高浓度趋避，低浓度吸引。此外，10-1 mol/l戊酸对南方根结线虫的杀线虫活性效果较其他浓度显著。并且杀线虫活性优于同浓度的甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、异戊酸。因此，正戊酸作为趋避剂、引诱剂或者杀虫剂，在防治南方根结线虫方面表现出了优异的潜能。
具体实施方式
12.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
13.实施例1：戊酸对南方根结线虫的趋化作用验证，使用的试剂为色谱纯，将正戊酸溶于无菌水中，以929 mg/ml作为戊酸原液，分别配制的正戊酸溶液中戊酸浓度为92.9 mg/ml、9.29 mg/ml、0.929 mg/ml、0.0929 mg/ml、10-1
mol/l、10-2
mol/l、10-3
mol/l、10-4
mol/l、10-5
mol/l，现配现用。
14.具体趋化作用验证的步骤如下：选取9cm一次性平板，将平板从底部划分为3个部分：实验区、对照区和缓冲区。在水平台上进行操作，倒入1%的琼脂糖培养基，室温冷却后充当线虫移动的介质，注意倒入的琼脂糖培养基的光滑性。将南方根结线虫二龄幼虫离心4500r，1min，用显微镜确定单位溶液中的线虫数。用无菌水溶解有机相，在实验区加入10μl戊酸溶液，在对照区加入对照液无菌水，缓冲区加入约150条线虫，加入后放入28℃黑暗恒温培养箱。在2h内观察平板上线虫的移动，并用计数器计数。在实验区、对照区和缓冲区的线虫计数用于计算趋化指数。该实验重复3次，每个样品浓度3个重复。
15.根据以下公式计算趋化指数：趋化指数（c.i.）=实验区线虫数量-对照区线虫数量/实验区线虫数量 对照区线虫数量。c.i.在-1至1之间，等级表示为：c.i＞0，吸引；c.i＜0，趋避；c.i=0，无影响。表1为不同浓度的戊酸对南方根结线虫的趋化作用。
16.表1：不同浓度的戊酸对南方根结线虫的趋化作用注：
“‑”
，线虫未跑开。
17.测试结果表明，戊酸原液（929 mg/ml）对南方根结线虫没有趋化作用。戊酸在92.9 mg/ml和 9.29 mg/ml时，趋化指数为-0.215和-0.155，表现为趋避。戊酸在0.929 mg/ml和0.0929 mg/ml时，趋化指数为0.194和0.042，表现出吸引活性。以上结果表明，戊酸对南方
根结线虫的趋化作用表现为：92.9 mg/ml和 9.29 mg/ml的高浓度下趋避，并且92.9 mg/ml趋避作用高于9.29 mg/ml；0.929 mg/ml和0.0929 mg/ml的低浓度吸引，且0.929 mg/ml吸引作用高于0.0929 mg/ml。
18.实施例2：戊酸对南方根结线虫的杀线虫活性验证：选择28℃下孵化3天的南方根结根结线虫在不同浓度的戊酸作用24h后的死亡率作为评价标准。
19.具体步骤如下：用一次性注射器针头挑取番茄根部的卵块置于200目筛网中。将其放入28℃的恒温培养箱中孵化3天。将网筛取出，线虫水悬浮液用单层擦镜纸过滤除杂。滤液用离心机4000rpm离心5min，去掉上清夜，将线虫浓缩液用1ml移液枪转移到1.5ml无菌离心管中，置于垂直混匀仪中混匀，浓度调整至100条/10μl，备用。取11ml 纯度为99%的戊酸溶于89ml无菌水中，配制成10-1
mol/l的戊酸水溶液，利用无菌水进行梯度稀释，得10-2 mol/l、 10-3
mol/l 、10-4 mol/l、 10-5
mol/l的戊酸水溶液。其他酸的配制方法参照戊酸水溶液配制方法。
20.测试组：在3cm平板中，加入20μl 200条的南方根结线虫二龄幼虫和2ml不同浓度的戊酸等7种酸水溶液（10-1
mol/l、10-2 mol/l、 10-3
mol/l 、10-4 mol/l、 10-5
mol/l）。每个浓度设置3个重复。
21.空白对照组（sw）：在3cm平板中，加入20μl 200条的南方根结线虫二龄幼虫和2ml无菌水。重复3次。
22.在28℃、24h时，用显微镜统计实验组与对照组的线虫总数和死亡数（线虫僵直且不动即认为死亡）。根据以下公式计算线虫的死亡率：死亡率=死亡数/总数
×
100%。表2为不同浓度的戊酸在24h对南方根结线虫的杀线虫活性，以24h线虫的死亡率作为评价标准。
23.表2：不同浓度的戊酸等7种酸处理南方根结线虫24h线虫死亡率统计结果平板实验测试结果表明，戊酸在10-1
mol/l和10-2 mol/l 浓度下，对南方根结线虫有杀线虫活性。特别的，10-1
mol/l的戊酸水溶液在24h时，对南方根结线虫的致死率达到了78.42%，且戊酸对南方根结线虫的致死率远远高于甲酸、乙酸、丙酸、丁酸以及异戊酸，以上结果也说明，戊酸可以应用于杀线虫剂。
24.实施例3：以10-1
mol/l作为同一浓度戊酸等7种酸对南方根结线虫的不同处理时间下杀线虫活性验证：选择28℃下孵化3天的南方根结根结线虫在10-1 mol/l戊酸等7种酸作用12h、24h、48h后的死亡率作为评价标准。
25.具体步骤如下：用一次性注射器针头挑取番茄根部的卵块置于200目筛网中。将其放入28℃的恒温培养箱中孵化3天。将网筛取出，线虫水悬浮液用单层擦镜纸过滤除杂。滤液用离心机4000rpm离心5min，去掉上清夜，将线虫浓缩液用1ml移液枪转移到1.5ml无菌离心管中，置于垂直混匀仪中混匀，浓度调整至100条/10μl，备用。取11ml 99%的戊酸溶于89ml无菌水中，配制成10-1
mol/l的戊酸水溶液。其他酸的配制方法参照戊酸水溶液配制方法。
26.测试组：在3cm平板中，加入20μl 200条的南方根结线虫二龄幼虫和2ml 10-1 mol/l戊酸等7种酸。重复3次。
27.对照组（sw）：在3cm平板中，加入20μl 200条的南方根结线虫二龄幼虫和2ml无菌水。重复3次。
28.在28℃，12h、24h和48h时，分别用显微镜统计实验组与对照组的线虫总数和死亡数（线虫僵直且不动即认为死亡）。
29.根据以下公式计算线虫的死亡率：死亡率=死亡数/总数
×
100%；表3为实验结果。
30.表3：10-1 mol/l戊酸等7种酸在12h、24h、48h时对南方根结线虫的杀线虫活性结果表3测试结果表明，10-1 mol/l戊酸在24h和48h对南方根结线虫均有杀线虫活性，且南方根结线虫的死亡率随作用时间增加而增加。特别的，10-1 mol/l戊酸在48h时，对南方根结线虫的致死率达到了83.26%。并且，同样浓度的不同酸处理南方根结线虫48h后，戊酸对南方根结线虫的致死率高达83.26%，而乙酸最低，仅为30.37%，甲酸为46.63%，丙酸为79.25%，正丁酸为61.10%，异丁酸为50.63%，而异戊酸对南方根结线虫的致死率为60.12%，全部都低于正戊酸；显然，正戊酸可以应用于杀线虫剂，致死率可以高达83.26%。
31.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽
管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。