CRAF抑制剂在制备抗肿瘤的药物中的应用的制作方法

craf抑制剂在制备抗肿瘤的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及craf抑制剂在制备抗肿瘤的药物中的应用。


背景技术：

2.kit是一种ⅲ型酪氨酸激酶受体，其功能获得性突变可引起多种肿瘤发生，如胃肠道间质瘤，急性髓系白血病，肥大细胞增多症，恶性黑色素瘤以及生殖细胞瘤等。针对kit突变，目前已有抑制剂imatinib、sunitinib、regorafenib和ripretinib分别作为一、二、三、四线靶向药物用于治疗胃肠道间质瘤，并取得了良好的治疗效果，但是目前临床上很多患者存在对kit抑制剂的原发性耐药或在治疗过程中产生的继发性耐药，导致kit相关肿瘤的治疗失败。此外，其它kit突变相关肿瘤如肥大细胞增多症等目前还没有可用的kit抑制剂用于治疗。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的在于提供craf抑制剂在制备抗肿瘤的药物中的应用。
4.本发明提供了craf抑制剂在制备抗肿瘤的药物中的应用。
5.本发明还提供了craf抑制剂联合kit抑制剂在制备抗肿瘤的药物中的应用。
6.优选的，所述craf抑制剂包括zm336372、ly3009120、甲磺酸达拉非尼和gw5074中的一种或几种。
7.优选的，所述kit抑制剂包括伊马替尼、舒尼替尼、瑞戈非尼和瑞普替尼中的一种或几种。
8.优选的，所述肿瘤包括由kit突变引起的肿瘤。
9.优选的，所述肿瘤包括对kit抑制剂产生耐药性的肿瘤。
10.优选的，所述肿瘤包括胃肠道间质瘤、急性髓系白血病、肥大细胞增多症、恶性黑色素瘤或生殖细胞瘤。
11.本发明还提供了craf抑制剂在制备抑制kit活化的药物中的应用。
12.本发明还提供了一种抗肿瘤药物，活性成分包括craf抑制剂，还包括药学上可接受的辅料。
13.优选的，所述活性成分还包括kit抑制剂。
14.本发明提供了craf抑制剂在制备抗肿瘤的药物中的应用。信号通路ras/raf/mek/erk和pi3k/akt是kit(ⅲ型酪氨酸激酶受体)突变引发恶性肿瘤的关键信号通路，craf抑制剂不仅能够抑制ras/raf/mek/erk信号通路中mek/erk的活化，还能直接抑制kit的活化，进而抑制其它kit下游信号通路的活化(如pi3k/akt信号通路)。craf抑制剂对kit及其下游信号通路活化的抑制实现了通过不同的机制有效抑制kit活化，可以显著抑制kit相关肿瘤细胞的发生发展，因此该发明将为kit相关肿瘤如胃肠道间质瘤，急性髓系白血病，肥大细胞增多症，恶性黑色素瘤以及生殖细胞瘤等的治疗提供新的治疗方法，并将有助于克服kit相
关肿瘤，尤其是胃肠道间质瘤目前在治疗上面临的耐药性问题。并且，临床上使用的kit抑制剂存在便秘、腹泻、恶心、呕吐、骨髓抑制等副作用，部分患者由于对药物不耐受而无法采用这些药物进行治疗，本发明为kit相关肿瘤的治疗提供了新的选择。此外，由于craf抑制剂通过不同的机制抑制kit活化，因此craf抑制剂可以与目前临床上使用的kit抑制剂联合使用以提高kit相关肿瘤的治疗效果。本发明发现低浓度的kit抑制剂与低浓度的craf抑制剂联合作用，对肿瘤细胞的抑制效果明显优于单独使用其中的任一药物，联合用药不仅可通过降低药物使用浓度，减轻对患者的副作用，而且可以帮助患者获得更加突出的治疗效果，并且同时靶向不同信号分子所致的协同抗癌作用可避免或延缓耐药性的出现。
附图说明
15.图1为使用zm336372处理表达野生型和突变型kit的baf3细胞，通过免疫共沉淀和western blot检测kit及其下游信号通路活化的结果；
16.图2为使用ly3009120处理表达野生型和突变型kit的baf3细胞，通过免疫共沉淀和western blot检测kit及其下游信号通路活化的结果；
17.图3为使用dabrafenib mesylate处理表达野生型和突变型kit的baf3细胞，通过免疫共沉淀和western blot检测kit及其下游信号通路活化的结果；
18.图4为使用gw5074处理表达野生型和突变型kit的baf3细胞，通过免疫共沉淀和western blot检测kit及其下游信号通路活化的结果；
19.图5为使用craf抑制剂zm336372、ly3009120、dabrafenib mesylate和gw5074处理表达内源性kit突变的gist-t1细胞，通过免疫共沉淀和western blot检测kit及其下游信号通路活化的结果；
20.图6为使用craf抑制剂zm336372、ly3009120、dabrafenib mesylate和gw5074处理表达野生型kit的baf3细胞，通过cck8实验，检测kit介导的细胞增殖；
21.图7为使用craf抑制剂zm336372、ly3009120、dabrafenib mesylate和gw5074处理表达kit/560d突变的baf3细胞，通过cck8实验，检测kit介导的细胞增殖；
22.图8为使用craf抑制剂zm336372、ly3009120、dabrafenib mesylate和gw5074处理表达kit/w557k558del突变的baf3细胞，通过cck8实验，检测kit介导的细胞增殖；
23.图9为使用craf抑制剂zm336372、ly3009120、dabrafenib mesylate和gw5074处理表达内源性kit突变的gist-t1细胞，通过cck8实验，检测kit介导的细胞增殖；
24.图10为使用craf抑制剂zm336372、ly3009120、dabrafenib mesylate和gw5074处理表达二次突变kit的baf3细胞，通过免疫共沉淀和western blot检测kit及其下游信号通路活化的结果；
25.图11为使用craf抑制剂zm336372、ly3009120、dabrafenib mesylate和gw5074处理表达二次突变kit的baf3细胞48h，通过cck8实验检测kit介导的细胞增殖的结果；
26.图12为使用craf抑制剂zm336372、ly3009120、dabrafenib mesylate和gw5074处理gist-t1细胞48h，通过cck8实验检测kit介导的细胞增殖的结果。
具体实施方式
27.本发明提供了craf抑制剂在制备抗肿瘤的药物中的应用。
28.本发明还提供了craf抑制剂联合kit抑制剂在制备抗肿瘤的药物中的应用。
29.在本发明中，所述kit抑制剂优选的包括伊马替尼(imatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、瑞戈非尼(regorafenib)和瑞普替尼(ripretinib)中的一种或几种。在本发明中，所述imatinib、sunitinib、regorafenib和ripretinib来源于常规市售。
30.在本发明中，所述craf抑制剂优选的包括zm336372、ly3009120、甲磺酸达拉非尼(dabrafenib mesylate)和gw5074中的一种或几种。在本发明中，所述craf抑制剂来源于常规市售。在本发明中，所述dabrafenib mesylate为atp竞争型的raf抑制剂，抑制c-raf和b-rafv600e的ic50分别为5nm和0.6nm。
31.在本发明中，craf抑制剂联合kit抑制剂使用时，本发明对craf抑制剂和kit抑制剂之间的比例没有特殊限制。
32.在本发明中，所述肿瘤优选的包括由kit突变引起的肿瘤。在本发明中，所述肿瘤优选的包括对kit抑制剂产生耐药性的肿瘤。在本发明中，所述肿瘤优选的包括胃肠道间质瘤、急性髓系白血病、肥大细胞增多症、恶性黑色素瘤或生殖细胞瘤。
33.本发明还提供了craf抑制剂在制备抑制kit活化的药物中的应用。
34.本发明提供了一种抗肿瘤药物，活性成分包括craf抑制剂，还包括药学上可接受的辅料。本发明对所述药物的剂型没有特殊限制，采用本领域的常规剂型即可。在本发明中，所述辅料优选为生理盐水或葡萄糖。
35.在本发明中，所述活性成分优选的还包括kit抑制剂。
36.在本发明中，craf抑制剂不仅能够抑制ras/raf/mek/erk信号通路中mek/erk的活化，还能直接抑制kit的活化，进而抑制其它kit下游信号通路的活化(如pi3k/akt信号通路)。craf抑制剂对kit及其下游信号通路活化的抑制实现了通过不同的机制有效抑制kit活化，可以显著抑制kit相关肿瘤细胞的发生发展。craf抑制剂在临床上的应用有助于克服目前面临的肿瘤治疗耐药性问题。
37.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
38.实施例1 craf抑制剂对kit及其下游信号传递的抑制作用
39.将存在野生型kit(wt kit)dna的质粒pmscvpuro-wt kit作为模板，设计引物通过点突变方法使该质粒获得胃肠道间质瘤常见突变kit/v560d、kit/w557k558del，得到pmscvpuro-kit/v560d及pmscvpuro-kit/w557k558del质粒，将以上三种质粒各自与lipo2000共同孵育，然后分别加到ecopack细胞培养基中，转染ecopack细胞，48h后收集病毒上清感染baf3细胞(baf3细胞不表达内源性kit)，然后用1.2μg/ml嘌呤霉素筛选2周，用流式细胞术和western blot检测kit在baf3细胞中的表达，以建立稳定表达野生型kit(wt kit)，胃肠道间质瘤常见突变kit/v560d、kit/w557k558del的baf3细胞系。然后使用不同craf抑制剂(zm336372、ly3009120、甲磺酸达拉非尼和gw5074)分别处理以上三种细胞系以及表达内源性kit突变的胃肠道间质瘤细胞系gist-t1，通过免疫共沉淀和western blot检测发现craf抑制剂可明显抑制kit及其下游信号通路(ras/raf/mek/erk通路和pi3k/akt通路)的活化。实验结果如图1～图5所示。实验结果显示随着craf抑制剂浓度的增高，kit的活化(pkit)及其下游通路的活化(perk和pakt)均逐渐减弱。实验结果显示craf抑制剂可明显抑制kit及其下游信号通路的活化。
40.实施例2 craf抑制剂在kit相关肿瘤细胞增殖中的抑制作用
41.使用craf抑制剂处理表达野生型kit和w557k558del以及v560d突变的baf3细胞及表达内源性kit突变的gist-t1细胞，通过cck8实验检测kit介导的细胞增殖，验证craf抑制剂对kit介导的细胞增殖的影响。结果参见图6～图9。结果发现craf抑制剂明显抑制了细胞增殖，说明该抑制剂有望用于kit相关肿瘤的治疗。
42.实施例3 craf抑制剂用于耐药性kit相关肿瘤的治疗
43.胃肠道间质瘤在imatinib治疗后复发的一个主要机制是肿瘤在原发性kit突变(一次突变)的基础上又获得了新的突变(二次突变)，该二次突变导致了患者的imatinib耐药，从而使患者生存期下降。我们使用pmscvpuro-kit/w557k558del一次突变质粒作为模板，设计引物通过点突变方法将该质粒在存在w557k558del一次突变的基础上再获得常见的v654a二次突变，得到pmscvpuro-kit/w557k558del/v654a质粒，将该质粒与lipo2000共同孵育，然后加到ecopack细胞培养基中，转染ecopack细胞，48h后收集病毒上清感染baf3细胞，然后用1.2μg/ml嘌呤霉素筛选2周，用流式细胞术和western blot检测kit在baf3细胞中的表达，以建立稳定表达耐药性kit二次突变的baf3细胞系。然后使用不同craf抑制剂处理以上baf3细胞系，通过免疫共沉淀和western blot检测发现craf抑制剂可明显抑制kit及其下游信号通路(ras/raf/mek/erk通路和pi3k/akt通路)的活化。实验结果见图10。结果显示随着craf抑制剂浓度的增高，kit的活化(pkit)及其下游通路的活化(perk和pakt)均逐渐减弱。实验结果显示craf抑制剂可明显抑制耐药性kit及其下游信号通路的活化。。
44.实施例4
45.使用craf抑制剂处理表达kit/w557k558del/v654a二次突变的baf3细胞，通过cck8实验检测kit介导的细胞增殖，检测craf抑制剂对耐药性kit相关肿瘤细胞细胞增殖的影响。结果参见图11。结果发现craf抑制剂可明显抑制耐药性肿瘤细胞的增殖，说明该抑制剂有望用于耐药性kit相关肿瘤的治疗。
46.实施例5
47.craf抑制剂与kit抑制剂联合应用对kit相关肿瘤细胞增殖的作用
48.本发明使用craf抑制剂与kit抑制剂imatinib联合处理胃肠道间质瘤细胞系gist-t1细胞，通过cck8实验检测kit介导的细胞增殖变化。结果参加图12。结果显示低浓度craf抑制剂与低浓度kit抑制剂联合应用对kit介导的细胞增殖的抑制作用明显优于低浓度kit抑制剂单独作用或低浓度raf抑制剂单独作用，说明craf抑制剂与kit抑制剂联合治疗有助于提高kit相关肿瘤的治疗效果。
49.尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。