一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR方法、引物及试剂盒与流程

技术特征：
1.一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重pcr-sbt方法，其特征在于：所述方法对24个红细胞血型抗原系统的基因进行分型，具体包括以下步骤：(1)制备人基因组dna，作为pcr扩增的模板；(2)根据不同血型系统预期的扩增片段大小分成6组，每组体系中提供有4或6对扩增引物，对6组分别进行多重pcr反应，扩增人基因组dna中24个红细胞抗原系统的基因片段；(3)将步骤(2)得到的扩增产物进行酶切纯化；(4)对6组扩增片段分别进行测序pcr反应，共有52个反应体系，每个反应体系中含有一条测序引物，将步骤(3)得到的纯化产物进行测序pcr反应；(5)将步骤(4)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；(6)将步骤(5)获得的序列通过软件分析，确定其基因型；步骤(2)中所述6组多重pcr反应体系，分别扩增的血型抗原系统为：1组扩增gill、kidd、fors、knops血型系统；2组扩增raph、john milton hagen、p1pk、duffy、mns(ss等位基因)、landsteiner-wiener血型系统；3组扩增i、vel、kell、colton血型系统；4组扩增mns(mn等位基因)、lutheran、diego、indian血型系统；5组扩增ok、cd59(3号外显子，cd59-3)、dombrock、scianna血型系统；6组扩增cd59(2号外显子，cd59-2)、cromer、yt、augustine血型系统；相应地，步骤(2)中所述扩增引物共26对，1组扩增引物由seq id no.9-1、seq id no.9-2、seq id no.14-1、seq id no.14-2、seq id no.21-1、seq id no.21-2、seq id no.25-1、seq id no.25-2组成；2组扩增引物由seq id no.1-1、seq id no.1-2、seq id no.2-1、seq id no.2-2、seq id no.5-1、seq id no.5-2、seq id no.10-1、seq id no.10-2、seq id no.15-1、seq id no.15-2、seq id no.26-1、seq id no.26-2组成；3组扩增引物由seq id no.3-1、seq id no.3-2、seq id no.11-1、seq id no.11-2、seq id no.16-1、seq id no.16-2、seq id no.19-1、seq id no.19-2组成；4组扩增引物由seq id no.4-1、seq id no.4-2、seq id no.12-1、seq id no.12-2、seq id no.17-1、seq id no.17-2、seq id no.22-1、seq id no.22-2组成；5组扩增引物由seq id no.6-1、seq id no.6-2、seq id no.8-1、seq id no.8-2、seq id no.18-1、seq id no.18-2、seq id no.23-1、seq id no.23-2组成；6组扩增引物由seq id no.7-1、seq id no.7-2、seq id no.13-1、seq id no.13-2、seq id no.20-1、seq id no.20-2、seq id no.24-1、seq id no.24-2组成。2.如权利要求1所述的人红细胞血型抗原系统基因分型的多重pcr-sbt方法，其特征在于：所述多重pcr反应体系包括：2
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multiplex pcr buffer 10μl；每个引物浓度50μmol/l，引物用量范围为0.04-0.20μl；multiplex pcr enzyme mix 0.1μl；50-100ng/μl的基因组dna 2μl；余量以h2o补足至20μl；扩增程序为：94℃预变性1min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，反应30个循环，72℃10min扩增片段充分延伸。3.如权利要求1所述的人红细胞血型抗原系统基因分型的多重pcr-sbt方法，其特征在于：所述步骤(3)中酶切纯化所需的酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶ⅰ。4.如权利要求1所述的人红细胞血型抗原系统基因分型的多重pcr-sbt方法，其特征在于：26对测序引物与26对扩增引物相同，测序反应中的测序引物为各血型抗原系统一对测序引物中的任意一条。
5.如权利要求1所述的人红细胞血型抗原系统基因分型的多重pcr-sbt方法，其特征在于：所述测序pcr反应体系包括：5
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缓冲液1.6μl；bigdye mix 0.8μl；测序引物1 1.0μl；dna 2.0μl；h2o 4.6μl；测序反应程序为：预变性96℃3min，96℃变性10s，50℃退火10s，60℃延伸4min，延长扩增片段，25个循环。6.一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重pcr-sbt方法用引物组合物，其特征在于：扩增引物分6组，所述1组扩增引物由seq id no.9-1、seq id no.9-2、seq id no.14-1、seq id no.14-2、seq id no.21-1、seq id no.21-2、seq id no.25-1、seq id no.25-2组成；2组扩增引物由seq id no.1-1、seq id no.1-2、seq id no.2-1、seq id no.2-2、seq id no.5-1、seq id no.5-2、seq id no.10-1、seq id no.10-2、seq id no.15-1、seq id no.15-2、seq id no.26-1、seq id no.26-2组成；3组扩增引物由seq id no.3-1、seq id no.3-2、seq id no.11-1、seq id no.11-2、seq id no.16-1、seq id no.16-2、seq id no.19-1、seq id no.19-2组成；4组扩增引物由seq id no.4-1、seq id no.4-2、seq id no.12-1、seq id no.12-2、seq id no.17-1、seq id no.17-2、seq id no.22-1、seq id no.22-2组成；5组扩增引物由seq id no.6-1、seq id no.6-2、seq id no.8-1、seq id no.8-2、seq id no.18-1、seq id no.18-2、seq id no.23-1、seq id no.23-2组成；6组扩增引物由seq id no.7-1、seq id no.7-2、seq id no.13-1、seq id no.13-2、seq id no.20-1、seq id no.20-2、seq id no.24-1、seq id no.24-2组成。7.如权利要求6所述的一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重pcr-sbt方法用引物组合物，其特征在于：测序引物与所述扩增引物相同，各测序反应中的测序引物为各血型抗原系统一对测序引物中的任意一条。8.一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重pcr-sbt方法用试剂盒，其特征在于：所述人红细胞血型抗原系统基因分型的多重pcr-sbt方法用试剂盒包括权利要求6所述的人红细胞血型抗原系统基因分型的多重pcr-sbt方法用扩增引物组合物。9.如权利要求8所述的一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重pcr-sbt方法用试剂盒其特征在于：还包括权利要求7所述的人红细胞血型抗原系统基因分型的多重pcr-sbt方法用测序引物组合物。10.如权利要求8所述的一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重pcr-sbt方法用试剂盒，其特征在于：还包括酶切用的虾碱性磷酸酶和核酸外切酶i。

技术总结
本发明提供一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法、引物及试剂盒。所述多重PCR-SBT方法对24个红细胞血型系统基因在同一多重扩增反应体系、反应程序和测序反应下进行分型，具体包括以下步骤：(1)制备人基因组DNA，作为PCR扩增的模板；(2)在同一PCR反应体系中，提供多对扩增引物，用聚合酶链反应多重扩增人基因组DNA中24个红细胞抗原系统的基因序列；(3)将步骤(2)得到的扩增产物进行双酶切纯化；(4)提供测序引物，将步骤(3)得到的纯化产物进行测序PCR反应；(5)将步骤(4)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；(6)将步骤(5)获得的序列通过软件分析，确定其基因型。确定其基因型。确定其基因型。


技术研发人员：朱发明 应燕玲 张晶晶 洪小珍 何吉
受保护的技术使用者：浙江省血液中心
技术研发日：2021.09.23
技术公布日：2022/1/18