检测乳制品中残留兽药的方法与流程

1.本发明涉及食品领域。具体地，本发明涉及检测乳制品中残留兽药的方法。


背景技术：

2.目前牛奶中兽药残留检测涉及到的gb、gb/t及农业部标准检测方法等多于50个，这些标准检测方法都是单个或单类兽残检测方法，前处理方法各不相同，用于检测时牛奶中兽药残留时工作量大、耗时久且需要投入大量人力。针对这种情况，通过开发液相色谱质谱联用的大通量筛查方法，实现一针进样同时检测多个兽残项目的目的，该分析方法高效且可满足最大残留限量(mrl)要求，可以进行快速定性筛查，弥补试纸条和试剂盒的假阳性结果的不足，提高定性分析的准确度，同时可以进行准确定量分析，对奶源管理和控制风险有较大指导意义。
3.目前，现有对牛奶中兽药残留的检测方法通常可以同时检测出十几种物质，但是，仍难于满足目前一次性同时检测更多种兽药残留的要求。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了检测乳制品中兽药残留的方法，该方法可以同时检测多达42种兽药残留，并且具有准确性强和精密度高等优点，适于推广应用。
5.在本发明的一个方面，本发明提出了一种乳制品中兽药残留的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将乳制品与高氯酸溶液进行混合，离心，收集上清液；采用萃取柱对所述上清液进行萃取，收集萃取液；将所述萃取液进行液相色谱-质谱检测，以便同时检测多种兽药残留；其中，所述兽药选自其中，所述兽药选自磺胺类、β-内酰胺类、头孢类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、糖皮质激素类和酰胺醇类的至少之一。
6.根据本发明实施例的检测乳制品中兽药残留的方法采用高氯酸作为提取溶剂，可以同时提取出上述几类兽药的10种、20种、30种甚至42种兽药残留，然而，其他提取溶剂几乎难以同时提取出如此多种兽药，所以无法满足同时检测的目的。由此，根据本发明实施例的方法可以同时检测多达42种兽药残留，并且具有准确性强和精密度高等优点，适于推广应用。
7.根据本发明的实施例，检测乳制品中残留兽药的方法还可以具有下列附加技术特征：
8.根据本发明的实施例，所述萃取柱选自cleanert pep-2固相萃取柱。发明人对众多固相萃取柱进行研究时发现，cleanert pep-2固相萃取柱可以同时吸附多达42种兽药残留，且通过一种洗脱液即可将其从萃取柱上洗脱下来，方便操作，检测结果准确性强、精密度高。
9.根据本发明的实施例，基于1g所述乳制品，所述高氯酸溶液的添加量为0.5～2ml，浓度为0.2～0.8体积％。发明人经过大量实验得到上述较优配比，由此，可以充分保证全部
提取出乳制品中多达42种兽药残留，保证检测结果准确性。
10.根据本发明的实施例，所述萃取柱预先经甲醇和活化，其中，所述甲醇与水的体积比为1：(0.5～1.5)。由此，便于萃取柱有效吸附多达42种兽药残留。
11.根据本发明的实施例，所述萃取包括：将所述上清液加入到萃取柱中，用水淋洗所述萃取柱，再用甲醇洗脱，收集流出的萃取液。发明人发现，采用甲醇这一种洗脱液即可将多达42种兽药残留从萃取柱上完全洗脱下来，避免少量残留在柱上，导致检测结果偏低。
12.根据本发明的实施例，进行液相色谱-质谱检测之前，将所述萃取液在氮气下吹干，然后用乙腈水溶液混合，得到待测液，再将所述待测液进行所述液相色谱-质谱检测。采用乙腈和水可以充分同时溶解多达42种兽药残留，且不影响后续流动相的分离效果。
13.根据本发明的实施例，所述乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为1：(4～8)。由此，可以充分同时溶解多达42种兽药残留，且不影响后续流动相的分离效果。
14.根据本发明的实施例，所述液相色谱-质谱检测所采用的液相色谱检测条件如下：色谱柱：acquity beh c18(2.1*100mm，1.7μm)；柱温：40℃；流动相：a为0.1体积％的甲酸水溶液，b为乙腈；流速：0.3ml/min；进样体积：1μl；梯度洗脱条件如下。发明人经过大量实验得到上述较佳检测条件，由此，可以有效地分离多达42种兽药残留，且检测结果准确性强、精密度高。
[0015][0016][0017]
根据本发明的实施例，所述兽药选自头孢氨苄、头孢喹肟、头孢匹罗、青霉素g、阿莫西林、氨苄西林、氯唑西林、苯唑西林、林可霉素、替米考星、泰乐菌素、达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星、氟甲喹、环丙沙星、洛美沙星、麻保沙星、诺氟沙星、恶喹酸、培氟沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、依诺沙星、四环素、金霉素、土霉素、磺胺嘧啶、磺胺醋酰、磺胺多辛、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲基异恶唑、磺胺二甲唑、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺二甲异噁唑、磺胺甲氧哒嗪、甲氧苄氨嘧啶和甲砜霉素中的至少10种、20种、30种或全部。
[0018]
根据本发明的实施例，所述乳制品选自生牛乳。
[0019]
在本发明的另一方面，本发明提出了一种检测乳制品中残留兽药的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：称取1.0g生牛乳试样于2ml离心管中，加入1ml 0.5体积％的
高氯酸溶液后涡旋混匀，15000r/min离心10min，取上清液加入到预先经3ml甲醇、3ml水活化的cleanert pep-2固相萃取柱，再依次用水进行淋洗、用甲醇洗脱，收集流出的萃取液并在氮气下吹干，用乙腈与水的体积比为15:85的乙腈水溶液定容至1ml，过0.22μm有机滤膜，得到待测液，将所述待测液进行液相色谱-质谱检测，其中，所述液相色谱的检测条件如下：色谱柱：acquity beh c18(2.1*100mm，1.7μm)；柱温：40℃；流动相：a为0.1体积％的甲酸水溶液，b为乙腈；流速：0.3ml/min；进样体积：1μl；梯度洗脱条件：
[0020]
时间(min)流速(ml/min)a％b％/0.395510.395550.38515140.36040160.3298210.3298210.3955240.3955
[0021]
；
[0022]
所述兽药选自头孢氨苄、头孢喹肟、头孢匹罗、青霉素g、阿莫西林、氨苄西林、氯唑西林、苯唑西林、林可霉素、替米考星、泰乐菌素、达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星、氟甲喹、环丙沙星、洛美沙星、麻保沙星、诺氟沙星、恶喹酸、培氟沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、依诺沙星、四环素、金霉素、土霉素、磺胺嘧啶、磺胺醋酰、磺胺多辛、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲基异恶唑、磺胺二甲唑、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺二甲异噁唑、磺胺甲氧哒嗪、甲氧苄氨嘧啶和甲砜霉素中的至少10种、20种、30种或全部。
[0023]
由此，根据本发明实施例的方法可以同时检测多达42种兽药残留，并且具有准确性强和精密度高等优点，适于推广应用。
[0024]
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0025]
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0026]
图1显示了头孢氨苄标准曲线；图2显示了头孢喹肟标准曲线；图3显示了头孢匹罗标准曲线；图4显示了青霉素g标准曲线；图5显示了氨苄西林标准曲线；图6显示了阿莫西林标准曲线；图7显示了氯唑西林标准曲线；图8显示了苯唑西林标准曲线；图9显示了泰乐菌素标准曲线；图10显示了替米考星标准曲线；图11显示了克林霉素标准曲线；图12显示了达氟沙星标准曲线；图13显示了二氟沙星标准曲线；图14显示了恶喹酸标准曲线；图15显示了恩诺沙星标准曲线；图16显示了氟甲喹标准曲线；图17显示了洛美沙星标准曲线；图18显示了麻保沙星标准曲线；图19显示了诺氟沙星标准曲线；图20显示了培氟沙星标准曲线；图21显示了氧氟沙星标准曲线；图22显示了依诺沙星标准曲线；图23显示了沙拉沙星标准曲线；
图24显示了金霉素标准曲线；图25显示了四环素标准曲线；图26显示了土霉素标准曲线；图27显示了磺胺吡啶标准曲线；图28显示了磺胺对甲氧嘧啶标准曲线；图29显示了磺胺多辛标准曲线；图30显示了磺胺二甲基异嘧啶标准曲线；图31显示了磺胺二甲嘧啶标准曲线；图32显示了环丙沙星标准曲线；图33显示了磺胺二甲异噁唑标准曲线；图34显示了磺胺二甲唑标准曲线；图35显示了磺胺甲基异噁唑标准曲线；图36显示了磺胺甲噻二唑标准曲线；图37显示了磺胺甲氧哒嗪标准曲线；图38显示了磺胺嘧啶标准曲线；图39显示了磺胺噻唑标准曲线；图40显示了磺胺醋酰标准曲线；图41显示了甲氧苄氨嘧啶标准曲线；图42显示了甲砜霉素标准曲线。
具体实施方式
[0027]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0028]
实施例1
[0029]
1、试剂及材料
[0030]
(1)各种标准物质纯度均满足国标要求。
[0031]
(2)水为gb/t 6682-2008规定的一级水或超纯水，甲醇(质谱级)，甲酸(质谱级)，高氯酸(分析纯)，0.5％的高氯酸溶液：取0.5ml高氯酸加入到100ml水中。乙腈水溶液：15％(体积分数)。
[0032]
(3)标准储备液：分别称取头孢氨苄、头孢喹肟、头孢匹罗、林可霉素、泰乐菌素、二氟沙星、恩诺沙星、麻保沙星、诺氟沙星、恶喹酸、培氟沙星、沙拉沙星、依诺沙星、达氟沙星、磺胺嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲唑、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺二甲异噁唑、磺胺甲氧哒嗪、甲氧苄氨嘧啶、氟甲喹、洛美沙星、四环素、金霉素、土霉素素、环丙沙星、磺胺多辛、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、达氟沙星、替米考星标准品各0.0100g，用甲醇溶解定容到100.0ml，标准储备液的浓度为100μg/ml，于冰箱中冷冻保存6个月。分别称取青霉素g、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、甲砜霉素标准品各0.0100g，用乙腈水(体积比1:1)溶解定容到100.0ml，标准储备液的浓度为100μg/ml，于冰箱中冷冻保存6个月。
[0033]
(4)混合标准中间液：取上述各标准储备液各1ml至100.0ml容量瓶中，用水稀释配制成标准中间液，浓度为1.0μg/ml，于冰箱中冷藏保存3周。
[0034]
(5)标准工作液：根据需要，吸取一定量的混合标准中间液，用空白基质稀释至所需浓度，现用现配。
[0035]
2、仪器与设备
[0036]
高效液相色谱-质谱/质谱联用仪：ab qtrap6500 。
[0037]
色谱柱：acquity beh c18(2.1*100mm，1.7μm)或性能相当者。
[0038]
固相萃取装置。
[0039]
高速离心机。
[0040]
氮吹仪。
[0041]
滤器：0.2μm有机滤器。
[0042]
cleanert pep-2固相萃取柱。
[0043]
3、样品处理
[0044]
称取1.0g生牛乳试样(精确到0.001g)于2ml离心管中，准确加入1ml 0.5体积％的高氯酸溶液后涡旋混匀，15000r/min离心10min，取上清液加入到经3ml甲醇、3ml水活化的cleanert pep-2固相萃取柱，再用水进行淋洗，用甲醇洗脱，收集的萃取液在氮气下吹干，用乙腈水(乙腈和水的体积比15:85)定容至1ml，过0.22μm有机滤膜后供液相色谱-串联质谱进行测定。
[0045]
4、仪器参考条件
[0046]
(1)液相色谱参考条件
[0047]
柱温：40℃；
[0048]
流动相：a为0.1％甲酸水，b为乙腈；
[0049]
流速：0.3ml/min；
[0050]
进样体积：1μl；
[0051]
梯度洗脱条件：
[0052]
表1液相色谱参考梯度洗脱条件
[0053]
时间(min)流速(ml/min)a％b％/0.395510.395550.38515140.36040160.3298210.3298210.3955240.3955
[0054]
(2)质谱参考条件
[0055]
电离方式：esi( )、esi(-)；
[0056]
气帘气：40psi；
[0057]
电离电压：5.5kv；
[0058]
温度：550℃；
[0059]
喷雾气：50psi；
[0060]
辅助加热器：55psi；
[0061]
碰撞气：medium；
[0062]
采集方式：多反应监测(mrm)。
[0063]
表2各物质的离子对及能量参考参数
[0064]
[0065]
[0066]
[0067]
[0068][0069]
5、标准曲线
[0070]
标准曲线(1、2、5、10、20、50ng/ml)线性范围在0.9857～0.9999之间，符合gb/t27404附件f中的至少做5个点且对于筛选方法线性回归方程相关系数不低于0.98的要求，具体见图1～42。
[0071]
6、方法检出限
[0072]
按照取样量1.0g时，头孢氨苄、头孢喹肟、头孢匹罗、青霉素g、阿莫西林、氨苄西林、氯唑西林、苯唑西林、林可霉素、泰乐菌素、二氟沙星、恩诺沙星、麻保沙星、诺氟沙星、恶喹酸、培氟沙星、沙拉沙星、依诺沙星、达氟沙星、磺胺嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲唑、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺二甲异噁唑、磺胺甲氧哒嗪、甲氧苄氨嘧啶、甲砜霉素检出限为1μg/kg，氟甲喹、洛美沙星、氧氟沙星检出限为0.5μg/kg，四环素、金霉素、土霉素检出限为50μg/kg，环丙沙星、磺胺多辛、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、替米考星检出限为5μg/kg，具体结果见下表，检出限信噪比均大于3。
[0073]
表3各物质在检出限时的信噪比
[0074]
[0075][0076]
7、回收率和精密度
[0077]
添加量在1～5μg/kg的回收率范围在61.07～116.0％范围，具体见下表4，符合gb/t 27404附件f中添加量《0.1mg/kg时回收率要求在60～120％范围内的要求。
[0078]
添加量分别是1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg，且每组添加量分别做六组平行测试，精密度范围在0.47～21.93％，具体见表4，符合gb/t 27404附件f中精密度变异系数小于30％的要求。
[0079]
表4各物质回收率、精密度测定
[0080]
[0081]
[0082]
[0083]
[0084][0085]
对比例1
[0086]
按照实施例1的方法检测，区别在于，萃取柱采用hlb固相萃取柱。
[0087]
结果表明，该萃取柱单独用于四环素的测定时效果较好，但是用于同时检测多种兽药残留时，回收率低，不适用。
[0088]
对比例2
[0089]
按照实施例1的方法检测，区别在于，将高氯酸替换为乙腈。
[0090]
结果表明，采用乙腈作为提取剂，提取效果差，大多数磺胺类和四环素类不能被有效提取，直接影响回收率和检出限。
[0091]
对比例3
[0092]
按照实施例1的方法检测，区别在于，将甲醇替换为乙腈。
[0093]
结果表明，采用乙腈洗脱萃取柱，将导致大多数兽药色谱峰不能完全分离，无法实现检测目的。
[0094]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0095]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。