一种黑骨藤药材中多种成分含量测定的方法与流程

1.本发明涉及中药检测技术领域，具体是一种黑骨藤药材中多种成分含量测定的方法。


背景技术：

2.黑骨藤为萝藦科杠柳属植物黑龙骨(periploca forrestii schltr.) 的干燥根或全株，被收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003 年版)中，是贵州省苗族常用药材之一。黑骨藤主要有通经、活血和祛风等功效，其药理作用主要有抗炎、镇痛及抗类风湿关节炎等，主要用于风湿关节痛、跌打损伤等症的治疗。临床应用结果显示：黑骨藤及其复方制剂对风湿病、类风湿病有较好的疗效。
3.黑骨藤被收载于2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》，但是尚无标准对其活性成分进行含量测定，所以黑骨藤药材质量标准不完善，不能较全面的控制黑骨藤药材的内在质量。
4.申请人对黑骨藤进行了化学成分分析，发现其含有1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、 4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、5-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸、4-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯和杠柳苷元等成分。申请人的前期研究表明这些成分均可能是其活性有益成分。
5.因此，开发一种能同时测定黑骨藤药材中1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、5-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸、4-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯和杠柳苷元等多种有益成分含量的测定方法是很有必要的。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种黑骨藤药材中多种成分含量测定的方法，具体如下：
7.一种黑骨藤药材中多种成分含量测定的方法，采用uplc-pda 方法进行测定，以waters acquity uplc beh c18(2.1
×
50mm， 1.7μm)为色谱柱，检测波长为225nm和330nm，流速为0.35ml/min，柱温为38℃。并用乙腈-0.1％甲酸水溶液进行梯度洗脱。
8.进一步的，所述uplc-pda方法，以黑骨藤药材提取液稀释后作为供试品溶液。
9.所述黑骨藤药材提取液是以50％甲醇为溶剂对黑骨藤进行提取得到，用50％甲醇对苗药黑骨藤药材进行回流提取时提取效率较高，且不会导致黑骨藤中的有益成分被破坏。
10.所述稀释，是用蒸馏水将黑骨藤药材提取液稀释2.5倍。此比例稀释后uplc-pda测定效果较好。
11.所述黑骨藤药材，是过三号筛的黑骨藤药材粉末，过三号筛的黑骨藤药材粉末提取效果较好。
12.进一步的，所述供试品溶液，具体通过如下步骤制备得到：取过三号筛的黑骨藤药材粉末1g，并精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20ml，称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，量取续滤液10ml，转移至25ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。此时黑骨藤药材提取效率更高，供试液浓度也较为适中，测定所得结果较为精确。
13.进一步的，所述uplc-pda方法，以1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、5-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸、4-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯和杠柳苷元的溶解到50％甲醇中得到的混合溶液作为对照品溶液。
14.进一步的，所述对照品溶液，其中1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为50.0μg/ml、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为16.0μg/ml、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为20.0μg/ml、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为40.0μg/ml、5-o-咖啡酰基奎宁酸浓度为100.0μg/ml、3-o-咖啡酰基奎宁酸浓度为80.0μg/ml、4-o-咖啡酰基奎宁酸浓度为120.0μg/ml、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯浓度为64.0μg/ml、杠柳苷元浓度为80.0μg/ml。
15.进一步的，所述对照品溶液通过如下方法制备得到：
16.(1)分别精密称取1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、5-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸、4-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯和杠柳苷元置于10ml量瓶中，加50％甲醇溶解并定容至刻度，分别得1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为1.25mg/ml、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为0.400mg/ml、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为0.500mg/ml、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为1.00mg/ml、5-o-咖啡酰基奎宁酸浓度为2.50mg/ml，3-o-咖啡酰基奎宁酸浓度为2.00mg/ml、4-o-咖啡酰基奎宁酸浓度为3.00mg/ml、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯浓度为1.60mg/ml、杠柳苷元为2.00mg/ml；
17.(2)分别精密量取上述9种对照品储备液，经稀释后置同一个25ml容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液，其中1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为50.0μg/ml、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为16.0μg/ml、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为20.0μg/ml、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为40.0μg/ml、5-o-咖啡酰基奎宁酸浓度为100.0μg/ml、3-o-咖啡酰基奎宁酸浓度为80.0μg/ml、4-o-咖啡酰基奎宁酸浓度为120.0μg/ml、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯浓度为64.0μg/ml、杠柳苷元浓度为80.0μg/ml。
18.进一步的，所述uplc-pda方法，以watersacquityuplcbehc18(2.1
×
50mm，1.7μm)为色谱柱，检测波长为225nm和330nm，流速为0.35ml/min，柱温为38℃，进样量为10μl，流动相为乙腈(a)-0.1％甲酸水溶液(b)进行梯度洗脱，洗脱程序如下：
[0019][0020]
本发明的具体操作步骤如下：
[0021]
(1)制备供试品溶液和对照品溶液
[0022]
供试品溶液的制备：
[0023]
取过三号筛的黑骨藤药材粉末1g，并精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20ml，称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，量取续滤液 10ml，转移至25ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
[0024]
对照品溶液的制备：
[0025]
分别精密称取1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、5-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸、4-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯和杠柳苷元置于10ml量瓶中，加50％甲醇溶解并定容至刻度，分别得1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为1.25mg/ml、3,4-o
‑ꢀ
二咖啡酰基奎宁酸浓度为0.400mg/ml、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为0.500mg/ml、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为1.00mg/ml、5-o
‑ꢀ
咖啡酰基奎宁酸浓度为2.50mg/ml、3-o-咖啡酰基奎宁酸浓度为2.00 mg/ml、4-o-咖啡酰基奎宁酸浓度为3.00mg/ml、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯浓度为1.60mg/ml、杠柳苷元为2.00mg/ml。分别精密量取上述9种对照品储备液，经稀释后置同一个25ml容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液。1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为50.0μg/ml、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为16.0μg/ml、 3,5-o-二咖啡酰基
奎宁酸浓度为20.0μg/ml、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为40.0μg/ml、5-o-咖啡酰基奎宁酸浓度为100.0μg/ml、3-o
‑ꢀ
咖啡酰基奎宁酸浓度为80.0μg/ml、4-o-咖啡酰基奎宁酸浓度为120.0 μg/ml、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯浓度为64.0μg/ml、杠柳苷元浓度为80.0μg/ml
[0026]
(2)测定过程：分别取混合对照品溶液和供试品溶液，利用 uplc-pda测定，得色谱图，其中检测波长分别为225nm和330nm，其中色谱条件为：色谱柱为waters acquityuplc beh c18(2.1
×
50 mm，1.7μm)。柱温为38℃，流速为0.35ml/min，流动相为乙腈(a)
ꢀ‑
0.1％甲酸水溶液(b)进行梯度洗脱,洗脱程序如下：
[0027][0028]
对本技术中的技术方案，分别进行线性关系考察、精密度实验、重复性试验、稳定性试验和加样回收率实验。
[0029]
样品制备方法的筛选：
[0030][0031][0032]
为了选择稳定的样品制备方法，以溶剂、提取方式、提取时间为变量，对黑骨藤的提取方式进行筛选实验，结果如下：
[0033]
由上数据可知：以50％甲醇为溶剂时，提取效率最高；超声提取和水浴回流提取相较，回流提取效率较高；回流1h的提取效果较差，回流2h与3、4h的提取效果无较大差异。
[0034]
测定波长筛选：
[0035]
由于黑骨藤中这些待测成分均有紫外吸收，所以选择紫外检测器对待测成分进行检测。
[0036]
经pda检测器进行全波长扫描，各成分的最大吸收波长如下：
[0037]
成分最大吸收波长(nm)1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸328nm3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸330nm3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸327nm4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸336nm5-o-咖啡酰基奎宁酸331nm3-o-咖啡酰基奎宁酸332nm4-o-咖啡酰基奎宁酸329nm3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯326nm杠柳苷元225nm
[0038]
由上数据可知，杠柳苷元的最大吸收波长与其他成分的最大吸收波长相差较大，兼顾在同一波长检测，会明显影响检测灵敏度，综合考虑，选择双波长(225nm和330nm)对这
(天津市泰斯特仪器有限公司)。
[0049]
甲醇(分析纯)、乙腈(色谱纯)、甲酸(色谱纯)；实验用黑骨藤药材均由贵州医科大学药学院生药与药用植物学教研室刘春花副教授鉴定为黑骨藤periploca forrestii schltr.的干燥根及茎。
[0050]
供试品溶液的制备：
[0051]
取过三号筛的黑骨藤药材粉末1g，并精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20ml，称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，量取续滤液 10ml，转移至25ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
[0052]
对照品溶液的制备：
[0053]
分别精密称取1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、5-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸、4-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯和杠柳苷元置于10ml量瓶中，加50％甲醇溶解并定容至刻度。分别得1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为1.25mg/ml、3,4-o
‑ꢀ
二咖啡酰基奎宁酸浓度为0.400mg/ml、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为0.500mg/ml、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为1.00mg/ml、5-o
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咖啡酰基奎宁酸浓度为2.50mg/ml、3-o-咖啡酰基奎宁酸浓度为2.00 mg/ml、4-o-咖啡酰基奎宁酸浓度为3.00mg/ml、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯浓度为1.60mg/ml、杠柳苷元为2.00mg/ml。分别精密量取上述9种对照品储备液，经稀释后置同一个25ml容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液。1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为50.0μg/ml、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为16.0μg/ml、 3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为20.0μg/ml、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度为40.0μg/ml、5-o-咖啡酰基奎宁酸浓度为100.0μg/ml、3-o
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咖啡酰基奎宁酸浓度为80.0μg/ml、4-o-咖啡酰基奎宁酸浓度为120.0 μg/ml、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯浓度为64.0μg/ml、杠柳苷元浓度为80.0μg/ml。
[0054]
色谱条件：
[0055]
色谱柱为色谱柱为waters acquity uplc beh c18(2.1
×
50mm， 1.7μm)。柱温为38℃，流速为0.35ml/min，流动相为乙腈(a)-0.1％甲酸水溶液(b)进行梯度洗脱,其中检测波长分别为225nm和330 nm，进样量10μl。洗脱程序如下表所示。
[0056]
表1流动相梯度洗脱表
[0057][0058]
系统适应性考察：
[0059]
分别取混合对照品溶液和供试品溶液各10μl，在上述的色谱条件下，用uplc-pda测定，活性成分得到较好的分离，见图1。
[0060]
线性关系考察：
[0061]
分别精密吸取前述混合对照品溶液1、2、4、6、8、10μl，按上述色谱条件测定，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制工作曲线，结果见表2。
[0062]
表2回归方程和线性范围
[0063][0064]
精密度实验：
[0065]
取同一供试品溶液，连续进样6次，计算1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、5-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸、4-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯和杠柳苷元的峰面积，测得 rsd分别为1.1％、1.3％、1.5％、1.5％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％和1.4％。结果说明仪器精密度良好。取同一样品，连续3天进样分析，计算1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o
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二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、5-o-咖啡酰基奎宁酸、 3-o-咖啡酰基奎宁酸、4-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯和杠柳苷元的峰面积rsd，结果为1.9％、1.5％、1.8％、2.1％、1.8％、 1.6％、1.9％、2.0％和1.8％。
[0066]
重复性实验：
[0067]
取同一批号药材6份，精密称定，按前述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别测定。6份供试品溶液中1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、5-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸、4-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯和杠柳苷元的平均含量分别为1.1354、0.8375、0.6875、1.1821、2.315、1.634、2.5841、0.9347和 1.8952mg/g，含量结果rsd分别为
1.2％、2.4％、2.5％、1.7％、1.3％、 1.9％，1.1％、1.8％和1.7％，表明重复性良好。
[0068]
稳定性实验：
[0069]
分别按前述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别于0、2、 4、8、12、24h分别进样，测定各指标成分1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸， 3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、5-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸、4-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯和杠柳苷元峰面积。计算峰面积rsd，分别为1.7％、1.6％、1.2％、1.5％、1.8％、1.8％、1.3％、1.4％和1.1％，说明样品溶液在0至24小时内是稳定的。
[0070]
加样回收率实验
[0071]
按前述供试品溶液制备方法，制备9份50％取样量的供试品溶液，分别按黑骨藤中重复性测得各成分含量为本底值，分别加入50％、 100％、150％的对照品溶液，每个水平分别按前述供试品溶液制备方法制备3份供试品溶液，按前述色谱条件测定并计算9个成分的回收率，结果见表3。
[0072]
1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸平均回收率99.8％，rsd(％)为1.8％； 3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸平均回收率99.4％，rsd(％)为1.2％；3,5-o 二咖啡酰基奎宁酸平均回收率99.9％，rsd(％)为1.4％；4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸平均回收率99.9％，rsd(％)为1.0％；5-o-咖啡酰基奎宁酸平均回收率100.6％，rsd(％)为1.5％；3-o-咖啡酰基奎宁酸平均回收率99.9％，rsd(％)为1.6％；4-o-咖啡酰基奎宁酸平均回收率 100.2％，rsd(％)为2.0％；3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯平均回收率 99.8％，rsd(％)为2.3％；杠柳苷元平均回收率99.7％，rsd(％)为 2.1％。
[0073]
表3加样回收率实验结果
[0074][0075][0076]
样品测定
[0077]
收集贵州不同产地的黑骨藤，并利用已经建立的方法对1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o二咖啡酰基奎宁酸、 4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、5-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸、4-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯和杠柳苷元等成分进行含量测定，结果如表4所示。
[0078]
表4不同批次黑骨藤中9种成分的含量(mg/g，n＝3)
[0079][0080]
由上可知，本发明的方法能在12分钟内使黑骨藤药材中1,3-o
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二咖啡酰基奎宁酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、5-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸、4-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯和杠柳苷元得到较好的分离。该方法简便、快速、准确且重复性好，可用于黑骨藤药材中1,3-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、 4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、5-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸、4-o-咖啡酰基奎宁酸、3-o-咖啡酰基奎宁酸甲酯和杠柳苷元的含量测定，为黑骨藤药材的质量控制提供参考依据。
[0081]
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。