一种抗氧化的药物或抗氧化美白化妆品的制作方法

1.本发明涉及药物领域，更具体的涉及一种抗氧化的药物或抗氧化美白化妆品。


背景技术：

2.机体的衰老过程源于自由基对细胞及组织的损害。自由离子是人体在新陈代谢时产生的副产物。随着年龄的增长，人体自身的氧化还原系统失去平衡，对体内自由离子清除的能力逐渐减弱，从而自由基得以侵害我们的机体组织。抗氧化因子是天然成分，可以中和氧"自由基"、保护您的细胞免受伤害。不良的饮食习惯，繁重的生活压力，环境的污染都会消耗大量的营养，紊乱人的免疫系统。
3.对生命有机体来说，氧化作用是一个必要的过程，同时还会引起机体内生物大分子的损伤。虽然机体自身具有抗氧化防御体系，但是这些系统并不能完全有效地抵御或修复氧化作用带来的损伤。这时外加一些抗氧化剂有助于体内氧代谢的平衡。由于许多化学合成的抗氧化物存在安全问题，所以具有抗氧化活性的天然产物就倍受青睐。乳酸菌(lacticacid bacteria)是一种存在于人类体内的益生菌，能够耐受消化道环境，具有调节胃肠道正常菌群、预防和治疗腹泻、排除内毒素和提高机体免疫力等功能。国内外一些学者的研究表明部分乳酸菌具有抗氧化活性。已有研究表明利用动物实验证明了部分乳酸菌的抗氧化活性，部分嗜酸乳杆菌(l.acidophilus)有抗脂质过氧化和清除羟自由基的能力。但对于这些少部分的乳酸菌的抗氧化活性物质及其抗氧化机制至今尚不清楚。一般认为少部分的乳酸菌中可能具有一些抗氧化酶类物质(如超氧化歧化酶(sod)，nadh氧化酶(nadh oxidase)，过氧化氢酶(cat)等)使得其具有抗氧化活性。
4.而且，随着社会的进步和人们生活水平的提高，追求健康幸福和美丽成为人们的共同诉求。东方人想要得到白皙红润、细腻光滑的肌肤，而欧美消费者希望消除或减轻黄褐斑、老年斑，因此，使用抗氧化化妆品已成为人们日常生活的必需。但由于添加化学美白成分的抗氧化化妆品存在细胞毒性、致敏性和一些潜在的不安全因素，因此，寻求、开发添加天然抗氧化成分的安全、高效，且兼有营养功能的抗氧化化妆品成为化妆品领域研究的热点。我国有丰富的天然植物资源，提取天然产物中抗氧化成分，进而开发具有较好抗氧化特性的药物或者化妆品具有得天独厚的资源优势。
5.但是目前，针对天然组分发酵开发的抗氧化药物及相应的化妆品的研究还比较少，研究还不够多。


技术实现要素：

6.本发明采用特定的微生物发酵枸杞，获得了发酵液，从中筛选得到具有抗氧化抑制黑色素合成的多肽而实现了本发明。
7.一方面，本发明提供一种高抗氧化活性的发酵液的制备方法。
8.具体的，所述方法为将干枸杞倒入500ml三角瓶中，加水浸泡直到枸杞吸水饱满为止，以料液比为1∶6(m∶v)进行加水打浆，称取蔗糖和酵母膏加入到已打好的枸杞浆中，ph调
为6.0。按照2％接种量将菌体浓度为107cfu/ml的植物乳杆菌cgmcc no.1258混合到枸杞浆中，纱布封口放进摇床(130r
·
min-1
)中进行37℃发酵48h。
9.将购买的黑曲霉cgmcc 3.3927种到pda斜面培养基上活化3d，将活化的黑曲霉孢子接种于pda培养基28℃恒温培养5d。从pda培养基中取一定量黑曲霉孢子于生理盐水中，调整菌体浓度为106cfu/ml。按照6％接种量接种加入到发酵48h后的植物乳杆菌发酵液中，混合均匀后在30摄氏度条件下100r/min发酵80h，发酵结束后4000r/min 10min离心取上清液，即制备获得所述发酵液。
10.进一步的，根据发酵液中各组分的活性进行筛选，获得了特异性的高抗氧化活性抑制黑色素合成的多肽，其分别为yx-1多肽、yx-2多肽和yx-3多肽这三条多肽。所述三个多肽具有抗红细胞溶血具有较好的安全性，在实施例中的小鼠试验中也证明了所述多肽没有动物毒性，具有较好的安全效果。
11.进一步的，本发明还提供一种具有抗氧化活性的药物组合物。
12.所述药物组合物含有seq id no：1所示的多肽以及药学上可接受的载体。
13.其中，进一步的，本文还提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的上述肽产品或其可接受的盐，和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，载体是水基载体。在一些实施方案中，载体是非水基载体。在一些实施方案中，非水基载体是包含亚微米无水-乳糖或其它赋形剂的氢氟烷烃类溶剂。
14.本文所用的“载体”包括任何溶剂，分散介质，载体，涂层，稀释剂，等渗剂，吸收延迟剂，缓冲剂，载体溶液，悬浮液，胶体等。这种介质和/或试剂用于药物活性物质的用途在本领域中是众所周知的。除了任何常规介质或试剂与活性成分不相容之外，还考虑了其在治疗组合物中的用途。补充活性成分也可掺入组合物中。如本文所用，“药学上可接受的”是指不是生物学上或其它不希望的材料，即，该物质可以与多肽一起给予个体，而不会引起任何不希望的生物学效应或以有害的方式与含有它的药物组合物的任何其它组分相互作用。
15.药物组合物可以配制成适合于优选给药途径的各种形式。因此，组合物可以通过已知的途径给药，包括例如口服，胃肠外(例如皮内，经皮，皮下，肌内，静脉内，腹膜内等)或局部(例如鼻内，肺内，乳腺内，阴道内，子宫内，皮内，经皮，直肠等)。一种药物组合物可以施用到粘膜表面，例如通过施用到例如鼻粘膜或呼吸粘膜(例如通过喷雾或气雾剂)。一种组合物也可以通过持续或延迟释放给药。
16.在一些实施方案中，所述方法可包括给予受试者足够的多肽以提供例如约10ng/kg至约10mg/kg的剂量，尽管在一些实施方案中，所述方法可通过给予该范围之外的剂量的scfv抗体来进行。因此，在一些实施例中，该方法可包括以有效提供至少100ng/kg的最小剂量的量施用多肽，例如，例如，至少500ng/kg，至少5mg/kg，至少1mg/kg，至少2mg/kg，至少5mg/kg，至少7mg/kg，至少10mg/kg，至少250mg/kg，至少500mg/kg，至少1mg/kg，至少5mg/kg或至少10mg/kg。在一些实施例中，该方法可包括以有效提供最大剂量不超过10mg/kg的量施用多肽，例如，例如，不大于10mg/kg，不大于50g/kg，不大于2mg/kg，不大于1mg/kg，不大于0.1mg/kg。在一些实施方案中，所述方法可包括以有效提供剂量的量施用多肽，所述剂量落在具有由以上列出的任何最小剂量和大于所述最小剂量的以上列出的任何最大剂量限定的终点的范围内。在这些实施方案中的一些中，该方法包括给予受试者足够的多肽以提供约1mg/kg至约5mg/kg的剂量。
17.根据本发明所述的药学组成物可以分别按照通常的方法，以酸剂，颗粒剂，精制胶囊剂，悬浮液，糖浆，气溶胶等外溶剂及灭菌注射溶液的形式进行剂型化使用，并可用于上述组成物中。可能包含的载体赋形剂及稀释剂有：乳糖德克斯特罗斯手克罗斯托糖松香甘醇甘露醇木糖甘露醇木糖甘露醇木糖木糖甘露醇淀粉刺槐橡胶磷脂明胶钙硅胶钙硅胶纤维素甲基纤维素微晶纤维素聚乙烯醇吡咯烷酮；水；甲基羟苯甲酮；羟苯甲酮；脱镁；硬脂酸酯；及矿物油；制剂化时，通常使用的填充剂，增强剂，结合剂，润湿剂，分解剂，界面活性剂等稀释剂或赋形剂配制而成。口服给药的固体制剂包括精制环氧制剂颗粒制剂胶囊制剂等，这些固体制剂在上述化合物中至少有一个赋形剂，如淀粉钙碳化硅(calcium carbonate)，sucrose或乳糖(lactose)凝胶。等混合配制而成。另外，除了单纯的赋形剂外，还使用镁质泡沫塑料等润滑剂。用于硬球的液相制剂包括：悬浮剂内容液剂，乳剂，糖浆剂等，除常用的单纯稀释剂
‑‑
水立方石蜡外，还可包括多种赋形剂，如润湿剂，甜味剂，芳香剂，保鲜剂等。用于非经口投料的制剂包括灭菌水溶液非手性溶剂悬浮剂乳剂冻结干燥制剂佐剂。非手性溶剂悬浮剂可用于可注射的酯类，如丙二醇(propylene，glycol)聚乙二醇橄榄油。佐剂的机制可以是胃泌素(witepsol)，macro goltwin(tween)，61卡考基月桂基甘油三酯等。
18.本发明进一步的提供一种具有抗氧化和抑制黑色素合成的抗氧化美白化妆品，所述化妆品含有seq id no：1的多肽。
19.本发明的化妆品组成物所包含的成分为有效成分，除上述提取物外，还可包括化妆品组成物中通常使用的成分，如稳定剂溶解剂维生素颜料及香料等通常的助剂及包括载体。
20.本发明的化妆品原料组成物可制成为本行业通常制造的任何剂型，如乳液面霜，化妆水，粉底乳液，美容液，毛发化妆品等。
21.有益效果
22.本发明通过植物乳杆菌和黑曲霉发酵枸杞获得了抗高氧化活性的发酵液，从所述发酵液中分离鉴定获得了三个具有抗氧化和抑制黑色素合成的多肽，所述多肽一方面能够增强皮肤成纤维细胞的增殖另外一方面还具有抑制黑色素的合成和提高小鼠抗氧化能力，所述多肽具有在制备药物以及美白化妆品中的良好应用前景。
附图说明
23.图1多肽的抗氧化活性检测结果图
具体实施方式
24.以下为便于理解本发明的实施例及实验例。但是，以下实施例和实验例只是为了使本发明更易于理解而提供的，而不是由于以下实施例和实验例限制了本发明的内容。
25.实施例1枸杞多肽发酵液的制备
26.将20g干枸杞倒入500ml三角瓶中，加水浸泡直到枸杞吸水饱满为止，以料液比为1∶6(m∶v)进行加水打浆，称取1g蔗糖和0.5g酵母膏加入到已打好的枸杞浆中，ph调为6.0。按照2％接种量将菌体浓度为107cfu/ml的植物乳杆菌cgmcc no.1258混合到枸杞浆中，纱布封口放进摇床(130r
·
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－1
)中进行37℃发酵48h。
27.将购买的黑曲霉cgmcc 3.3927种到pda斜面培养基上活化3d，将活化的黑曲霉孢子接种于pda培养基28℃恒温培养5d。从pda培养基中取一定量黑曲霉孢子于生理盐水中，调整菌体浓度为106cfu/ml。按照6％接种量接种加入到发酵48h后的植物乳杆菌发酵液中，混合均匀后在30摄氏度条件下100r/min发酵80h，发酵结束后4000r/min 10min离心取上清液，于4℃保存备用。
28.实施例2枸杞多肽发酵液对照例1的制备
29.将20g干枸杞倒入500ml三角瓶中，加水浸泡直到枸杞吸水饱满为止，以料液比为1∶6(m∶v)进行加水打浆，称取1g蔗糖和0.5g酵母膏加入到已打好的枸杞浆中，ph调为6.0。按照2％接种量将菌体浓度为107cfu/ml的植物乳杆菌cgmcc no.1258混合到枸杞浆中，纱布封口放进摇床(130r
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)中进行37℃发酵48h。发酵结束后4000r/min 10min离心取上清液，于4℃保存备用。
30.实施例3枸杞多肽发酵液对照例2的制备
31.将购买的黑曲霉cgmcc 3.3927种到pda斜面培养基上活化3d，将活化的黑曲霉孢子接种于pda培养基28℃恒温培养5d。从pda培养基中取一定量黑曲霉孢子于生理盐水中，调整菌体浓度为106cfu/ml。按照6％接种量接种加入到培养基中，培养基的制备方法为将20g干枸杞倒入500ml三角瓶中，加水浸泡直到枸杞吸水饱满为止，以料液比为1∶6(m∶v)进行加水打浆，称取1g蔗糖和0.5g酵母膏加入到已打好的枸杞浆中，ph调为6.0。混合均匀后在30摄氏度条件下100r/min发酵80h，发酵结束后4000r/min 10min离心取上清液，于4℃保存备用。
32.实施例4枸杞多肽发酵液的抗氧化能力检测
33.dpph清除能力测定：用95％乙醇配制0.2mmol/l dpph，取100ul实施例1-3的发酵液与100ul dpph溶液于96孔酶标板混合均匀，常温避光反应30min，517nm处测定吸光值a1。以100ul 95％乙醇代替dpph溶液与100ul去离子水反应为空白对照组(a0)，以100ul dpph溶液与100ul去离子水反应为阴性对照组(a2)。dpph清除率计算公式如下：dpph清除率(％)＝(a2-a1)/(a2-a0)*100％,结果如下表1所示。
34.表1各组别发酵液的dpph清除率
35.组别dpph清除率(％)实施例1发酵液98.5
±
6.6实施例2发酵液79.3
±
4.5实施例3发酵液82.5
±
2.4
36.从表1的结果可以看出，采用特定的植物乳杆菌和黑曲霉对枸杞进行发酵后获得发酵液具有更高的dpph清除率达到了(98.5
±
6.6)％，比单独采用植物乳杆菌或者黑曲霉发酵的效果都要好。
37.实施例5发酵液中抗氧化多肽的纯化分离
38.将实施例1的发酵液12000r/min离心10min，超滤浓缩后，进行deae-sepharoseff阴离子交换层析，再用含0～1.0mol/l nac1的缓冲液进行线性梯度洗脱，检测抗氧化活性。收集抗氧化活性较强的5组活性组份分别再次超滤浓缩。然后上样sephadexg-15分子筛凝胶过滤层析柱，收集4组活性组分，上样于0.1％tfa双蒸水平衡的c18柱，用2％～100％乙腈(0.1％tfa)进行0.8ml/min线性梯度洗脱，分部收集样品，将有活性的3组收集峰再次超滤
浓缩，再rt-hplc分离后，冻干样品，冻干后用6mol/l的hc1于110℃水解24h，然后将水解液蒸干，加5ml 0.02mol/l的hcl溶解后，上l-8800全自动氨基酸分析仪进行氨基酸组成分析，得到了3个抗氧化活性较好的多肽，分别命名为yx-1、yx-2和yx-3多肽，yx-2序列如seq id no：1所示。将所述多肽委托上海生工进行合成后，备用。
39.实施例6 yx-2多肽的抗氧化活性检测
40.羟自由基(
·
oh)清除能力的测定采用邻二氮菲-fe2 氧化法，取0.75mmol/l的邻二氮菲溶液1ml于试管中，依次加入磷酸盐缓冲液(0.2mol/l，ph7.4)2ml和蒸馏水1ml、0.75mmol/l硫酸亚铁液1ml，充分混匀，加体积分数为0.01％的h2o21ml，于37℃下恒温反应60min，于536nm测其吸光度记为ap。羟基自由基清除能力的计算公式如下：清除率(％)＝as-ap/ao-ap
×
100式中：用1ml多肽溶液代替h2o2测得的吸光度记为as；用1ml蒸馏水代替h2o2测得的吸光度记为ao。以vc作为阳性对照。结果如图1所示。
41.多肽对羟基自由基清除能力由图1可知，随着yx-2多肽和vc浓度的上升其羟基自由基清除率也迅速上升，在浓度为250μg/ml时，多肽的清除率达到了82％左右，与vc的清除率基本相近，具有较好的效果。
42.实施例7 yx-2多肽对成纤维细胞的活性检测
43.成纤维细胞增殖实验：选择对数生长期状态良好的成纤维细胞，经0.25％胰蛋白酶消化，离心后重悬于含有10％胎牛血清的dmem培养基中，计数；将成纤维细胞接种于96孔培养板中，每孔细胞数约为5
×
103，并设置未加细胞的空白对照，边缘孔用无菌磷酸盐缓冲液(pbs)填充，于37℃，5％co2环境中培养过夜；按照各自终体积分数分别加入待测多肽溶液，未处理组作为细胞对照组，每组设3个复孔，于37℃，5％co2环境中培养48h。培养结束前4h，加入5g/l的mtt溶液，继续培养4h后终止培养；吸弃孔内液体，用pbs洗涤1次，加入dmso溶解结晶；m3读板仪于570nm波长处测定各孔吸光度值。细胞存活率＝(测定孔吸光度值一空白对照组吸光度值)/(细胞对照组吸光度值一空白对照组吸光度值)x100％。结果如表2所示。
44.表2不同浓度多肽处理后的细胞存活率
45.浓度组细胞存活率(％)0100
±
2.810μg/ml122.6
±
3.5100μg/ml139.1
±
5.1200μg/ml165.2
±
7.51mg/ml171.4
±
8.1
46.成纤维细胞对维持皮肤的弹性任性和老化都有重要的作用。从表2可以看出，多肽对于成纤维细胞的增殖具有一定的促进作用，在1mg/ml的浓度下最高可以达到171.4
±
8.1％的促进效果。
47.实施例8 yx-2增白能力测试
48.细胞内酪氨酸酶活性抑制实验：取对数生长期的b16细胞，接种于6孔细胞培养板，培养过夜。分别加入终体积分数为200μg/ml的多肽，以未处理组作细胞对照组，每组2个复孔。培养48h后用pbs洗涤1次，每孔加入100μl裂解液，刮取收集细胞，离心取上清液。取5ol细胞上清液至96孔板，再加入50μl 1％l-多巴溶液，于37℃孵育1h。m3读板仪于475nm处读
取吸光度值。相对酪氨酸酶活性＝(测定孔吸光度值一空白对照组吸光度值)/(细胞对照组吸光度值一空白对照组吸光度值)x100％。结果显示，细胞内相对酪氨酸酶活性只有(40.1
±
4.1)％，表明在yx-2多肽的作用下，b16的相对酪氨酸酶活性显著降低，这说明多肽对酪氨酸酶活性具有抑制作用。
49.实施例9yx-2多肽对小鼠的抗氧化实验
50.雄性昆明小鼠40只，体重20～25g，随机分为四组，即正常对照组、d-半乳糖致氧化损伤模型组，多肽处理组，vc阳性对照组。除正常对照组外，其余各组小鼠每天皮下注射d-半乳糖400mg/kg bw，持续32d，对照组小鼠则每d皮下注射等量生理盐水，多肽组和vc组每天分别按1mg/kg bw的剂量灌胃，正常对照组及模型组用等量蒸馏水灌胃，每3d称重1次。在第32d注射d-半乳糖和灌胃多肽2h后，解剖小鼠，取0.2g肝组织，剪碎后置于玻璃匀浆器中，加9倍体积冷生理盐水，制成10％(w/v)的肝组织匀浆，3000r/min离心10min，取上清液进行肝细胞sod、gsh-px活性及mda含量的测定。肝脏mda含量采用硫代巴比妥酸(tba)比色法测定；sod采用黄嘌呤氧化酶法测定；gsh-px活性采用dtnb法测定。结果如表3所示。
51.表3多肽对小鼠肝脏mda和sod以及gsh-px活性的影响
52.组别mda(μmol/g)sod(u/mg)gsh-px(u/mg)对照组14.5
±
1.2517
±
21616
±
30模型组23.1
±
1.1454
±
12424
±
31多肽组18.0
±
1.2533
±
24592
±
23vc对照组19.5
±
1.1490
±
24573
±
33
53.由表3可以看出，与对照组相比，氧化模型组小鼠肝脏mda含量极显著增加，sod活性和gsh-px活性极显著下降。而与模型组相比，多肽组和阳性对照vc组的小鼠肝脏mda含量显著降低，gsh-px活性、sod活性都极显著升高。特别是多肽组的mda达到了18.0
±
1.2μmol/g，sod达到了533
±
24u/mg，gsh-px达到了592
±
23u/mg，并且所述结果与对照组相比p《0.05,具有统计学意义。
54.前述本发明的说明是为了示例性的，具有本发明所属技术领域的通常知识的人，在不改变本发明的技术思想或必需的特征的情况下，可以很容易地变换成其他具体形式。肯定能理解。因此，以上所述的实施例及实验例应理解为在所有方面都是预示性的，非限定性的。