一种系统性红斑狼疮并动脉粥样硬化动物模型构建方法与流程

1.本发明涉及医学技术领域，特别涉及系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化小鼠模型及其构建方法。


背景技术：

2.随着诊断及治疗技术的不断提高，系统性红斑狼疮(sle）5、10年生存率已大大的提高，但远期生存率仍无明显改观，研究发现其主要原因是动脉粥样硬化所致心脑血管并发症明显影响患者预后。进一步明确sle早发及高发动脉粥样硬化的机制，以早期干预提高远期生存率是十分必要的。但受动物模型限制，目前关于系统性红斑狼疮早发动脉粥样硬化的研究大多为临床研究，在动物上开展的基础研究还较少。因此，制备系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化的动物模型用于该疾病的病理生理及治疗的研究是必要的。
3.目前制作系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化动物模型的方法较少，耗时较长，过程繁琐。有学者报道其动物模型制备方法;首先将动脉粥样硬化apoe-/-小鼠和系统性红斑狼疮fasl-/-小鼠杂交得到f1代apoe /
‑ꢀ
fasl /-小鼠，然后通过f1代小鼠杂交通过基因鉴定筛选出f2代的apoe-/
‑ꢀ
fasl-/-小鼠即为构造的小鼠模型。这种方法构建的动物模型过程繁琐，耗时较长，模型成功率较低。亦有学者通过给apoe-/-小鼠体内注射降植烷（pristne），高脂喂养6-8个月可构建小鼠模型，耗时长且apoe-/-小鼠蛋白谱与人类不够相近。
4.综上所述，当前用于构建系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化动物模型的方法不够稳定可靠，因此亟需一种更为简易理想的造模方法用于后续的研究。


技术实现要素：

5.针对上述的不足，本发明提供了一种新的系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化动物模型的构建方法。该方法更为简易，耗时较短，病理生理状态与临床更为接近。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以及技术方案：本发明提供了一种系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化动物模型的构建方法，包括以下几个步骤：步骤（1）将降植烷（pristane）导入ldl-/-小鼠腹腔；步骤（2）spf级动物房内高脂喂养14周。
7.ldl-/-小鼠对脂肪和胆固醇都非常敏感，给予高脂饲料喂养适宜的时长，动脉粥样硬化可以发展到纤维化斑块或者纤维帽阶段，因此，可以模拟人类动脉粥样硬化的所有阶段，且其蛋白谱与apoe-/-小鼠相比较，与人类的更为接近，有利于将脂蛋白改变与人类动脉粥样硬化与高脂血症的关系进行推演。
8.降植烷（pristane），通过线粒体损伤途径诱发细胞凋亡产生核抗原，引起t、b淋巴细胞活化反应性增高，产生多种抗体，启动自身免疫，引起炎症反应，从而诱导狼疮的发生，从而使动物模型产生与临床相似的病理生理状态。本发明采用ldl-/-注射pristane的方法
能够成功构建系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化动物模型，此模型能应用于各种相关研究。
9.作为优选，本发明 ldl-/-小鼠为10周龄，雌性。
10.作为优选，步骤（1）pristane导入剂量为0.5ml。
11.作为优选，步骤（2）所用高脂饲料配方为：普通饲料 21%猪油(wt/wt) 0.15% (wt/wt)胆固醇，喂养时间持续为14周。
12.作为优选，系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，监测动物模型发病状况的方法为：对小鼠进行眼眶取血分离血清，elisa检测小鼠血清中自身抗体水平。
13.作为优选，系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，监测动物模型发病状况的方法为：对小鼠进行蛋白尿的测定，观测小鼠肾脏有无病损。
14.作为优选，系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，监测动物模型发病状况的方法为：处死小鼠，取小鼠淋巴组织脾脏进行观察并称重。
15.作为优选，系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，监测动物模型发病状况的方法为：处死小鼠，取小鼠肾脏组织，切片后做组织化学染色，观察小鼠炎症症状的改变。
16.作为优选，系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，监测动物模型发病状况的方法为：处死小鼠，取小鼠主动脉组织，切片后做油红o染色，观察小鼠动脉粥样硬化的改变。
17.本发明的制备方法通过ldl-/-小鼠导入pristane的方法构建系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化动物模型，ldl-/-小鼠对脂肪和胆固醇都非常敏感，高脂饲料喂养，动脉粥样硬化可以发展到纤维化斑块或者纤维帽阶段，可以模拟人类动脉粥样硬化的所有阶段，且其蛋白谱与apoe-/-小鼠相比较，与人类的更为接近，有利于将脂蛋白改变与人类动脉粥样硬化与高脂血症的关系进行推演。降植烷（pristane）能够引起t、b淋巴细胞活化反应性增高，产生多种抗体，启动自身免疫，引起炎症反应，从而诱导狼疮的发生，从而使动物模型产生与临床相似的病理生理状态。本发明通过两者结合，造模小鼠出现系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化的成功率达70%。该方法简单易行，较其他方法耗费时间较短，系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化发生率高，效果温度，更接近临床系统性红斑狼疮患者发生动脉粥样硬化的病理生理状态，该模型可广泛推广应用于各种相关研究。
附图说明
18.图1：系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化动物模型的构建方法简图。
19.图2：pristane组小鼠和对照组小鼠毛发和脾脏的外观变化，其中，pristane组小鼠背部毛发出现脱落，脾脏增大。
20.图3：pristane组pristane组小鼠和对照组小鼠脾脏大小变化图。
21.图4：pristane组小鼠和对照组小鼠体内抗dsdna抗体和抗ana抗体水平变化，其中，pristane组小鼠体内抗体水平高于对照组。
22.图5：pristane组小鼠和对照组小鼠的蛋白尿水平图。
23.图6：pristane组小鼠和对照组小鼠肾脏的he染色和pas染色结果图，其中，pristane组小鼠肾脏可见肾小球细胞数量较对照组增多，并伴有炎性细胞浸润，血管内皮细胞、系膜细胞、上皮细胞增生；系膜基质增多，基膜增厚；间质中有大量炎症细胞浸润；对照组的肾小球内细胞无明显增生，系膜基质未见明显增多，基底膜未见明显增厚。
24.图7：pristane组小鼠和对照组小鼠主动脉油红o染色结果图，其中，pristane组小鼠主动脉可见管腔内染成橘红色的脂质沉积，提示有动脉粥样硬化斑块形成，而对照组小鼠主动脉组织切片中未检测到明显的脂质沉积。
具体实施方式
25.本发明公开了一种系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化动物模型的构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
26.本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。
27.下面结合实施例，阐述本发明。
28.实施例1实验动物：江苏集萃药康集团提供的10周ldl-/-小鼠，雌性，体重20-30g。
29.将0.5ml pristane自小鼠腹腔注射入小鼠体内，高脂饲料（普通饲料 21%猪油(wt/wt) 0.15% (wt/wt)胆固醇）饲养于spf清洁动物房14周。
30.饲养过程中，观察小鼠毛发和生活习性变化，小鼠背部，颊部出现脱毛（如图2所示），进食量减少，爬笼时间缩短。
31.以2%的水合氯醛1ml/100g剂量麻醉小鼠，无菌条件下对小鼠进行眼眶取血分离血清，于-80℃冰箱保存，elisa检测小鼠血清中自身抗体水平，主要是抗dsdna抗体和抗ana抗体水平。
32.结果如图4所示，导入pistane组抗dsdna抗体和抗ana抗体水平与对照组相比较升高。
33.小鼠肾脏病变的观测，具体步骤如下：对小鼠进行蛋白尿试纸检测小鼠肾脏有无发生病例改变，结果如图 5所示，发现pristane组小鼠的尿蛋白水平均比对照组高。
34.小鼠病理组织学观察与检测，具体步骤如下：2%的水合氯醛1ml/100g剂量麻醉后处死小鼠；取小鼠淋巴组织脾脏进行观察；对小鼠淋巴组织脾脏进行观察，结果如图3所示，发现pristane组小鼠的脾脏对照组（pbs组，bmdcs组）大。
35.小鼠病理组织切片观察，具体步骤如下：2%的水合氯醛1ml/100g剂量麻醉后处死小鼠；取小鼠肾脏组织，切片后做组织化学染色，显微镜下观察；
结果如图6所示，其中：可观察到pristane组小鼠肾皮质细胞增生，并出现肿胀和玻璃样变形，此外还有淋巴细胞浸润，肾小球边界模糊，滤过间隙消失，肾小球内可见毛细血管出血，表现为典型的肾小球炎症性改变，而阴性对照组均表现为正常的肾脏组织结构，未见炎症改变。
36.取小鼠主动脉组织，切片后做油红o染色，显微镜下观察；结果如图7所示，其中：可观察到pristane组小鼠主动脉可见管腔内染成橘红色的脂质沉积，提示有动脉粥样硬化斑块形成，而对照组小鼠主动脉组织切片中未检测到明显的脂质沉积。
37.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。