用于声动力疗法的靶向声敏剂复合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，主要涉及一种新型的同时嫁接靶分子点量子点和声敏剂，用于肿瘤血管、肿瘤及其有靶向分子疾病的精准治疗。


背景技术：

2.恶性肿瘤严重威胁着人类的健康。根据中国肿瘤疾病报告，2018年中国恶性肿瘤已经成为居民疾病死亡构成的第二位，肿瘤治疗是当前临床医学中最受关注、最重要的研究领域之一。目前临床治疗肿瘤的方法主要是手术、放疗、化疗、免疫治疗、中医药及其组合，然而现有的临床治疗方法都存在着相当的局限性，治疗效果都有待进一步提高。因此，迫切需要新的更加有效的方法给予补充。综合应用现代医学影像技术、纳米技术、生物医学技术的研究成果，通过智能化的诊疗手段，构建最优化治疗方案，探索多模态、多样化诊疗一体的靶向肿瘤治疗的新模式是十分必要的。
3.肿瘤的声动力疗法(sonodynamic therapy；sdt)是在光动力疗法的基础上发展形成的治疗方法，该方法通过肿瘤吸收声敏剂(化学)后，应用一定强度的超声波(物理)照射肿瘤，声敏剂经声化学反应产生有细胞毒性的活性氧物质(单线态氧o2、自由基等)，使肿瘤细胞发生不可逆的损伤，致使肿瘤细胞死亡，实现肿瘤非手术定位治疗。
4.声敏剂分子从声场中获得足够的能量由基态跃迁至激发态，然后在由激发态返回基态的释放能量过程中，除了辐射荧光后返回外，声敏剂分子还会通过电子或质子的转移而发生自由基氧化还原反应，也可以通过碰撞把能量传递给周围氧分子而生成单线态氧、自由基等，这样产生了有细胞毒性的活性氧物质(reactive oxygen species；ros)。
5.恶性实体肿瘤生长转移最重要的特征是病态肿瘤新生血管无序地快速生长。靶向抑制新生的肿瘤血管生成是当前治疗恶性实体肿瘤的基本策略之一。由于肿瘤组织内部缺氧、营养物质缺乏所造成的特殊肿瘤微环境，刺激肿瘤细胞大量分泌多种血管新生相关因子，促进肿瘤血管细胞的快速生长。寻找特异性高、只与肿瘤血管生成相关且与其病变相关的、而与缺血性新生血管生成关系较小的靶点是非常重要的。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种用于声动力疗法的同时嫁接靶分子点量子点和声敏剂，可以解决现有技术中的上述缺陷。
7.本发明的技术方案如下：
8.一种用于声动力疗法的靶向声敏剂复合物，包括标识物和声敏剂，所述标识物与所述声敏剂同时嫁接至对应的靶分子，从而实现对所述靶分子的特异性标识；经声波照射后，所述声敏剂发生声化学反应以产生具有细胞毒性的活性氧物质，从而对细胞或组织造成损伤。
9.较佳的，所述声敏剂可以为任何类型的声敏剂，有机声敏剂或无机声敏剂；优选的，所述声敏剂为卟啉类衍生物类、喹诺酮类抗肿瘤药物、氧杂蒽类染料化合物类、吩噻嗪
类化合物类、非甾体抗炎药、吖啶类化合物或中药类、无机声敏剂为tio2等所有声敏剂。
10.较佳的，所述声敏剂选自：光卟啉、血卟啉、血卟啉甲醚、原卟啉、原卟啉二甲酯、镓卟啉、二氢卟吩、苯并二氢卟酚、四乙基罗丹明、5-氨基酮戊酸、阿霉素、顺铂、环磷酰胺、两性霉素b、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、丝裂霉素c、洛美沙星、司帕沙星、加替沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、亚甲基蓝、甲苯胺蓝、玫瑰红、四碘四氯荧光素衍生物、吖啶橙、红紫素、酞菁、萘菁、花菁、吲哚菁绿、姜黄素、竹红菌素、竹红菌乙素、竹黄菌素、叶绿素衍生物、金丝桃素或黄连素。
11.较佳的，所述标识物选自微泡超声造影剂、纳米金、纳米氧化铁磁体、纳米碳管、石墨烯或量子点；优选的，所述标识物为量子点，所述量子点选自：硅量子点、锗量子点、硫化镉量子点、硒化镉量子点、碲化镉量子点、硒化锌量子点、硫化铅量子点、硒化铅量子点、磷化铟量子点或砷化铟量子点等所有量子点；进一步优选的，所述量子点包括内核、包覆在所述内核外的壳以及包覆在所述壳外层的纳米膜；更优选的，所述量子点由cdsete内核及zns壳组成，zns壳外层包覆一层sio2纳米膜等所有量子点。
12.较佳的，所述量子点为双端氨基聚乙二醇包被的量子点，所述量子点接枝马来酰亚胺基形成与所述生物标志物连接的量子点-马来酰亚胺复合物；所述声敏剂通过共价键、氢键、π-π相互作用与所述生物标志物连接。
13.较佳的，所述靶分子为疾病甚至病原微生物的特异性标志物，其中，所述疾病标志物为肿瘤标志物，选自癌胚抗原类标志物、酶类标志物、激素类标志物、糖蛋白类标志物、癌基因类标志物和细胞表面肿瘤抗原类标志物等所有标记物；所述病原微生物选自：朊毒体、寄生虫、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒中的至少一种。
14.本发明还提供了一种如上任一所述的用于声动力疗法的靶向声敏剂复合物在声动力疗法和/或诊断方法中的应用。
15.本发明还提供了一种包含如上任一所述的用于声动力疗法的靶向声敏剂复合物的试剂盒。
16.本发明还提供了一种如上任一所述的用于声动力疗法的靶向声敏剂复合物在制备治疗疾病或病症的药物上的应用。
17.较佳的，所述疾病或病症选自癌症、异常细胞增殖性疾病、感染、炎性病症、自身免疫性疾病、心血管疾病、神经变性疾病、由辐射引起的造血毒性疾病，或其组合。其中所述癌症选自黑色素瘤、脑瘤(具有恶性的星形神经胶质和少突神经胶质细胞瘤成分的神经胶质瘤等)、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结肠直肠癌(结肠癌、直肠癌等)、肺癌(非小细胞肺癌、小细胞肺癌、原发或转移性鳞状癌等)、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌、神经母细胞瘤、肉瘤、骨软骨瘤、骨瘤、骨肉瘤、精原细胞瘤、睾丸肿瘤、子宫癌(子宫颈癌、子宫内膜癌等)、头颈肿瘤(上颌骨癌、喉癌、咽癌、舌癌、口内癌等)、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤、淋巴肉瘤、霍奇金淋巴瘤等)、真性红细胞增多症、白血病(急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病等)、甲状腺肿瘤、输尿管肿瘤、膀胱肿瘤、胆囊癌、胆管癌、绒毛膜上皮癌或儿科肿瘤(尤因家族性肉瘤、维尔姆斯肉瘤、横纹肌肉瘤、血管肉瘤、胚胎睾丸癌、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、肝胚细胞瘤、肾母细胞瘤等)。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
19.通过量子点与声敏剂同时嫁接至靶分子，就形成了新型的靶向纳米声敏剂，具有以下优点：(1)改善了声敏剂的理化特性，采用亲水性的纳米载体，可以把声敏剂定向输运到病灶，不仅提高了病灶中声敏剂的浓度，也降低了声敏剂的毒性；(2)纳米声敏剂可成为液体中的空化核，不仅降低了空化阈，而且声敏剂直接处于空化泡内，提高了自由基产额；(3)靶向量子点-声敏剂复合物结合声动力疗法，对多种肿瘤甚至细菌、病毒等靶向分子具有显著的杀伤作用，具有重要的临床意义；本发明的量子点声敏剂，在超声辐射下，对多种癌细胞具有优异的杀灭效果，经单次超声辐照处理后，肿瘤细胞的死亡率达到70％以上。
20.当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
21.图1是本发明实施例2的肿瘤细胞染色示意图；
22.图2是本发明实施例2的肿瘤细胞杀灭率结果示意图；
23.图3是本发明实施例3的细胞毒性差异效果示意图。
具体实施方式
24.本发明提供了一种用于声动力疗法的靶向声敏剂复合物，包括标识物和声敏剂，所述标识物与所述声敏剂同时嫁接至对应的靶分子。所述载体将预定的生物标志物以及所述声敏剂结合，实现对所述生物标志物的特异性标识，再结合声动力疗法，以实现对肿瘤等的精准治疗。其中，嫁接指的是标识物、声敏剂以及生物标志物之间以分子间的作用力的方式连接，如氢键、范德华力、π-π*相互作用等，或者以化学键的方式连接，如共价键。
25.同时嫁接靶分子点量子点和声敏剂输送至病灶后，施与超声波照射，所述声敏剂发生声化学反应以产生具有细胞毒性的活性氧物质，如单线态氧或自由基，从而对细胞或组织造成不可逆的损伤，致使肿瘤细胞死亡。活性氧物质可以使癌细胞的细胞膜过氧化、细胞膜通透性增加，使膜的稳定性和弹性发生改变，甚至使细胞膜穿孔、损伤细胞内脂质、蛋白质和dna以及损伤线粒体等多种细胞器，导致细胞凋亡。
26.研究表明，声动力疗法所用的声强在0.5～10w/cm2范围，超声频率通常在0.4～3mhz，其中，输入超声波的声强越大，则会产生大量高活性的空化微泡，参与声化学反应的空化微泡也会更多，进一步提高了氧自由基产额，增强了声化学场的活性，但随着声强增大对周围组织的影响也随之增大。因此选择合适的声强具有重要意义，当声强在0.5～10w/cm2范围，超声频率在 0.4～3mhz这时声衰减较小，易于声聚焦和成像，有好的传播深度和精度，更适合于治疗应用。
27.优选地，超声声强为1.5-3w/cm-2
，超声作用时间是8-15分钟，具体的，超声声强为2.5w/cm-2
，超声时间为9分钟。
28.所述声敏剂分为有机声敏剂和无机声敏剂，其中，所述有机声敏剂选自：卟啉类衍生物类、喹诺酮类抗肿瘤药物、氧杂蒽类、吩噻嗪类化合物类、非甾体抗炎药、吖啶类化合物或中药类，所述无机声敏剂为tio2。
29.具体的，声敏剂选自：光卟啉及其衍生物、血卟啉及其衍生物、血卟啉甲醚及其衍生物、原卟啉及其衍生物、原卟啉二甲酯及其衍生物、镓卟啉及其衍生物、二氢卟吩及其衍生物、苯并二氢卟酚及其衍生物、四乙基罗丹明及其衍生物、5-氨基酮戊酸及其衍生物、阿
霉素及其衍生物、顺铂及其衍生物、环磷酰胺及其衍生物、两性霉素b及其衍生物、5-氟尿嘧啶及其衍生物、阿糖胞苷及其衍生物、丝裂霉素c及其衍生物、洛美沙星及其衍生物、司帕沙星及其衍生物、加替沙星及其衍生物、环丙沙星及其衍生物、左氧氟沙星及其衍生物、亚甲基蓝及其衍生物、甲苯胺蓝及其衍生物、玫瑰红及其衍生物、四碘四氯荧光素衍生物、吖啶橙及其衍生物、红紫素及其衍生物、酞菁及其衍生物、萘菁及其衍生物、花菁及其衍生物、吲哚菁绿及其衍生物、姜黄素、竹红菌乙素及其衍生物、叶绿素衍生物、金丝桃素及其衍生物或黄连素及其衍生物。声敏剂本身并不具有抗肿瘤活性，经超声照射后产生具有细胞毒性的活性氧物质，从而对肿瘤细胞或组织产生杀伤作用。
30.量子点是一种纳米级别的半导体，本文中的“量子点”以最广泛的含义使用，包括所有类型的半导体纳米颗粒。如果向量子点施加电或光，许多类型的量子点将发射特定频率的光，并且可以通过改变点的大小、形状和材料来精确地调整这些频率，从而产生许多应用。因此，如本文所用的，量子点可以指具有的大小从0.1nm至999nm的纳米材料。如本文所用的，量子点可以指具有不同形状的纳米材料，诸如但不限于球形、立方体、棒、金字塔、锥形、圆柱形、四面体、三角棱柱、二十面体、八面体、十二面体、六角棱柱、椭圆体、五角棱柱、五角金字塔、六角金字塔或八角棱柱。如本文所用的，量子点可以指由以下制成的纳米材料：不同的半导体及其与其他元素(诸如但不限于cd、se、s、zn、te、an、ag、ga、p、al、sb、as、in、si、 sb或ge)的组合。
31.其中，由cdsete内核及zns壳组成的量子点，zns壳外层再包覆一层 sio2纳米膜，选用该量子点为载体装载声敏剂，可以在病灶内形成高治疗浓度的分子靶向手术刀，而量子点的荧光探针功能，不仅可以实施肿瘤荧光成像，而且便于检测靶向声敏剂在细胞中的靶向率和靶向凋亡率。
32.当然，在其他实施方式中，所述标识物还可以选自微泡超声造影剂、纳米金、纳米氧化铁磁体、纳米碳管或石墨烯。
33.生物标志物，是指可以准确且可重复地测量的医学标识的子类别。如本文所用的，生物标志物是可在体内或其产品中测量的任何物质、结构或过程，并影响或预测结果或疾病的发生率。因此，它可以指天然存在的分子、基因，或者通过该分子、基因的表征可以鉴定特定的病理或生理过程、疾病。它几乎包括反映生物系统与潜在危害之间的相互作用的任何测量，其可以是化学的、物理的或生物的。测量的响应可以是功能性的和生理性的、细胞水平的生物化学的或分子的相互作用。
34.本文主要针对的是肿瘤血管的精准治疗。其中，恶性实体肿瘤生长转移最重要的特征是病态肿瘤新生血管无序地快速生长，靶向抑制新生的肿瘤血管生成是当前治疗恶性实体肿瘤的基本策略之一。由于肿瘤组织内部缺氧、营养物质缺乏所造成的特殊肿瘤微环境，刺激肿瘤细胞大量分泌多种血管新生相关因子，促进肿瘤血管细胞的快速生长。
35.血管新生相关因子主要有血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor；vegf)、表皮生长因子(epidermal growth factor；egf)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β；tgf-β)、成纤维细胞生长因子 (fibroblast growth factor；fgf)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor；tnf)、血管生成素1，2(ang-1、ang-2)、血小板衍生生长因子-bb(pdgf-bb)、红细胞生成素(epo)、干细胞生长因子(hgf)、白细胞介素(il)-6。其中以vegf作用最强，这些因子参与了新生血管生成的多个环节，在促进肿
瘤血管生成过程中起关键作用。针对抑制vegf靶点的抗肿瘤药物已经应用在临床治疗中。
36.由于vegf不但大量出现在肿瘤新生血管生成过程，也出现在心肌梗死、脑梗死等缺血性疾病需要侧枝循环建立的过程中。当使用抑制vegf药物抑制肿瘤血管生长的同时，会加重心肌梗死、脑梗塞等缺血性疾病，甚至危及生命。所以，寻找特异性高、只与肿瘤血管生成相关且与其病变相关的、而与缺血性新生血管生成关系较小的靶点是非常重要的。
37.研究发现，在肿瘤生存的微环境中存在着的一种叫内皮素cd105抗原，它是一种跨膜糖蛋白，是转录生长因子-β(transforming growth factor-β； tgf-β)的共同受体之一，该蛋白在实体肿瘤血管生成过程中起了非常重要的作用。内皮素是肿瘤内皮细胞活化的标志，包括胆囊癌、肝癌等的实体肿瘤血管生成中的内皮中优先表达；与vegf相比，它在生理性缺血性新生血管中表达极少，而在肿瘤病态血管中为高表达，且与疾病的严重程度成正相关。因此，cd105是标记肿瘤血管理想的靶点，靶向抑制cd105可以只对肿瘤中的病态血管实施清除，而不损伤正常生理性新生血管。
38.在另一些实施例中，生物标志物还可以是一些病原微生物，如朊毒体、寄生虫、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒，通过对病原微生物进行特异性标识，结合声动力疗法，以实现对细菌、病毒等靶向分子的治疗。
39.如本文所述的，"给予"和"处理"当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。"给予"和"处理"可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。"给予"和"处理"还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。"处理"当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
40."治疗"意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作"治疗有效量")可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。
41."有效剂量"包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
42.在本实施方式的声动力疗法中，超声发射频率为0.5mhz-5mhz，基阵聚焦区域声强为0.3-10w/cm2，扫描宽度为0.5cm-20cm，聚焦深度为2cm-20cm。
43.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
44.实施例1
45.制备量子点-声敏剂复合物：
46.选用双端氨基聚乙二醇包被的量子点(qdot 705itktm amino，peg)，此氨基qd由cdsete内核及zns壳组成，再在它的外层包覆一层无毒性的 sio2纳米膜，荧光峰值696nm。在ph值为7～9时，羟基琥珀酰亚胺酯与氨基量子点(氨基qd)的氨基键反应生成qd-马来酰亚胺复合物，在ph值为6.5～7.5条件下，再与cd105联合肽中半胱氨酸的巯基基团反应，最终生成连接cd105的功能化量子点。在功能化cd105量子点的基础上，选用国家药监局批准可用于临床试验的声敏剂(血卟啉)，通过共价键、氢键、π
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π*相互作用达到声敏剂(血卟啉)与该功能量子点的连接。
47.同时结合分子生物学方法，测定cd105蛋白，作为基准样品，将量子点与其蛋白结合，获得针对cd105蛋白相应的量子点。
48.其中，量子点、声敏剂、cd105联合肽的摩尔比为1:1:1，当然，在其他实施例中，可以改变量子点、声敏剂、cd105联合肽的用量比，以达到预期的治疗效果。
49.实施例2
50.采用共孵育法，将实施例1制备的量子点-声敏剂复合物分别与7种肿瘤细胞进行联合培养，并对其进行超声照射处理。其中，量子点-声敏剂复合物的用量为30-100μg/ml，具体为50μg/ml，照射时间为9分钟。
51.7种肿瘤细胞分别为mda-mb-231(人乳腺癌细胞)、sgc7901(人胃癌细胞)、skov3(人卵巢癌细胞)、sgc996(人胆囊癌细胞)、hcc827(人非小细胞肺癌细胞)、pc3(人前列腺癌细胞)、8305c(人甲状腺癌细胞)。
52.采用pi染色法检测细胞凋亡，实验结果如图1、图2所示，超声辐照作用下，量子点-声敏剂复合物对7种肿瘤细胞均有优异的杀灭效果，单次超声辐照处理后，肿瘤细胞的死亡率达到70％以上。
53.实施例3细胞毒性实验
54.采用实施例1所述的量子点声敏剂复合物(10μg/ml)与mda-mb-231共孵育，孵育时间为0,6,12,24,48,72h。
55.结果显示，与初始时相比，细胞毒性差异不显著，参见图3。
56.以上公开的仅为本发明优选实施例。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属领域技术人员能很好地利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
57.在本发明及上述实施例的教导下，本领域技术人员很容易预见到，本发明所列举或例举的各原料或其等同替换物、各加工方法或其等同替换物都能实现本发明，以及各原料和加工方法的参数上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。