一种用于光片荧光显微镜的镜片、样品仓及成像系统的制作方法

1.本技术涉及光学成像领域技术领域，尤其涉及一种用于光片荧光显微镜的镜片、样品仓及成像系统。


背景技术：

2.光学显微成像一种重要的成像技术，而光片荧光显微镜是一种新型的光学显微技术，该技术由于其独特的照明的独特照明方式，系统的光漂白和光毒性较小，系统成像的轴向分辨率较高，对比度较强。光片荧光显微镜的系统的成像的轴向分辨率取决于光片的厚度。
3.在使用光片荧光显微镜对病理组织进行三维成像时，病理组织大部分时候需要进行透明化和染色处理，并将处理完的样品放在特定的溶液里面保存。而相关的处理试剂通常具有一定的毒性，并且不易于长时间保存，这就造成光片荧光显微镜如果选用浸镜作为成像系统的物镜时，系统每次使用完毕时候，都需要对物镜进行清洗，不便于使用，而如果使用空镜作为成像系统的物镜，物镜到成像样品间会有空气、样品仓隔离玻璃、溶液，三种不同的介质。这三种介质的折射率不同，就会造成照明系统存在较大的像差。光束在经过物镜聚焦后，不同半径区域的光斑入射到三种介质的角度不同，造成的折射效果不同，造成球差，而同一介质对于不同的波长的折射率不同，会造成色差，而这两种像差的存在会造成系统照明光斑不能很好地聚焦，系统的照明光斑变大，轴向分辨率变低。


技术实现要素：

4.本技术提供一种用于光片荧光显微镜的镜片、样品仓及成像系统，使用柱面镜作为样品保存溶液和空气的分离玻璃，避免了由于介质折射率不同而引发的像差影响，并且当光线经过柱面镜时，其照明视场能够保持不变。
5.为达到上述目的，第一方面，本技术提供了一种用于光片荧光显微镜的镜片，所述镜片为柱面镜，所述柱面镜内外两个曲面的轴线重合；所述柱面镜在隔离样品保存溶液和空气时能够消除光束通过空气与柱面镜、柱面镜与样品保存溶液之间界面时产生的折射影响。
6.进一步地，所述柱面镜的材质为透明玻璃。
7.第二方面，本技术还提供一种用于光片荧光显微镜的样品仓，包括储存盒以及如权利要求1所述的一种用于光片荧光显微镜的镜片，其中：所述柱面镜连接在所述储存盒的一侧壁上，并共同限制出一个用于容纳样品保存溶液以及样品的腔体；所述柱面镜的内曲面与样品保存溶液接触。
8.第三方面，本技术还提供一种光片荧光显微镜的成像系统，包括照明子系统，所述照明子系统用于形成照明光片，所述照明子系统包括物镜，还包括柱面镜；所述柱面镜位于物镜的一侧，且柱面镜的外曲面靠近物镜，所述柱面镜的轴线和物镜的工作面重合。
9.进一步地，所述照明子系统还包括光源、第一4f系统和第二4f系统。
10.进一步地，第一4f系统由第一透镜和第二透镜组成，第二4f系统由第三透镜和第四透镜组成。
11.进一步地，所述照明子系统还包括振镜，所述光源、第一4f系统、振镜、第二4f系统、物镜和柱面镜沿照明光路依次设置。
12.进一步地，所述振镜的扫描频率高于相机的成像频率。
13.进一步地，所述照明子系统还包括平凸柱镜，所述光源、第一4f系统、平凸柱镜、第二4f系统、物镜和柱面镜沿照明光路依次设置。
14.本技术相比现有技术具有以下有益效果：使用柱面镜作为气液隔离玻璃，使得光片荧光显微镜可以使用空镜作为系统的物镜，对在溶液中的样品进行成像。光束从空气入射到柱面镜，再从柱面镜入射到样品保存溶液时，光线在光片厚度方向各个角度的分量是垂直的，使得系统不会因介质折率不同而产生的像差，从而可以保持较好的轴向分辨率，同时可以具有较大高度的光片，成像视场大。在光线经过柱面镜后，其照明视场能够保持不变。
附图说明
15.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
16.图1为照明光片的示意图；
17.图2为平板镜作为溶液和空气的隔离玻璃时的光路图；
18.图3为理想聚光线以及使用平板镜作为气液隔离玻璃时的聚光线的对比图；
19.图4为球面镜作为溶液和空气的隔离玻璃时的光路图；
20.图5为当光束不沿半径方向的视场入射到球面镜表面时的光路图；
21.图6为实施例3中照明子系统的光路图；
22.图7为实施例3中照明子系统在x-z平面的光路图；
23.图8为实施例3中振镜扫描时光束入射到柱面镜的光路图；
24.图9为实施例3中照明子系统x-y平面光斑聚焦状态；
25.图10为实施例3中照明子系统x-z平面光斑聚焦状态；
26.图11为实施例3中照明子系统x-y平面单个光斑在物镜工作表面的聚焦效果图；
27.图12为柱面镜和球面镜的效果对比图；
28.图13为实施例2中样品仓的结构示意图。
29.图中，1-光源，2-第一透镜，3-第二透镜，4-振镜，5-第三透镜，6-第四透镜，7-物镜，8-柱面镜，9-样品保存溶液，10-平板镜，11-球面镜，12-储存盒。
具体实施方式
30.下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他
实施例，都属于本技术保护的范围。
31.在本技术的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本技术的限制。
32.在本技术的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本技术中的具体含义。
33.术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本技术的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
34.实施例1：一种用于光片荧光显微镜的镜片，镜片为柱面镜8，柱面镜8内外两个曲面的轴线重合；柱面镜8在隔离样品保存溶液9和空气时能够消除光束通过空气与柱面镜、柱面镜与样品保存溶液之间界面时产生的折射影响。
35.对于光片荧光显微镜的照明子系统，照明光束从成像物镜出来时，光束是处于聚焦状态的，而光束从物镜出来后，到达成像样品上需要经过空气、玻璃、溶液三种介质，而这是三种介质的折射率都是不相同的。因此，光束需要穿过空气与玻璃、玻璃与溶液共两个介质分界面。光片荧光显微镜常用平板镜10或球面镜11作为样品保存溶液9和空气的隔离玻璃。
36.参见图2，当光片荧光显微镜常采用平板镜10作为样品保存溶液9和空气的隔离玻璃时，入射光线与两个分界面的法线都存在一定的夹角，因此会发生折射，而不同半径的区域的光斑由于与分界面的法线角度不同，产生的折射效果就会有所不同，从而给系统引入球差，不同波长的光束对同一介质的折射率不同，会给系统引入色差。这两种像差使得系统光斑聚焦效果变差，系统的轴向分辨率下降，而且，这种方式也改变了聚焦光束的传播路径，进而使得物镜7的工作距离发生变化。从图3可以看到聚焦光线的仿真效果，其中，图a和图b分是理想聚焦光斑的光斑传播路图和像平面点列图，图c和图d分是使用平板镜10作为气液隔离玻璃时光斑传播路图和像平面点列图，从仿真效果可以看到，当使用平板镜10作为气液隔离玻璃的时候，聚焦光束严重受到色差和球差的影响，光束的聚焦质量严重下降。
37.参见图4，当采用球面镜11作为溶液和空气的隔离玻璃。当光线沿着球面镜11的半径方向入射的时，光线与两个分界面的法线夹角为零，光线在从一种介质进入到另一种介质的时候不发生折射，因此光线不会因为介质折射率不同而造成像差。但是使用球面镜11时候，由于球面镜11的中心只有一点，也就是意味光线中只有沿着球面镜11的半径方向这一视场角度入射时，才能够保持入射光线与两个分界面相互垂直，而在其他的视场角度，光线与这两个界面的法线会存在着一定的夹角，而且随着系统视场的增大，这个角度也随着增大，而当入射光线与介质的分界面的法线有一定的角度时候，光线从一种介质进入另外一个介质就会发生折射效应。参见图5，当光束不沿着半径方向的视场入射到球面镜11表面时候，光线的夹角与分界面法线的夹角也会因扫描视场的不同而有所不同，因此对于一个具有一定半径的成像光束，不同半径的折射效果会不相同，因此会造成球差，而不同波长的
光线对同一介质的折率不同，会造成色差，而这两种像差会造成聚焦光斑变大，聚焦光斑会在光片高度方向变大。特别的是折射效应会使得照明光斑照到球玻璃的后，其照明视场会由于折射效应变小。
38.本技术采用柱面镜8作为溶液和空气的隔离玻璃，从柱面镜8入射到样品保存溶液时候，光线在光片厚度方向各个角度的分量是垂直的，使得系统不会因介质折率不同而产生的像差，从而可以保持较好的轴向分辨率，同时可以拥有较大的成像视场。参见图12，从图中可以看出球面镜11能够解决由于介质折射率不同而带来的x-z平面和y-z平面两个平面内的像差问题，但是由于球面玻璃的球心为一点，系统只在一个视场没有受到介质折射率不同而带来的像差影响，在其他视场依然会受到折射效应带来的像差影响，且随视场的增大，折射率带来的影响也就增大，在系统的照明光斑从物镜出来后，经过球面镜子时，由于非中心区域的光斑与球面镜子存在一定的角度，因此产生折射效应，从而使得系统的照明视场变形，而使用柱面镜8可以避免这一个问题。在同一个照明视场大小时，使用柱面镜8比使用球面镜11需要扫描角度更小，而振镜4的行程减少，其扫描的频率可以增加，对应相机的成像速度可以增加。当系统不适用扫描振镜4行成虚拟光片，而是使用柱面镜11形成实际光片时，其效果也是一致的。
39.实施例2：参见图13，一种用于光片荧光显微镜的样品仓，包括储存盒12以及实施例1中的柱面镜8，其中：柱面镜8连接在储存盒12的一侧壁上，并共同限制出一个用于容纳样品保存溶液9以及样品的腔体；柱面镜8的内曲面与样品保存溶液9接触。当光束入射到柱面镜8的柱面时，光线是垂直空气和柱面镜的分界面的，同样也是垂直样品保存溶液9和柱面镜8的分界面的，因此不会由于折射率的不同而产生像差。因此光片荧光显微镜的成像系统不会由于折射率的不同而产生像差，当系统其他光学器件没有像差时候，聚焦光斑可以达到衍射极限的大小。
40.实施例3：使用zemax对光片荧光显微镜成像系统中的照明子系统进行仿真，使用理想准直光作为系统的照明光源，使用理想透镜作为系统的物镜，则系统带来的像差则为最后一个实际透镜以及溶液所引起的。
41.照明子系统用于形成照明光片，照明子系统包括光源1、第一4f系统、振镜4、第二4f系统、物镜7以及实施例1中的柱面镜8，第一4f系统由第一透镜2和第二透镜3组成，第二4f系统由第三透镜5和第四透镜6组成，柱面镜8的外曲面靠近物镜7。照明子系统的照明光路参见图6、7，光源1发出一束准直光束，然后经过第一4f系统，然后到达振镜4上，然后再经过第二4f系统，到达成像物镜7，然后经过一个柱面镜8，柱面镜8前后两个曲面的轴线重合，经过柱面镜8后再到达样品保存溶液9最后到达成像样品。柱面镜的轴线和物镜工作面重合。当使用平凸镜形成光片时，照明子系统可以包括光源1、第一4f系统、平凸柱面镜、第二4f系统、物镜7和柱面镜8，光源、第一4f系统、平凸柱面镜、第二4f系统、物镜和柱面镜沿照明光路依次设置。
42.参见图1，对于光片荧光显微镜的照明光路，有三个较为重要的参数，光片的厚度ω0，聚焦光斑的焦深ωr，光片高度h，其中，光片的厚度ω0决定了光片荧光显微镜的轴向分辨率，焦深ωr和光片高度h决定了照明视场的大小。而光片的厚度和焦深是一对平衡关系，当系统没有像差时候，其相应的大小由照明系统的数值孔径决定。对于光片荧光显微镜的照明光片，需要在保证系光片的厚度ω0是满足系统参数要求下，系统的焦深ωr和光片高度
h能够的数值足够大，能够给成像光路提供足够的视场。
43.参见图10，光束入射到柱面镜8的柱面时候，光线是垂直空气和柱面镜的分界面的，同样也是垂直溶液和柱面镜的分界面的，因此成像系统不会由于折射率的不同而产生像差，当系统其他光学器件没有像差时候，聚焦光斑可以达到衍射极限的大小。
44.从图8照明子系统的x-y平面，可以看出无论振镜4扫描多大的角度，入射光线入射到柱面镜8表面的情况都是一直的，这就使得光片高度大小h，是根据振镜4的扫描角度以及成像物镜的口径决定的，相对于使用球面镜11，可以较大的提升系统的光片的高度h。
45.参见图9、11，从图中可以看出，由于光束从透镜出来的时候，是有一定的聚焦效果，这就造成在透镜的x-y平面，光斑的非中心位置与柱面镜8的表面有一定的夹角，因为发生了折射效果，光斑无法聚焦到一个点上，从物镜7的工作表面上看，光斑是一个线光斑。光斑宽度受到介质折射率的影响而有较大的宽度，但是光斑高度因为柱面将折射效果消除，其大小接近光斑的衍射极限。
46.当系统振镜扫描起来的时候，系统照明光片的形状与图1相一致，当加入柱面镜8的时候，照明系统的x-z平面内，由于柱面镜8的作用，光线的聚焦可以摆脱介质折射率不同带来的像差干扰，使得聚焦光斑的ω0值达到接近衍射极限的大小，而ω0就是光片的厚度，这个参数决定着系统的轴向分辨率，而聚焦光斑的另外一个方向，则是对应着系统的光片高度h，在这个方向，光斑在振镜4的扫描下，形成一个虚拟的光片。振镜的扫描频率高于相机的成像频率，因此在这个方向，光斑的聚焦效果不会影响系统的光片的形状，也就是不会影响系统的轴向分辨率。
47.以上，仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何在本技术揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。