阿萨伊的发酵产物、包含其的产品及其应用的制作方法

1.本发明涉及阿萨伊发酵技术领域，具体而言，涉及一种阿萨伊的发酵产物、包含其的产品、及其应用。


背景技术：

2.阿萨伊是天然热带棕榈树属的果实，又称“巴西莓”，在果实未成熟时果皮为绿色，当完全成熟时变成深紫色，其大小类似于葡萄，大约有28种果实，其中有三种主要品种生产可食用水果：euterpe edulis mart.(ee)、euterpe precatoria mart.(ep)和euterpe oleracea mart.(eo)，广泛分布于亚马逊流域的巴西、秘鲁、哥伦比亚等地。
3.阿萨伊作为一种新的“超级水果”受到广泛关注，当果实成熟时含有抗氧化物质包括是花青素、原花青素和其它黄酮类化合物，其中花青素3-葡萄糖苷和花青素3-芸香糖苷是花青素的主要成分，黄酮类化合物包括异葒草素、葒草素、异牡荆黄素、金雀花素等，此外对阿萨伊的总类胡萝卜素和总花青素抗氧化活性的研究得出，两者一起有助于果实的抗氧化活性。
4.国内外大量试验研究表明阿萨伊可以抑制dpph自由基、阴离子超氧化物、过氧自由基、羟基自由基和脂质体的氧化，具有高抗氧化活性，被亚马逊河流域的居民称为“紫色黄金”，作为药食两用天然植物资源，在世界范围内引起广泛关注。
5.但由于阿萨伊原液滋气味较差，苦涩味较重，此外将阿萨伊运到亚马逊地区之外成本高，导致其在产品、不同地域上应用存在一定局限。发酵后的阿萨伊不仅改善了滋气味具有愉悦的发酵风味，此外其自由基吸收能力、dpph自由基清除能力、羟基自由基清除能力、abts自由基清除能力、铁离子还原能力、总sod活性均强于阿萨伊原果浆，可作为功能性原料广泛应用于食品、保健食品、药品和化妆品等行业中，剂型包括粉剂、片剂、颗粒剂、口服液、胶囊、凝胶糖果等。
6.日本专利jp6714367b2提供了含阿萨伊的饮料和减少涩味的方法，在含阿萨伊的饮料中加入黄原胶以降低阿萨伊饮料的涩味，该发明是通过加入食品添加剂改善阿萨伊的滋气味。
7.杨婧娀等人及专利申请br102016030517a2公开了阿萨伊果果汁经过酵母菌发酵制备成阿萨伊果发酵酒，果酒具有优异的味觉和芳香结构，此外能加速细胞膜之间的流动性、促进营养吸收和体内废物的排除、净化消化系统脂肪残留物等生理功能。该现有技术是利用酵母菌对阿萨伊进行发酵制备发酵果酒，该产品中酒精度较高，导致受众受限。
8.可见，现有技术中阿萨伊的发酵产物具有发酵风味单一的问题。


技术实现要素：

9.本发明的主要目的在于提供一种阿萨伊的发酵产物、包含其的产品及其应用，以解决现有技术中的阿萨伊的发酵产物风味单一的问题。
10.为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种阿萨伊的发酵产物，发酵
产物以阿萨伊为原料发酵得到，以重量份计，发酵产物包括：0.05～0.30份灰分、1.0～3.0份的蛋白质、2.5～4.0份的脂肪、0.40～0.80份多酚类物质、0.05～0.15份游离氨基酸、0.8～1.20份黄酮类物质以及0.003～0.005份挥发性香气成分。
11.进一步地，上述挥发性香气成分的重量份为0.004～0.005份，优选挥发性香气成分包括乙醛、二甲基硫、甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丙醇、异丁醇和异戊醇中的一种或多种，以占挥发性成分的质量百分含量计，优选挥发性成分包括20～25％的乙醛、1.5～2.0％的二甲基硫、2.0～2.3％的甲酸乙酯、5.0～5.5％的乙酸乙酯、30～35％的正丙醇、8.5～10％的异丁醇和25～30％的异戊醇。
12.进一步地，上述发酵产物包括：0.25～0.30份的灰分、2.7～3.0份的蛋白质、2.8～3.2份的脂肪、0.48～0.52份多酚类物质、0.10～0.15份游离氨基酸、1.0～1.1份黄酮类物质以及0.004～0.0045份挥发性香气成分，优选地，发酵产物还包括水，100重量份的发酵产物中水分的重量份为88～90份。
13.进一步地，上述游离氨基酸包括天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸和脯氨酸中的一种或多种，优选地，其中，亮氨酸的重量份为0.01～0.06份，优选为0.025～0.030，谷氨酸的重量份为0.01～0.04份，优选为0.015～0.02份，丙氨酸的重量份为0.01～0.05份，优选为0.014～0.016，缬氨酸的重量份为0.01～0.03份，优选为0.010～0.015，苯丙氨酸的重量份为0.01～0.04份，优选为0.008～0.012。
14.进一步地，上述黄酮类物质包括3’,4’羟基-川陈皮素、3’羟基-川陈皮素、4’羟基-川陈皮素、甜橙黄酮、4’羟基-桔皮素、川陈皮素、桔皮素、5’羟基-川陈皮素和5’羟基-桔皮素中的一种或多种，以占黄酮类物质的质量百分含量计，优选黄酮类物质包括18～20％的3’,4’羟基-川陈皮素、0.5～1.0％的3’羟基-川陈皮素、1.5～2.2％的4’羟基-川陈皮素、25～30％的甜橙黄酮、4.0～5.0％的4’羟基-桔皮素、1.0～1.5％的川陈皮素、18～22％的桔皮素、13～18％的5’羟基-川陈皮素和5～10％的5’羟基-桔皮素。
15.进一步地，上述发酵产物还包括γ-氨基丁酸，γ-氨基丁酸的重量份为0.001～0.01份，优选为0.005～0.006份；优选地，以100份的发酵产物的干物质计，发酵产物还包括5.0～15.0份有机酸，优选包括8～12份有机酸，优选地，有机酸包括乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、苹果酸、酒石酸、草酸和柠檬酸中的一种或两种以上，更优选地，乳酸的重量份为3.5～6.0份，优选为5.0～6.0份，乙酸的重量份为1.5～4.0份，优选为3.0～4.0份，柠檬酸的重量份小于0.030份。
16.进一步地，上述发酵产物的orac值为180～400μmol/g trolox，优选为180～250μmol/g trolox。
17.进一步地，上述发酵产物包括副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和植物乳杆菌中的一种或多种。
18.进一步地，上述发酵产物以阿萨伊为原料通过混合菌剂进行发酵得到，混合菌剂包括副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和植物乳杆菌中的一种或多种，优选副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和植物乳杆菌的重量比为0.2～12:0.5～1.5:0.2～2，优选为0.5～1.5:1:1.5～0.5，优选地，阿萨伊在发酵之前采用果胶酶和/或纤维素酶进行酶解得到阿萨伊原液，优选果胶酶相对于阿萨伊的质量比例为0.01～0.10:100，优选纤维素酶相对于阿萨伊的质量比
例为0.02～0.12:100，优选发酵还需要添加碳源和氮源，进一步优选发酵时所采用的氮源包括相对于阿萨伊原液重量1～3％的小麦低聚肽或者碳源包括相对于阿萨伊原液重量0.2～1％的葡萄糖。
19.根据本发明的另一方面，提供了一种包含阿萨伊发酵产物的产品，该阿萨伊发酵产物为上述任一种的发酵产物，产品选自食品、保健品、药品和化妆品中的任意一种。
20.根据本发明的另一方面，提供了一种阿萨伊发酵产物的应用，该阿萨伊发酵产物为上述任一种的发酵产物，应用包括将阿萨伊发酵产物应用于食品、保健品、药品或化妆品。
21.应用本发明的技术方案，阿萨伊的发酵物中，挥发性香气成分相对于发酵前明显增多，因此在很大程度上丰富了阿萨伊发酵物的风味。
附图说明
22.构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
23.图1示出了根据本发明的实施例1的γ-氨基丁酸混标图谱；
24.图2示出了根据本发明的实施例1的阿萨伊果浆的γ-氨基丁酸的测定图谱；
25.图3示出了根据本发明的实施例1的阿萨伊发酵液的γ-氨基丁酸的测定图谱；
26.图4-a示出了根据本发明的实施例1的乳酸标准品的离子色谱图；
27.图4-b示出了根据本发明的实施例1的7种有机酸标准品的离子色谱图；
28.图5-a示出了根据本发明的实施例1的阿萨伊果浆冻干粉的乳酸离子色图谱；
29.图5-b示出了根据本发明的实施例1的阿萨伊果浆冻干粉的7种有机酸离子色图谱；
30.图6-a示出了根据本发明的实施例1的阿萨伊发酵液冻干粉的乳酸离子色图谱；
31.图6-b示出了根据本发明的实施例1的阿萨伊发酵液冻干粉的7种有机酸离子色图谱；
32.图7示出了根据本发明的实施例1的黄酮标准品的液相色谱图；
33.图8示出了根据本发明的实施例1的阿萨伊果浆的液相色谱图；
34.图9示出了根据本发明的实施例1的阿萨伊发酵液的液相色谱图；
35.图10示出了根据本发明的实施例1的阿萨伊果浆的气质色图谱；
36.图11示出了根据本发明的实施例1的阿萨伊发酵液的气质色图谱；
37.图12示出了根据本发明的实施例1的不同浓度trolox的动态荧光衰减曲线；
38.图13示出了根据本发明的实施例1的trolox标准曲线；
39.图14示出了根据本发明的实施例1的三种阿萨伊样品的dpph自由基清除能力；
40.图15示出了根据本发明的实施例1的三种阿萨伊样品的羟基自由基清除能力；
41.图16示出了根据本发明的实施例1的trolox标准品绘制的abts标准曲线；
42.图17示出了根据本发明的实施例1的feso4标准曲线；
43.图18示出了根据本发明的实施例1的阿萨伊果浆冻干粉的扫描电镜图；
44.图19示出了根据本发明的实施例1的阿萨伊发酵液冻干粉的扫描电镜图。
具体实施方式
45.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
46.如本技术背景技术所分析的，现有技术的阿萨伊的发酵产物要么酒精度过高，要么风味单一需要采用其他物质进行调和。为了解决该问题，本技术提供了一种阿萨伊的发酵产物及包含阿萨伊发酵产物的产品。
47.在本技术一种典型的实施方式中，提供了一种阿萨伊的发酵产物，该发酵产物以阿萨伊为原料发酵得到，发酵产物包括：0.05～0.30份灰分、1.0～3.0份的蛋白质、2.5～4.0份的脂肪、0.40～0.80份多酚类物质、0.05～0.15份游离氨基酸、0.8～1.20份黄酮类物质以及0.003～0.005份挥发性香气成分。
48.本技术的阿萨伊的发酵物中，挥发性香气成分相对于发酵前明显增多，因此在很大程度上丰富了阿萨伊发酵物的风味。
49.经过分析，上述多酚类物质的主要成分为单宁。
50.在感官评价过程中，普遍认为阿萨伊的发酵产物的香气更为突出，在一些实施例中经检测，挥发性香气成分的重量份为0.004～0.005份，优选挥发性香气成分包括乙醛、二甲基硫、甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丙醇、异丁醇和异戊醇中的一种或多种，以占挥发性成分的质量百分含量计，优选挥发性成分包括20～25％的乙醛、1.5～2.0％的二甲基硫、2.0～2.3％的甲酸乙酯、5.0～5.5％的乙酸乙酯、30～35％的正丙醇、8.5～10％的异丁醇和25～30％的异戊醇。其中的二甲基硫、甲酸乙酯和异丁醇都是发酵后新产生的香气成分，其他各香气成分相对于发酵前的含量具有显著提升。
51.在本技术一些实施例中，发酵产物包括：0.25～0.30份的灰分、2.7～3.0份的蛋白质、2.8～3.2份的脂肪、0.48～0.52份多酚类物质、0.10～0.15份游离氨基酸、1.0～1.1份黄酮类物质以及0.004～0.0045份挥发性香气成分。发酵产物的蛋白质和脂肪相对于发酵之前减少，小分子的游离氨基酸增多，提高了阿萨伊的可吸收性。
52.经过对发酵产物的进一步检测发现，发酵产物中的γ-氨基丁酸含量也有增加，比如在一些实施例中，上述发酵产物还包括γ-氨基丁酸，γ-氨基丁酸的重量份为0.001～0.01份，优选为0.005～0.006份。γ-氨基丁酸是发酵产生的生理活性物质，是一种抑制性神经递质，具有降血压、抗惊厥、改善脑机能和调节睡眠的作用，因此也赋予发酵产物一定的降血压、改善睡眠的效果。
53.通常的阿萨伊中游离氨基酸包括天门冬氨酸(asp)、苏氨酸(thr)、丝氨酸(ser)、谷氨酸(glu)、甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、胱氨酸(cys)、蛋氨酸(met)、异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、酪氨酸(tyr)、苯丙氨酸(phe)、组氨酸(his)、赖氨酸(lys)、精氨酸(arg)和脯氨酸(pro)，但是发酵后其中某些氨基酸的含量变化比较明显，同样以100重量份的发酵前阿萨伊湿重来计算，发酵前各游离氨基酸的重量份均在0.01份以下。发酵产物中，亮氨酸的重量份为0.01～0.06份，优选为0.025～0.030，谷氨酸的重量份为0.01～0.04份，优选为0.015～0.02份，丙氨酸的重量份为0.01～0.05份，优选为0.014～0.016，缬氨酸的重量份为0.01～0.03份，优选为0.010～0.015，苯丙氨酸的重量份为0.01～0.04份，优选为0.008～0.012。
54.上述各氨基酸共同赋予了阿萨伊的发酵产物酸甜鲜的滋味。
55.阿萨伊的发酵产物中黄酮类物质的种类和总含量和发酵前基本维持相当，在一些实施例中，经检测，上述黄酮类物质包括3’,4’羟基-川陈皮素、3’羟基-川陈皮素、4’羟基-川陈皮素、甜橙黄酮、4’羟基-桔皮素、川陈皮素、桔皮素、5’羟基-川陈皮素和5’羟基-桔皮素中的一种或多种。在一些实施例中，以占黄酮类物质的质量百分含量计，优选黄酮类物质包括18～20％的3’,4’羟基-川陈皮素、0.5～1.0％的3’羟基-川陈皮素、1.5～2.2％的4’羟基-川陈皮素、25～30％的甜橙黄酮、4.0～5.0％的4’羟基-桔皮素、1.0～1.5％的川陈皮素、18～22％的桔皮素、13～18％的5’羟基-川陈皮素和5～10％的5’羟基-桔皮素，上述各物质含量相对于发酵前有所变化，对发酵产物的抗氧化作用提升具有一定的贡献。
56.在一些实施例中，阿萨伊的发酵产物的酸味得到明显改善，经过分析发现，以100份的发酵产物的干物质计，发酵产物还包括5.0～15.0份有机酸，优选包括8～12份有机酸，优选有机酸包括乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、苹果酸、酒石酸、草酸和柠檬酸中的任意一种或多种。优选乳酸的重量份为3.5～6.0份，优选为5.0～6.0份，乙酸的重量份为1.5～4.0份，优选为3.0～4.0份，柠檬酸的重量份小于0.030份。上述有机酸的总量相对于发酵之前成倍增加，尤其是其中的乙酸含量增加了近20倍，从而赋予了阿萨伊的发酵产物更充分的酸味，更好地掩盖了其涩味。
57.本技术的发酵产物可以为干物质状态或者湿物质状态存在，比如当以湿物质状态存在时，发酵产物还包括水，100重量份的发酵产物中水分的重量份为88～90份，其他组分为前述或后续的各组分。干物质可以以该湿物质为原料通过浓缩和喷雾干燥得到，或者通过浓缩和冻干得到，具体的浓缩、喷雾干燥或冻干工艺均可参考现有技术，本技术不再赘述。
58.如本技术背景技术所分析的，阿萨伊具有优异的抗氧化作用，发酵后的发酵产物的仍然具有较好的抗氧化特性，优选上述发酵产物的orac值为180～400μmol/g trolox，优选180～250μmol/g trolox。
59.本技术的发酵产物的口感得到改善，而且发酵产物更天然的同时具有阿萨伊和益生菌的双重营养。在一些实施例中，上述发酵产物包括副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和植物乳杆菌中的一种或多种。上述各菌种可以选用现有技术中的商业化菌种。比如副干酪乳杆菌选用保藏编号为cgmcc no:14813的副干酪乳杆菌，植物乳杆菌选用生物保藏编号为cgmcc no:14812的植物乳杆菌，肠膜明串珠菌选用生物保藏编号为cicc no:22177的肠膜明串珠菌。
60.在一些实施例中，优选地，上述发酵产物以阿萨伊为原料通过混合菌剂进行发酵得到，混合菌剂包括副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和植物乳杆菌。上述副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和植物乳杆菌与前述产物中的各菌种相同。为了更好地优化上述发酵产物的组成，优选上述副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和植物乳杆菌的重量比为0.2～12:0.5～1.5:0.2～2，进一步优选为0.5～1.5:1:1.5～0.5。
61.阿萨伊的脂肪酸中不饱和脂肪酸较多，主要包括：油酸、棕榈油酸和亚油酸。脂肪酸在发酵过程中易产生不良风味和气味，阿萨伊果清洗打浆后会出现脂肪球上浮形成脂肪圈，加之果汁中纤维素、蛋白等大分子颗粒悬浮物絮凝下沉，极易出现分层现象，使微生物与底物不能充分接触进行发酵。为了进一步提高混合菌剂的对脂肪和蛋白的发酵效果，优选阿萨伊在发酵之前采用果胶酶和/或纤维素酶进行酶解得到阿萨伊原液，通过上述酶解
处理，结合上述发酵菌种，使脂肪酸的代谢产物的风味和气味更加柔和易于接受，从而使发酵产物的挥发性香气成分增加，具有更愉悦的风味。另外，为了使上述各菌种充分代谢，优选上述发酵时所采用的氮源包括相对于阿萨伊原液重量1～3％的小麦低聚肽，碳源包括相对于阿萨伊原液重量0.2～1％的葡萄糖。
62.在本技术另一种典型的实施方式中，提供了一种包含阿萨伊发酵产物的产品，该阿萨伊发酵产物为上述任一种的发酵产物，上述产品选自食品、保健品、药品和化妆品中的任意一种。本技术的液态发酵产物，如果应用到液体剂型产品中，可先进行澄清、均质、瞬时杀菌、灌装、巴士杀菌、冷却过程处理；如果应用到粉剂剂型产品中，可进行喷雾干燥或冷冻干燥处理。由于本技术的阿萨伊的发酵产物比原阿萨伊果浆具有更高的氧化自由基吸收能力、dpph自由基清除能力、羟基自由基清除能力、abts自由基清除能力、铁离子还原能力、总sod活性，并改善了阿萨伊的滋气味，可作为功能性原料应用于食品、保健食品、药品和化妆品等行业中。
63.在本技术另一种典型的实施方式中，提供了一种阿萨伊发酵产物的应用，该阿萨伊发酵产物为上述任一种的发酵产物，上述应用包括将阿萨伊发酵产物应用于食品、保健品、药品或化妆品中。本技术的液态发酵产物，如果应用到液体剂型产品中，可先进行澄清、均质、瞬时杀菌、灌装、巴士杀菌、冷却过程处理；如果应用到粉剂剂型产品中，可进行喷雾干燥或冷冻干燥处理。由于本技术的阿萨伊的发酵产物比原阿萨伊果浆具有更高的氧化自由基吸收能力、dpph自由基清除能力、羟基自由基清除能力、abts自由基清除能力、铁离子还原能力、总sod活性，并改善了阿萨伊的滋气味，可作为功能性原料应用于食品、保健食品、药品和化妆品等行业中。
64.以下为了更好地控制所得到的阿萨伊的发酵产物的某些组成或性能，分别以举例方式对其发酵方法的某些工艺过程或参数进行优化。
65.在一些实施例中，控制上述发酵的温度为30～37℃、时间为1～10天。通过调整具体的发酵时间，来调控发酵产物的组成。
66.为了使发酵方法更易于连续进行，在一些实施例中，先将混合菌剂接种在mrs培养基中进行扩大培养，得到活化菌种，优选活化菌种中混合菌剂的菌种数量在106～108cfu/ml；将活化菌种与阿萨伊果浆原液混合进行发酵处理，得到阿萨伊的发酵产物，优选活化菌种的接种量为0.1～4％，上述实施例既给出了混合菌剂扩大培养、接种发酵的过程，而且给出了优选的菌种数量和接种量，为工业化实施提供了便利性。
67.本技术上述各实施例中发酵所用的阿萨伊果浆原液优选采用以下方式进行处理，比如先将阿萨伊进行打浆，得到阿萨伊果浆；然后对阿萨伊果浆进行酶解和灭酶，得到阿萨伊果浆原液，酶解采用果胶酶和/或纤维素酶进行。通过将阿萨伊原液进行匀浆、调ph、酶解、灭酶可使阿萨伊原液处于均质稳定状态，再进行微生物接种发酵，实现对其中蛋白和脂肪酸的均匀充分代谢分解。
68.以下举例给出上述匀浆、酶解的具体操作，以优化各操作带来的效果。比如将阿萨伊果浆进行匀浆处理后调节阿萨伊果浆的ph值至5.5～7.5之间，得到预处理果浆，匀浆的转速为5000～6000r/min，时间为10～20min；将预处理果浆与果胶酶和/或纤维素酶混合后进行酶解，得到酶解后果浆，优选果胶酶相对于预处理果浆的质量比例为0.01～0.10:100，优选纤维素酶相对于预处理果浆的质量比例为0.02～0.12:100；酶解后，对酶解后果浆中
的果胶酶和/或纤维素酶进行灭酶处理，得到阿萨伊果浆原液。
69.为了提高酶的活性和酶解效率，优选上述酶解的温度为40～60℃，酶解的时间为0.5～3h，优选酶解过程中进行搅拌，搅拌的速度为300～500r/mim。该酶解条件适用于果胶酶酶解也适用于纤维素酶酶解。
70.此外，在发酵之前可以补充适当的碳源和氮源，以维持目标时间内的高效率发酵，在酶解和灭酶处理之间，将酶解后果浆、碳源和氮源混合形成混合体系并将混合体系的ph值调节至6～7，优选氮源包括相对于阿萨伊原液重量1～3％的小麦低聚肽，碳源包括相对于阿萨伊原液重量0.2～1％的葡萄糖。在灭酶之前加入碳源和氮源提高了发酵物的均匀性。
71.上述灭酶的方式采用本领域常用的加热灭活法，为了既能实现对酶的充分灭活，又避免对营养成分的破坏，优选上述灭酶的温度在95～120℃之间、灭酶时间为10～20min。
72.以下将结合实施例和对比例，进一步说明本技术的有益效果。
73.实施例1
74.采用以下方法制备阿萨伊发酵物：副干酪乳杆菌为保藏编号为cgmcc no:14813的副干酪乳杆菌，植物乳杆菌为生物保藏编号为cgmcc no:14812的植物乳杆菌，肠膜明串珠菌为生物保藏编号为cicc no:22177的肠膜明串珠菌。
75.按照如下阿萨伊发酵产物制备流程得到阿萨伊发酵产物：
76.(1)原料准备：阿萨伊果清洗后进行打浆，巴氏杀菌后得阿萨伊果浆，-25℃保存待用；
77.(2)原料预处理：
①
匀浆：设定匀浆机转速5600r/min，匀浆时间15min；
②
调ph：调节ph值，从4.15调节至6.37；
③
酶解：加入质量含量为阿萨伊果浆0.05％的果胶酶(黑曲霉发酵来源，青岛海维森生物科技有限公司)、0.05％的纤维素酶(真菌来源，青岛海维森生物科技有限公司)，50℃，搅拌400rpm，酶解1h；
④
添加碳源、氮源：添加碳氮源并混合均匀(氮源小麦低聚肽购于北京中食海氏生物技术有限公司，其添加质量为阿萨伊果浆的2.5％、碳源葡萄糖的添加质量为阿萨伊果浆的0.5％)，调整ph至6.4～6.8；
⑤
灭酶：115℃、15min进行灭酶，得到阿萨伊果浆原液；
78.(3)菌种活化：将菌种接种于以mrs肉汤并添加1.25％～1.5％的小麦低聚肽培养基中，37℃，静置培养24h，菌种数量达到107cfu/ml，菌种组成为副干酪乳杆菌：肠膜明串珠菌：植物乳杆菌＝0.5:1:1.5(质量比)。
79.(4)将活化后菌种接种于阿萨伊果浆原液中静置发酵，接种量为1.5％，发酵温度为30℃、时间为8天。
80.得到的实施例1阿萨伊发酵产物再进行以下成分分析：
81.1、基础理化成分含量
82.对阿萨伊果浆原液和发酵液的理化成分(水分、灰分、蛋白质、脂肪、多酚、原花青素)进行了分析，分析方法分别依据：gb 5009.3、gb 5009.4、gb 5009.5、gb 5009.6、ny/t 1600、db12/t 885。由表1可见，阿萨伊果浆的水分、灰分、蛋白质、脂肪、多酚和原花青素含量分别为88.99
±
0.12、0.02
±
0.00、1.30
±
0.07、3.60
±
0.16、0.82
±
0.03、0.44
±
0.04g/100g，阿萨伊发酵液的水分、灰分、蛋白质和脂肪、多酚和原花青素含量分别为89.09
±
0.15、0.26
±
0.01、2.77
±
0.06、2.99
±
0.18、0.50
±
0.02、0.12
±
0.01g/100g，发酵后，阿萨
伊的水分、灰分、蛋白质含量提高，脂肪、多酚、原花青素含量降低。
83.表1 阿萨伊原液和发酵液的基础理化成分
[0084][0085]
2、氨基酸组成和γ-氨基丁酸含量
[0086]
氨基酸可呈现出酸、甜、苦和鲜等味道，起到影响食品风味的作用。按照gb5009.124对阿萨伊果浆和发酵液的氨基酸组成及γ-氨基丁酸含量进行分析，含量如表2所示。发酵后，阿萨伊的氨基酸含量有所提高，与蛋白质测定结果一致。就游离氨基酸而言，阿萨伊果浆中丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸含量较高，发酵液中亮氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸含量较高。这些氨基酸共同赋予了阿萨伊产品酸甜鲜的滋味。
[0087]
图1为γ-氨基丁酸混标图谱，图2、图3分别为阿萨伊原液和发酵液的γ-氨基丁酸的测定图谱。经计算，阿萨伊果浆和发酵液的γ-氨基丁酸含量分别为0.004、0.006g/100ml，由此可见，发酵后阿萨伊的γ-氨基丁酸含量有所提高。
[0088]
表2 阿萨伊果浆和发酵液的游离氨基酸含量
[0089]
[0090][0091]
3、有机酸含量
[0092]
8种有机酸标准品的离子色谱图见图4，阿萨伊果浆冻干粉和发酵液冻干粉的有机酸测定图谱如图5、图6所示。冷冻干燥工艺参数均为样品提前预冻1h，温度达到-40℃～-30℃，转入干燥阶段，真空度20pa以下，冷冻干燥24～30h。经计算，有机酸含量结果如表3所示。发酵后，阿萨伊的8种有机酸总含量提高。阿萨伊原液中柠檬酸、丙酸、乳酸含量较高，发酵后乳酸、乙酸、丙酸含量较高。
[0093]
表3 阿萨伊果浆和发酵液的有机酸含量
[0094][0095]
4、黄酮含量
[0096]
黄酮标准品的液相色谱图见图7，阿萨伊果浆和发酵液的9种黄酮的液相色谱图见图8、图9。经计算，黄酮含量结果如表4所示。发酵后，阿萨伊的9种黄酮总含量降低。阿萨伊原液中4’羟基-川陈皮素、甜橙黄酮、5’羟基-桔皮素含量较高，发酵后甜橙黄酮、桔皮素、3’,4’羟基-川陈皮素含量较高。
[0097]
表4 阿萨伊果浆和发酵液的黄酮含量
[0098][0099]
5、挥发性香气成分分析
[0100]
阿萨伊果浆和发酵液的气质色谱图如图10和图11所示，经计算，两种阿萨伊产品的挥发性香气成分结果表5所示。原液的挥发性香气成分为4种，含量由高到低分别为正丙醇、乙醛、异戊醇、乙酸乙酯，发酵液产生挥发性香气成分7种，含量由高到低分别为正丙醇、异戊醇、乙醛、异丁醇、乙酸乙酯、甲酸乙酯、二甲基硫。发酵后挥发性成分含量提高，并且增加了异丁醇、甲酸乙酯、二甲基硫3种挥发性成分。由此可知，通过发酵工艺可以改善阿萨伊的产品风味。
[0101]
表5 阿萨伊果浆和发酵液的挥发性成分
[0102][0103][0104]
6、抗氧化性检测
[0105]
对实施例1的阿萨伊果浆原液、阿萨伊发酵液和市售阿萨伊提取物(法国戴安娜天然食品原料公司)的h-orac值进行检测，其中，阿萨伊果浆原液、阿萨伊发酵液分别采用以
下冻干工艺进行处理，得到相应的冻干粉。冻干工艺同上述记载。
[0106]
orac是氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity)的缩写。其中h-orac值用于评价水溶性抗氧化物质的orac值。不同浓度trolox的动态荧光衰减曲线和标准曲线如图12和图13所示，y＝0.0874x-0.0795，r2＝0.9998。根据标准曲线，计算上述三种样品的h-orac值，如表6所示。发酵后，阿萨伊的h-orac值由453.64
±
24.28μmol/g trolox提高到708.77
±
12.46μmol/g trolox，提高了56.24％。
[0107]
通过rmcd将脂溶性物质纳入其空腔而增加水溶性，用于测定l-orac值，来评价脂溶性物质的氧自由基吸收能力。根据标准曲线，计算阿萨伊果浆和发酵液的l-orac值，如表6所示。发酵后阿萨伊样品的l-orac值由141.80
±
10.40μmol/g trolox提高到168.28
±
13.18μmol/g，提高了26.48％。经计算，发酵前后阿萨伊样品的orac值(h-orac值 l-orac值)分别为595.45
±
30.71、877.05
±
20.58μmol/g trolox，发酵后orac值提高了47.29％。
[0108]
dpph自由基清除能力是利用电子转移和电荷中和原理，评价物质抗氧化能力的一项重要指标。dpph自由基在有机环境中是一种稳定的n离子自由基，在517nm波长处具有最大吸收峰。当体系中有自由基清除剂时，dpph自由基的单电子被清除剂中和，其溶液颜色由紫色变为浅黄或无色，直接表现为吸光度数值的下降。由图14可知，在质量浓度为0.0625～2mg/ml范围内，3种阿萨伊产品均具有显著的dpph自由基清除能力，并且清除率与质量浓度呈明显的剂量关系。dpph自由基清除能力依次为阿萨伊发酵液、阿萨伊原液，市售阿萨伊提取物。对比分析发酵前后阿萨伊样品的dpph自由基清除率可知，ic
50
值分别约为0.58、0.16mg/ml，发酵后，阿萨伊的清除能力有所提高。
[0109]
羟基自由基是在生物系统中形成的极其活泼的自由基，其可以引发细胞膜的脂质过氧化，对人体危害性极高。三种阿萨伊样品的羟基自由基清除能力如图15所示。阿萨伊样品的羟自由基清除能力呈明显的量效关系，在实验浓度范围内与浓度呈正相关。阿萨伊样品具有明显的清除羟基自由基能力，清除率随质量浓度的增大而增强，呈明显的量效关系。阿萨伊原液和发酵液的羟基自由基清除能力明显高于市售阿萨伊提取物。发酵后，阿萨伊的羟基自由基清除率ic
50
值分别约为0.97、0.49mg/ml，清除能力有所提高。羟基自由基清除能力与其可作为供氢体使自由基还原，从而终止自由基连锁反应有关。
[0110]
该方法以abts为显色引发剂，其原理为加入氧化剂后，abts试剂在水溶液环境中可生成稳定的蓝绿色自由基abts ，并在734nm处有最大吸收。加入抗氧化性物质后abts 的电荷被中和，颜色变浅吸光值随之下降，下降趋势可反应出所检测物质抗氧化性的强弱。根据trolox标准品绘制的abts标准曲线如图16所示。三种阿萨伊样品的abts自由基清除能力由表6所示。清除能力由强到弱排序为：阿萨伊发酵液、阿萨伊原液、市售阿萨伊提取物。
[0111]
铁还原能力(ferric reducing antioxidant power，frap)是一种快速且简单的抗氧化能力检测指标，可作为测定物质还原能力的一种方法。根据feso4标准曲线，计算三种阿萨伊样品的frap值，frap值越大，抗氧化能力越强。feso4标准曲线见图17，三种阿萨伊样品的frap值如表6所示。阿萨伊发酵液的frap值与原液相比有所提高，高于市售的阿萨伊提取物。
[0112]
超氧化物歧化酶(sod)是一类重要的抗氧化酶，广泛存在与人类和各种生物中，具有很强的抗氧化作用，能够清除体内超氧离子自由基，保护机体免受自由基的伤害，在抗癌、抗衰老、抗炎症、抗辐射等疾病中具有不可忽视的作用。发酵前后阿萨伊(浓度5mg/ml)
和三种阿萨伊粉(浓度10mg/ml)的总sod活性(包括sod抑制率和sod酶活力)见表6。与frap值测定结果一致，总sod活性由高到低依次为：阿萨伊发酵液、阿萨伊果浆、市售的阿萨伊提取物。发酵后，阿萨伊的总sod活性有所提高。
[0113]
表6 阿萨伊果浆、发酵液以及市售阿萨伊提取物的抗氧化指标对比
[0114][0115]
7、扫描电镜分析
[0116]
利用扫描电镜从整体形态、颗粒大小等方面对阿萨伊发酵前后样品的微观形貌进行研究。分别在500倍和1000倍放大倍数下对阿萨伊果浆和发酵液的冻干粉进行扫描电镜观察，结果见图18、图19。可以看出，发酵前阿萨伊成不规则块状，发酵后，阿萨伊颗粒发生明显变化，呈现出不规则的片层状及桥状骨架。可能是由于发酵工艺中的均质、酶解以及复合乳酸菌发酵作用使得阿萨伊发酵前后微观形貌发生变化。
[0117]
8、电子舌分析
[0118]
电子舌系统使用具有广域选择特异性的人工脂膜传感器，模拟生物活体的味觉感受机理，通过检测各种味物质和人工脂膜之间的静电作用或疏水性相互作用产生的膜电势的变化，实现对5种基本味(酸、涩、苦、咸、鲜)和甜味的评价。结果显示，阿萨伊原液和发酵液在甜味和酸味上存在一定差异，发酵后，阿萨伊甜味减少，酸味增加。
[0119]
总结：
[0120]
(1)利用扫描电镜从整体形态、颗粒大小等方面对阿萨伊发酵前后样品的微观形貌进行研究。分别在500倍和1000倍放大倍数下进行扫描电镜观察，可以看出，发酵前阿萨伊成不规则块状，发酵后，阿萨伊颗粒发生明显变化，形成不规则的片层状及桥状骨架。
[0121]
(2)通过电子舌系统对阿萨伊发酵前后样品的5种基本味(酸、涩、苦、咸、鲜)和甜味进行评价。结果显示，阿萨伊原液和发酵液在甜味和酸味上存在一定差异，发酵后，阿萨
伊甜味减少，酸味增加。
[0122]
(3)阿萨伊原液和发酵液的理化成分(水分、灰分、蛋白质、脂肪、多酚、原花青素)测定结果表明，阿萨伊原液的水分、灰分、蛋白质、脂肪、多酚和原花青素含量分别为88.99
±
0.12、0.02
±
0.00、1.30
±
0.07、3.60
±
0.16、0.82
±
0.03、0.44
±
0.04g/100g，阿萨伊发酵液的水分、灰分、蛋白质和脂肪、多酚和原花青素含量分别为89.09
±
0.15、0.26
±
0.01、2.77
±
0.06、2.99
±
0.18、0.50
±
0.02、0.12
±
0.01g/100g，发酵后，阿萨伊的水分、灰分、蛋白质含量提高，脂肪、多酚、原花青素含量降低。
[0123]
(4)氨基酸(水解氨基酸和游离氨基酸)组成分析结果表明，发酵后，阿萨伊的氨基酸含量有所提高。水解氨基酸测定结果显示，阿萨伊原液中谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸含量较高，发酵液中谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸含量较高。游离氨基酸测定结果显示，阿萨伊原液中丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸含量较高，发酵液中亮氨酸、谷氨酸、丙氨酸含量较高。
[0124]
(5)γ-氨基丁酸测定结果表明，阿萨伊原液和发酵液的γ-氨基丁酸含量分别为0.004、0.006g/100ml，发酵后阿萨伊的γ-氨基丁酸含量有所提高。
[0125]
(6)通过离子色谱图对阿萨伊原液和发酵液的8种有机酸含量进行了分析，结果表明，发酵后，阿萨伊的8种有机酸总含量提高。阿萨伊原液中柠檬酸、苹果酸、酒石酸含量较高，发酵后乳酸、乙酸、丙酸含量较高。发酵后乳酸含量明显得到提高。
[0126]
(7)通过高效液相色谱对阿萨伊原液和发酵液的9种黄酮含量进行了分析，结果表明，发酵后，阿萨伊的9种黄酮总含量降低。阿萨伊原液中4’羟基-川陈皮素、甜橙黄酮、5’羟基-桔皮素含量较高，发酵后甜橙黄酮、桔皮素、3
’4’
羟基-川陈皮素含量较高。
[0127]
(8)通过气相色谱-质谱联用仪对阿萨伊原液和发酵液的挥发性香气成分进行了分析，结果表明，原液的挥发性香气成分为4种，发酵液产生挥发性香气成分7种，发酵后挥发性成分含量提高，并且增加了异丁醇、乙酯、甲酸乙酯、二甲基硫4种挥发性成分。
[0128]
实施例2
[0129]
与实施例1的区别在于菌种组成为副干酪乳杆菌：肠膜明串珠菌：植物乳杆菌＝1:1:1(质量比)。
[0130]
实施例3
[0131]
与实施例1的区别在于菌种组成为副干酪乳杆菌：肠膜明串珠菌：植物乳杆菌＝1.5:1:0.5(质量比)。
[0132]
实施例4
[0133]
与实施例1的区别在于，酶解时，加入质量含量为阿萨伊果浆0.1％的果胶酶、0.02％的纤维素酶。
[0134]
实施例5
[0135]
与实施例1的区别在于，酶解时，加入质量含量为阿萨伊果浆0.01％的果胶酶、0.12％的纤维素酶。
[0136]
实施例6
[0137]
与实施例1的区别在于，氮源的添加质量为阿萨伊果浆的1％、碳源葡萄糖的添加质量为阿萨伊果浆的1％。
[0138]
实施例7
[0139]
与实施例1的区别在于，氮源的添加质量为阿萨伊果浆的3％、碳源葡萄糖的添加
质量为阿萨伊果浆的0.2％。
[0140]
实施例8
[0141]
与实施例1的区别在于，将活化后菌种接种于阿萨伊果浆原液中静置发酵，接种量为4.0％，发酵温度为30℃、时间为1天。
[0142]
实施例9
[0143]
与实施例1的区别在于，将活化后菌种接种于阿萨伊果浆原液中静置发酵，接种量为0.1％，发酵温度为37℃、时间为10天。
[0144]
采用与实施例1相同的方法，对实施例2至9所得到的阿萨伊发酵液进行理化分析、氨基酸组成分析、γ-氨基丁酸含量分析、有机酸含量分析、黄酮含量分析、挥发性香气成分分析，分析结果分别记录在表7、表8、表9、表10、表11中。
[0145]
表7 阿萨伊发酵液实施例理化分析
[0146][0147]
表8 阿萨伊发酵液实施例氨基酸组成及γ-氨基丁酸含量分析
[0148][0149][0150]
表9 阿萨伊发酵液实施例冻干粉有机酸含量分析
[0151][0152]
表10 阿萨伊发酵液实施例冻干粉黄酮含量分析
[0153][0154][0155]
表11 阿萨伊发酵液实施例挥发性香气成分分析
[0156][0157]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。