一种同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法与流程

一种同时检测维生素k1、mk4和mk7的方法
技术领域
1.本发明涉及分析领域，特别是涉及一种同时检测维生素k1、mk4和mk7的方法。


背景技术：

2.维生素k是2-甲基-1,4-萘醌及其衍生物的总称，目前已发现的天然脂溶性维生素k有两种：一种是在苜蓿中提出的油状物—维生素k1(vk1)，又称叶绿醌；另一种是在腐败鱼肉中获得结晶体维生素k2。维生素k2包括几种不同的形式，人类饮食中最常见的维生素k2形式为甲萘醌-4(mk4)和甲萘醌-7(mk7)。mk4主要存在于动物产品中，如蛋黄、肉、肝和黄油。mk7则由细菌合成，主要存在于发酵食品中。
3.维生素k又称凝血维生素，是合成各种凝血因子的必要辅助因子，在血液稳态中起不可或缺的作用。各种研究表明，缺乏维生素k会导致血液中活跃的凝血因子浓度降低，从而导致出血。此外维生素k营养状况也与骨质疏松症有关。人类流行病学和干预研究表明，维生素k可以减少骨质疏松症患者的骨质流失，降低骨折风险。另有研究表明，维生素k2可抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖，并诱导肝细胞癌、卵巢癌等多种实体瘤和血液系统疾病的细胞凋亡，具有明显的抗肿瘤作用，且与多种抗肿瘤药物有协同作用。临床给与维生素k2补充治疗干预，可降低肿瘤发生风险。因此，体液中vk1、mk4和mk7的精准检测是膳食摄入、营养状况和疾病诊断治疗监测的重要指标。准确灵敏地测定生物样品中vk1、mk4和mk7的含量具有十分重要的意义。
4.但是，目前国内外关于维生素k的研究主要集中在vk1的检测上。目前尚未有同时检测多种样品类型中vk1、mk4和mk7的报道。


技术实现要素：

5.由于vk1、mk4和mk7具有相同的2-甲基-1,4-萘醌环，经过质谱三重四级杆筛选和碰撞后，三种化合物产生相同的定量离子(质荷比187)，因此三种化合物在质谱检测上容易相互影响，导致检测结果不准确。同时mk7在结构上由于含有相对较长的类异戊二烯链，理化性质上和vk1、mk4相差较大。已有的文章报道关于mk7的检测，皆存在检测时间过长，基线高，目标物响应极低的情况，同时由于基质干扰严重，mk7检测稳定性差。vk1和mk4理化性质较为接近，在色谱行为上表现较为一致，一般检测方法较难以将两者在色谱上实现分离，导致检测结果互相干扰。
6.基于此，本发明的目的是提供一种能同时检测维生素k1、mk4和mk7的方法。本发明方法特异性强，针对维生素k1、mk4和mk7都获得良好的色谱分离度(保留时间相差大于0.5min)，可避免由于相同的定量子离子产生的定量干扰；同时本方法在各种样品类型检测中，检测结果基线低，基质干扰少，质谱通道无干扰。由于维生素k2在各种生物样品类型中的含量较低，本方法检测限低，灵敏度高，稳定性强，可同时提供vk1、mk4和mk7的精准检测。
7.具体技术方案如下：
8.一种同时检测维生素k1、mk4和mk7的方法，包括以下步骤：
9.取生物样品，加入包含三种待测物的同位素内标混合溶液，再加入提取溶剂提取，离心，取上清液干燥后用复溶液溶解，得到待测样品，采用液相色谱串联质谱法检测；
10.所述液相色谱串联质谱法所采用的色谱柱为c18色谱柱，所述c18色谱柱的粒径为1.6～2.2μm，所述c18色谱柱的长度为40～60mm。
11.在其中一些实施例中，所述色谱柱的粒径为1.6～2.0μm，进一步为1.6～1.9μm，更进一步为1.6～1.8μm。
12.在其中一些实施例中，所述色谱柱的长度为45～55mm，进一步为45～53mm，更进一步为48～53mm。
13.在其中一些实施例中，所述色谱柱的粒径为1.7μm，色谱柱的长度为50mm。
14.在其中一些实施例中，所述液相色谱串联质谱法的流动相a为0.15～0.25wt％甲酸的水溶液，流动相b为0.15～0.25wt％甲酸的甲醇溶液，采用梯度洗脱；
15.所述梯度洗脱的程序包括：
16.0～0.5min，流动相b的体积百分比为88～92％；
17.0.5～1min，流动相b的体积百分比由88～92％升高到95～98％；
18.1～2min，流动相b的体积百分比由95～98％升高到99～100％；
19.2～4.5min，流动相b的体积百分比为99～100％；
20.4.5～5.6min，流动相b的体积百分比由99～100％降低到88～92％；
21.5.6～6min，流动相b的体积百分比为88～92％。
22.在其中一些实施例中，所述梯度洗脱的程序包括：
23.0～0.5min，流动相b的体积百分比为90％；
24.0.5～1min，流动相b的体积百分比由90％升高到97％；
25.1～2min，流动相b的体积百分比由97％升高到100％；
26.2～4.5min，流动相b的体积百分比为100％；
27.4.5～5.6min，流动相b的体积百分比由100％降低到90％；
28.5.6～6min，流动相b的体积百分比为90％。
29.在其中一些实施例中，所述色谱柱的内径为1.8～2.4μm，优选为2.1μm。
30.在其中一些实施例中，所述液相色谱串联质谱法的色谱条件还包括：
31.进样量(8～20)μl；
32.柱温为40-45℃；
33.流速为(0.5
±
0.1)ml/min。
34.在其中一些实施例中，所述提取溶剂为正己烷。
35.在其中一些实施例中，所述复溶液为甲醇或含甲酸的甲醇溶液。
36.在其中一些实施例中，所述生物样品为血浆、血清、脑脊液或尿液。
37.在其中一些实施例中，所述三种待测物的同位素内标混合溶液为：含有1.0～1.6ng/ml vk1-d7、0.8～1.4ng/ml mk4-d7和1.0～2.5ng/mmk7-d7的乙醇溶液。
38.在其中一些实施例中，所述生物样品和同位素内标混合溶液的体积比为1：(1～3)。
39.在其中一些实施例中，所述生物样品和复溶液的体积比为1：(0.2～1.0)。
40.在其中一些实施例中，所述液相色谱串联质谱法的质谱参数包括：
41.vk1定量离子对：451.4/187.2；
42.vk1定性离子对：451.4/199.2；
43.vk1-d7内标离子对：458.5/194.1；
44.mk4定量离子对：445.2/187.1；
45.mk4定性离子对：445.2/227.1；
46.mk4-d7内标离子对：452.3/194.1；
47.mk7定量离子对：649.5/187.1；
48.mk7定性离子对：649.5/227.2；
49.mk7-d7内标离子对：656.6/194.1；
50.采用apci离子源，正离子模式，多重反应监测离子扫描模式。
51.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
52.本发明的发明人在研究中发现，要实现生物样品中vk1、mk4和mk7同时检测并实现三者很好的分离，尤其是要实现mk7与vk1、mk4很好的分离，色谱柱的选择非常关键，尤其是色谱柱的粒径和长度对于mk7的色谱和质谱行为影响很大。本发明通过采用特定粒径1.6～2.2μm、特定长度40～60mm的c18色谱柱进行液相色谱串联质谱法检测，配合本发明的其他步骤，本发明最终实现了一种能实现同时检测维生素k1、mk4和mk7的方法，并且还具有以下几方面优点：(1)特异性强，针对维生素k1、mk4和mk7都获得良好的色谱分离度(保留时间相差大于0.5min)，峰型好；(2)基线低，基质干扰少，方法的检测限低，灵敏度高，且稳定性强。(3)分析时间短，只需6min；(4)同时适用于多种样品类型。
53.进一步地，在选择特定粒径1.7μm、特定长度50mm的c18色谱柱的基础上，再结合本发明特定的液相条件，尤其是结合本发明特定的梯度洗脱程序，可以进一步提高mk4、mk7的检测特异性和检测灵敏度，有效排除各种样本基质中的干扰，从而适用于多种生物样本类型的检测。
附图说明
54.图1为vk1、mk4、mk7的液相质谱图；
55.图2为vk1、mk4、mk7的标准曲线图；
56.图3为采用不同粒径c18色谱柱检测的mk7色谱图；
57.图4为采用不同长度c18色谱柱检测的mk7色谱图；
58.图5为液相梯度初始有机相浓度低于88％时检测的色谱图；
59.图6为液相梯度初始有机相浓度高于92％时检测的色谱图；
60.图7为尿液样品中vk1和vk1-d7的色谱图；
61.图8为尿液样品中mk4和mk4-d7的色谱图；
62.图9为尿液样品中mk7和mk7-d7的色谱图。
具体实施方式
63.本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
64.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域
的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
65.本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
66.在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
67.本发明的发明人在研究中发现，mk7由于含有相对较长的类异戊二烯链，理化性质上和vk1、mk4相差较大，在质谱和色谱上的表现也存在多种限制，常见问题为mk7质谱参数难以获得、色谱分离程度不佳、响应较低、基线高、基质干扰严重。这可能也是目前国内外关于维生素k的研究主要集中在vk1上，而没有实现vk1、mk4和mk7同时检测的原因。为了解决以上技术难题，本发明的发明人进行了大量的研究和尝试，并通过试验反复论证，最终提供了一种能同时检测维生素k1、mk4和mk7的方法。具体技术方案如下：
68.一种同时检测维生素k1、mk4和mk7的方法，包括以下步骤：
69.取生物样品，加入三种待测物的同位素内标混合溶液，再加入提取溶剂提取，离心，取上清液干燥后用复溶液溶解，得到待测样品，采用液相色谱串联质谱法检测；
70.所述液相色谱串联质谱法所采用的色谱柱为c18色谱柱，所述c18色谱柱的粒径为1.6～2.2μm，所述c18色谱柱的长度为40～60mm。
71.进一步优选地，所述色谱柱的粒径为1.7μm，色谱柱的长度为50mm。
72.本发明的发明人在研究中发现，要实现生物样品中vk1、mk4和mk7同时检测并实现三者很好的分离，尤其是要实现mk7与vk1、mk4很好的分离，色谱柱的选择非常关键，尤其是色谱柱的粒径和长度对于mk7的色谱和质谱行为影响很大。本发明通过采用特定粒径1.6～2.2μm、特定长度40～60mm的c18色谱柱进行液相色谱串联质谱法检测，配合本发明的其他步骤，最终实现了一种能实现同时检测维生素k1、mk4和mk7的方法，并且还具有以下几方面优点：(1)特异性强，针对维生素k1、mk4和mk7都获得良好的色谱分离度(保留时间相差大于0.5min)，峰型好，无干扰峰；(2)响应度高，基线低，基质干扰少，方法的检测限低，灵敏度高，且稳定性强。(3)分析时间短，只需6min；(4)同时适用于多种样品类型，包括血清、血浆、脑脊液、尿液等。
73.优选地，所述液相色谱串联质谱法的流动相a为0.15～0.25wt％甲酸的水溶液，流动相b为0.15～0.25wt％甲酸的甲醇溶液，采用梯度洗脱；
74.所述梯度洗脱的程序包括：
75.0～0.5min，流动相b的体积百分比为88～92％；
76.0.5～1min，流动相b的体积百分比由88～92％升高到95～98％；
77.1～2min，流动相b的体积百分比由95～98％升高到99～100％；
78.2～4.5min，流动相b的体积百分比为99～100％；
79.4.5～5.6min，流动相b的体积百分比由99～100％降低到88～92％；
80.5.6～6min，流动相b的体积百分比为88～92％。
81.进一步优选地，所述梯度洗脱的程序包括：
82.0～0.5min，流动相b的体积百分比为90％；
83.0.5～1min，流动相b的体积百分比由90％升高到97％；
84.1～2min，流动相b的体积百分比由97％升高到100％；
85.2～4.5min，流动相b的体积百分比为100％；
86.4.5～5.6min，流动相b的体积百分比由100％降低到90％；
87.5.6～6min，流动相b的体积百分比为90％。
88.优选地，所述色谱柱的内径为1.8～2.4μm，优选为2.1μm。
89.在选择特定粒径1.6～2.2μm、特定长度40～60mm的c18色谱柱的基础上，再结合本发明特定的液相条件，尤其是结合本发明特定的梯度洗脱程序，可以进一步提高mk4、mk7的检测特异性和检测灵敏度，有效排除各种样本基质中的干扰，从而适用于多种生物样本类型的检测。
90.优选地，同位素内标混合溶液的溶剂为乙醇，可以沉淀生物样品中的蛋白，提取溶剂为正己烷，通过本发明的前处理操作，使得前处理后的样品基质干净，目标检测物提取效率高。
91.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
92.实施例一一种同时检测维生素k1、mk4和mk7的测定方法
93.vk1、mk4、mk7三种待检测物质的混合内标溶液的制备：以乙醇为溶剂，配制含有1.4ng/ml vk1-d7，1.2ng/ml mk4-d7和2.0ng/mlmk7-d7的混合内标溶液。
94.样品前处理：在200μl混合病人血清待测样品中加入400μl vk1、mk4、mk7三种待检测物质的混合内标溶液，使待测样品中的蛋白质沉淀，震荡5min，静置15分钟，加入正己烷提取，10000rpm离心10min获得上清液，氮气吹干，加入80μl复溶液甲醇溶解，得待测样品。
95.采用液相色谱串联质谱法检测待测样品，色谱条件为：
96.使用粒径1.7μm，内径2.1mm，长度50mm的beh c18色谱柱；
97.流动相：a相为含0.2wt％甲酸的水溶液，b相为含0.2wt％甲酸的甲醇溶液。进样量10μl；柱温为45℃；流速为0.5ml/min。
98.采用梯度洗脱，洗脱程序如表1所示：
99.表1
[0100][0101]
质谱条件为：apci源正离子模式，多重反应监测离子扫描模式(mrm)。质谱离子源参数设置如表2所示，质谱方法参数如表3所示。
[0102]
表2质谱离子源参数设置
[0103][0104]
表3质谱方法参数
[0105][0106][0107]
实施例一的效果通过对该方法进行验证来确认，具体验证参数和验证结果如下所示：
[0108]
本例采用含有vk1、mk4和mk7的混合标准品溶液进行试验。
[0109]
含有vk1、mk4和mk7的混合标准品溶液的配制：用天平准确称取5.0mg vk1、5.0mg mk4和5.0mg mk7标准品，分别溶解于50ml乙醇溶液中，配置成浓度为100.0ng/ml的vk1储备液，100.0ng/ml的mk4储备液，100.0ng/ml的mk7储备液。分别取以上三种储备液各50μl，于1.0mlep管中混合，加入950μl乙醇震荡混匀，配置成vk1、mk4和mk7混合标准品溶液(浓度均为5ng/ml)，采用实施例一的检测方法进行定量检测。
[0110]
图1为vk1、mk4、mk7及其同位素内标的液相质谱图；其中，横坐标为出峰时间，单位为min，纵坐标为响应强度，单位为cps。图1的结果显示，vk1、mk4、mk7及其同位素内标的色谱峰型平滑，分离度较好；同时mk4和mk7响应响度较高，基线低，说明本例的液相色谱串联质谱法，能够同时检测vk1、mk4、mk7。
[0111]
线性范围验证
[0112]
本例以4％bsa基质为曲线基质，配制了vk1、mk4、mk7系列梯度浓度的标准品，通过实施例一的检测方法进行检测验证。
[0113]
检测结果如表4所示，以浓度为横坐标，检测物与对应内标的峰面积的比值(area ratio)为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图2所示。
[0114]
表4 vk1、mk4、mk7标准品线性范围实验数据
[0115]
[0116][0117]
表4的结果显示，vk1、mk4、mk7标准曲线的相关系数r2均≥0.99，说明本发明用液相色谱串联质谱法测定vk1、mk4、mk7，在对应浓度范围内都呈现良好的线性。
[0118]
定量限与检测限验证
[0119]
基于配置的标准曲线低点进行梯度稀释，以rsd小于20％，回收率在85％～115％范围内，且信噪比大于10的最低浓度点视为本发明方法的定量限浓度(loq)；以信噪比接近
并大于3时所对应的标准品浓度值，确定为本发明方法的检出限(lod)，结果具体如表5和表6所示，结果显示，本发明方法vk1、mk4、mk7的定量限分别为0.0132ng/ml、0.0200ng/ml、0.0199ng/ml。本发明方法vk1、mk4、mk7的检测限分别为0.0102ng/ml、0.0125ng/ml、0.0124ng/ml。定量限和检出限均足以满足临床样本检测需求。
[0120]
表5 vk1、mk4、mk7方法定量限检测数据
[0121]
[0122][0123]
表6 vk1、mk4、mk7方法检测限检测数据
[0124][0125]
精密度验证
[0126]
基于配置的标准曲线方程，采用本实施例的检测方法，收集血清样品，混合均匀，采用vk1、mk4和mk7的标准品溶液加标，得到低、中、高三个浓度水平的样品进行精密度实验，评估检测方法的稳定性。每个浓度水平的样品每批次平行处理2个，每个进样1次，连续测定10天。检测结果如表7所示，本例同时检测血清样品中的vk1、mk4和mk7，批间不精密度均小于6％，说明方法稳定性好。
[0127]
表7 vk1、mk4、mk7的批间不精密度检测结果
[0128][0129][0130]
实施例二
[0131]
由于mk7含有相对较长的类异戊二烯链，理化性质和vk1、mk4相差较大，在质谱和
色谱上的表现也存在多种限制，常见问题为mk7质谱参数难以获得、色谱分离程度不佳、响应较低、基线高、基质干扰严重等。本发明的发明人在研究中意外发现，在用c18柱检测mk7时，液相色谱柱的粒径和长度对于mk7色谱峰的峰型具有很大的影响。本例具体分析比较了不同粒径c18柱(1.7μm、2.5μm、2.7μm)和不同长度c18柱(50mm、100mm)对mk7质谱和色谱分离检测结果的影响(检测样品为混合血清样品，其他具体条件参考实施例一)，分析结果如图3和图4所示。
[0132]
由图3可知，色谱柱粒径大小影响mk7的质谱和色谱行为。色谱柱粒径为2.7μm和2.5μm时，mk7色谱峰很宽，从而与基质存在的干扰峰的分离困难，并且基线高。而选用实施例1中的1.7μm粒径的c18色谱柱，色谱峰窄且峰型好，基线低，与其他干扰峰能很好的分离，最终mk7可获得更好的色谱分离效果和质谱响应强度。
[0133]
由图4可知，色谱柱长度会明显地影响mk7的质谱和色谱行为。色谱柱长度为100mm时，mk7很难与干扰物质取得分离，且质谱响应相对更低，分析时间更长，检测效率低。而色谱柱为50mm时，mk7峰型好，更容易与干扰物质分离，且质谱响应高，基线低，最终mk7可获得更好的色谱分离效果和质谱响应强度。
[0134]
实施例三
[0135]
本发明检测方法中的液相洗脱有机相初始浓度和洗脱梯度程序影响vk1、mk4、mk7的色谱行为。本例采用实施例一配制的vk1、mk4和mk7混合标准品溶液进行试验。当液相梯度初始有机相浓度低于88％时，发现mk4出峰时间延迟，难以和干扰物质有效分离，且响应强度降低。如图5所示，分析比较85％和90％的液相梯度初始有机相浓度对mk4出峰的影响，85％初始有机相条件下，mk4出峰时间延迟约0.45min，响应强度相对降低约45％，目标物难以和基质中的干扰物进行有效分离，且目标通道基线也较高。
[0136]
当液相梯度初始有机相浓度高于92％时，有效洗脱增强，发现mk7出峰时间提前，但和干扰物的有效分离降低，且基线也相应提高，图6所示，分析比较90％和95％的液相梯度初始有机相浓度对mk7出峰的影响，95％初始有机相条件下，mk7出峰时间相对提前约0.4min，但和同通道内干扰物质无法进行较好的分离，基线也相应提高。
[0137]
综合考虑vk1、mk4和mk7的色谱分离效果和质谱响应强度，液相梯度的最优方案为：初始有机相比例为90％，保持时间0.5min；0.5～1min，有机相的体积百分比由90％升高到97％；1～2min，有机相的体积百分比由97％升高到100％；2～4.5min，有机相的体积百分比为100％；4.5～5.6min，有机相的体积百分比由100％降低到90％；5.6～6min，保持有机相的体积百分比为90％进行平衡。
[0138]
实施例四
[0139]
本例对另一种样本类型——尿液样品类型中的vk1、mk4和mk7进行了提取和检测验证。具体的，取待检24小时尿液200μl，采用实施例一中的前处理、液相和质谱检测方法，尿液样品类型中vk1和vk1-d7、mk4和mk4-d7、mk7和mk7-d7的色谱图如图7、8和9所示。
[0140]
检测结果显示，本例同时检测vk1、mk4、mk7的方法，能够有效地检测出尿液样品中的vk1、mk4、mk7，通过内标沉淀剂沉淀蛋白，正己烷液液萃取的前处理操作，样品基质干净，目标检测物提取效率高，再经过优化改进的流动相成分和比例，使得vk1、mk4、mk7在色谱行为上具有良好的分离度和峰型，无干扰峰，且质谱响应高，特别是mk7，从而准确有效的同时检出多种样品类型中的vk1、mk4和mk7。
[0141]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0142]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。