TIGIT和PD-1/TIGIT-结合分子的制作方法

tigit和pd-1/tigit-结合分子
1.本发明处于医药领域中。具体地，本发明涉及拮抗人tigit或拮抗人tigit和人pd-1两者的新型多肽分子、包含此类多肽分子的组合物、和单独或与化学疗法和其他癌症治疗剂组合使用此类多肽分子治疗实体肿瘤的方法。
2.免疫检查点是在免疫细胞(例如，t细胞&树突细胞)上表达的一组膜蛋白，包括多个共抑制和共刺激受体，其在调节适应性免疫应答中发挥重要作用。检查点包括人程序性细胞死亡配体(pd-1) (ncbi np_005009.2)和具有ig和itim结构域的人t细胞免疫受体(tigit) (ncbi np_776160.2)。
3.pd-1及其配体(程序性细胞死亡配体1 (pd-l1)和程序性细胞死亡配体2 (pd-l2))之间的相互作用提供了抑制信号，其已被显示在肿瘤免疫逃逸和在肿瘤微环境中发生的免疫抑制中发挥关键作用。尽管抗pd-1抗体和/或抗pd-l1抗体对pd-1抑制性信号传导的阻断被临床验证，并且已经导致某些癌症的治疗的重大的临床进展，但有许多患者或者对pd-1或pd-l1抗体治疗不应答、复发、获得对其的抗性，或者以其他方式对治疗不耐受。
4.像pd-1一样，tigit是在活化和耗尽的t细胞上表达的共抑制受体。tigit结合肿瘤细胞上的脊髓灰质炎病毒受体(pvr，也称为cd155)，且使得能够反向信号传导至肿瘤细胞，其导致t细胞阻抑性细胞因子的分泌。尽管cd155被认为是tigit的主要配体，但tigit也可与cd112和cd113相互作用(blake等人，clin cancer res; 2016; 22(21): 5182-5188)。已研究tigit作为抑制性免疫检查点受体的作用。tigit是cd226/tigit途径的一部分，其中tigit不仅与cd226 (一种共刺激免疫受体)竞争结合cd155，而且与细胞膜中的cd226直接相互作用，并阻断cd226同二聚化。(blake等人, s, clin cancer res; 2016; 22(21): 5182-5188；johnston等人, cancer cell 2014; 26: 923
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937；mahnke等人, journal of investigative dermatology 2016; 136: 9-11)。
5.抗-tigit抗体是本领域已知的，包括公开于us 2016/0355589、us 2017/143825、us 2017/088613、us 2016/376365、us 2018/169238、us 2016/176963和us 2019/100591中的那些。然而，尚无抗-人tigit抗体获得监管批准以单独或与抗-人pd-l1或抗-人pd-1抗体组合用于在人中的治疗用途。此外，尚无靶向tigit和pd-1或tigit和pd-l1的双特异性抗体获得监管批准用于在人中的治疗用途。因此，存在对靶向免疫检查点途径的额外治疗的需求。
6.因此，本发明涉及新型抗-人tigit抗体和新型抗-人tigit/抗-人pd-1双特异性抗体。此外，与其他抗-人tigit抗体不同，本发明的抗体的效应物功能是无效的，即，经工程改造（engineered）以使fc受体结合最小化。因此，与其他抗-人tigit抗体不同，本发明的抗体不含可促进t调控细胞耗竭和免疫应答不良事件的天然人igg1构架。此外，本发明的抗-人tigit/抗-人pd-1双特异性抗体含有不同类型的轻链，其中抗-人tigit臂轻链是κ轻链且抗-人pd-1轻链是λ轻链，其通过降低轻链-轻链二聚化的潜能来促进异单抗(heteromab)双特异性抗体形成。
7.双特异性分子的制备通常已知是不可预测的努力。例如，共表达两条重链和两条轻链以产生igg双特异性抗体可导致一些错误装配和不想要的副产物、抗体fab内的异源二
聚体相互作用（ameheterodimeric interaction）(lewis sm等人, nature biotechnology 2014; 32: 191-202；leaver-fay a, 等人, structure 2016; 24: 641-651)。因此，本发明提供了抗-人tigit/抗-人pd-1双特异性分子，其使fc受体结合最小化、使氧化最小化、促进异单抗装配且与人tigit/pd-1和食蟹猴tigit/pd-1交叉反应，并在确立的肿瘤模型中表现出体内效力。
8.令人惊讶地，当与抗-人pd-1和抗-人tigit抗体组合疗法比较时，本发明的抗-人tigit/抗-人pd-1双特异性抗体表现出显著的体内抗-肿瘤效力。更令人惊讶地，用本发明的双特异性抗体治疗导致cd226 cd8 t细胞和cd226 nk细胞二者的百分比增加，这可有助于观察到的显著体内效力。
9.本发明还提供了结合人tigit (seq id no:31)或人tigit胞外结构域(例如seq id no:32)的多肽分子，其包含seq id no:1-6的重和轻互补决定区(cdr)氨基酸序列(参见表1)。在一个实施方案中，所述多肽进一步包含seq id no:7-12的cdr氨基酸序列，其中所述多肽分子还结合人pd-1 (seq id no:29)或pd-1胞外结构域(例如seq id no:30)。
10.在一个实施方案中，所述多肽分子是scfv分子。在另一个实施方案中，所述多肽分子是多特异性scfv分子。在另一个实施方案中，所述多特异性scfv分子是双特异性scfv分子。
11.在一个实施方案中，所述多肽分子是抗体或其人tigit-结合片段，包含分别具有seq id no:1-3的氨基酸序列的三个hcdr和分别具有seq id no:4-6的氨基酸序列的三个lcdr。在另一个实施方案中，所述多肽分子是抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是单特异性抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是多特异性抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是还结合人pd-1的双特异性抗体。
12.在另一个实施方案中，所述多肽分子是抗体或其人tigit-结合片段，其包含具有seq id no:13的氨基酸序列的重链可变区和具有seq id no:14的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个实施方案中，所述多肽分子是包含具有seq id no:21的氨基酸序列的重链和具有seq id no:22的氨基酸序列的轻链的抗体。
13.在另一个实施方案中，所述抗体或其人tigit-结合片段还结合人pd-1 (seq id no:31)或人tigit胞外结构域(例如seq id no:32)和人pd-1 (seq id no:29)或人pd-1胞外结构域(例如seq idno: 30)，且进一步包含分别具有seq id no:7-9的氨基酸序列的三个hcdr和分别具有seq id no:10-12的氨基酸序列的三个lcdr。
14.在另一个实施方案中，所述多肽分子是抗体或其人tigit和人pd-1结合片段，包含：具有seq id no:13的氨基酸序列的第一重链可变区；具有seq id no:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；具有seq id no:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和具有seq id no:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
15.在另一个实施方案中，所述多肽分子是包含以下的抗体：具有seq id no:21的氨基酸序列的第一重链；具有seq id no:22的氨基酸序列的第一轻链；具有seq id no:23的氨基酸序列的第二重链；和具有seq id no:24的氨基酸序列的第二轻链。
16.本发明还提供了能够表达本发明的多肽分子的哺乳动物细胞。
17.本发明还提供了dna分子，其包含编码seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23和seq id no:24的氨基酸序列中的一种或多种的多核苷酸。本发明还提供了权利要求17
no:32)的抗体，包含：a)重链，其包含具有seq id no:1的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:2的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr3；和b)轻链，其包含具有seq id no:4的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:5的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr3。
26.本发明还提供了抗体，其包含：a)具有seq id no:13的氨基酸序列的重链可变区；和b)具有seq id no:14的氨基酸序列的轻链可变区。
27.本发明还提供了抗体，其包含：a)具有seq id no:21的氨基酸序列的重链；和b)具有seq id no:22的氨基酸序列的轻链。
28.在一个实施方案中，所述抗体的重链与所述抗体的轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的两条重链形成至少一个二硫键。
29.在另一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与fcγ受体的结合的人igg1。
30.本发明还提供了dna分子，其包含编码至少一种具有seq id no:21的氨基酸序列和seq id no:22的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一个优选实施方案中，所述dna分子包括包含seq id no:25和seq id no:26中的至少一个的多核苷酸。
31.本发明还提供了包含dna分子的哺乳动物细胞，所述dna分子包含编码至少一种具有seq id no:21的氨基酸序列和seq id no:22的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
32.本发明还提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：a)重链，其包含具有seq id no:1的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:2的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr3；和b)轻链，其包含具有seq id no:4的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:5的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr3。
33.在一个实施方案中，所述抗体的重链与所述抗体的轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的两条重链形成至少一个二硫键。
34.本发明还提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：a)具有seq id no:13的氨基酸序列的重链可变区；和b)具有seq id no:14的氨基酸序列的轻链可变区。
35.本发明还提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：a)具有seq id no:21的氨基酸序列的重链；和b)具有seq id no:22的氨基酸序列的轻链。
36.本发明还提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体；其中所述抗体是经工程改造以减少所述抗体与fcγ受体的结合的人igg1。
37.本发明还提供了通过如下方法产生的抗体，所述方法包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：a)重链，其包含具有seq id no:1的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:2的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr3；和b)轻链，其包含具有seq id no:4的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:5的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr3。
38.在一个实施方案中，所述抗体的重链与所述抗体的轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的两条重链形成至少一个二硫键。
39.本发明还提供了通过如下方法产生的抗体，所述方法包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：a)具有seq id no:13的氨基酸序列的重链可变区；b)具有seq id no:14的氨基酸序列的轻链可变区。
40.本发明还提供了通过如下方法产生的抗体，所述方法包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：a)具有seq id no:21的氨基酸序列的重链；b)具有seq id no:22的氨基酸序列的轻链。
41.本发明还提供了药物组合物，其包含抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中所述抗体结合人tigit (seq id no:31)或tigit胞外结构域(例如seq id no:32)，所述抗体包含：a)重链，其包含具有seq id no:1的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:2的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr3；和b)轻链，其包含具有seq id no:4的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:5的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr3。
42.在一个实施方案中，所述抗体的重链与所述抗体的轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的两条重链形成至少一个二硫键。
43.本发明还提供了药物组合物，其包含抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗体包含：a)具有seq id no:13的氨基酸序列的重链可变区；b)具有seq id no:14的氨基酸序列的轻链可变区。
44.本发明还提供了药物组合物，其包含抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗体包含：a)具有seq id no:21的氨基酸序列的重链；b)具有seq id no:22的氨基酸序列的轻链。
45.在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与fcγ受体的结合的人igg1。
46.本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的抗体，其中所述抗体结合人tigit (seq id no:31)或tigit胞外结构域(例如seq id no:32)，所述抗体包含：a)重链，其包含具有seq id no:1的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:2的氨基
酸序列的hcdr2和具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr3；和b)轻链，其包含具有seq id no:4的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:5的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr3。
47.在一个实施方案中，所述抗体的重链与所述抗体的轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的两条重链形成至少一个二硫键。
48.本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的抗体，所述抗体包含：a)具有seq id no:13的氨基酸序列的重链可变区；和b)具有seq id no:14的氨基酸序列的轻链可变区。
49.本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的抗体，所述抗体包含：a)具有seq id no:21的氨基酸序列的重链；b)具有seq id no:22的氨基酸序列的轻链。
50.在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与fcγ受体的结合的人igg1。
51.本发明还提供了治疗方法和使用方法。
52.本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。
53.本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述癌症是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述癌症是三阴性乳腺癌。
54.本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述抗体与电离辐射组合施用。
55.本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述抗体与一种或多种化学治疗剂组合施用。
56.本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述抗体与电离辐射和一种或多种化学治疗剂组合施用。
57.在一个实施方案中，本发明还提供了治疗癌症的方法，包括与一种或多种抗-肿瘤剂同时、分开或依次组合施用有效量的本文公开的双特异性抗体。抗-肿瘤剂的非限制性实例包括雷莫芦单抗(ramucirumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、奥拉妥单抗(olaratumab)、吉西他滨(gemcitabine)、培美曲塞(pemetrexed)、galunisertib、阿贝西利(abemaciclib)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、达卡巴嗪(dacarbazine)、脂质体多柔比星(liposomal doxorubicin)、多西他赛(docetaxel)、环磷酰胺(cyclophosphamide)和多柔比星(doxorubicin)、诺维本(navelbine)、艾瑞布林(eribulin)、紫杉醇(paclitaxel)、用于可注射混悬液的紫杉醇蛋白-结合的颗粒、伊沙匹隆(ixabepilone)、卡培他滨(capecitabine)、folfox (甲酰四氢叶酸(leucovorin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)和奥沙利铂(oxaliplatin))、folfiri (甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和伊
立替康(irinotecan))、西妥昔单抗(cetuximab)、egfr抑制剂、raf抑制剂、b-raf抑制剂、cdk4/6抑制剂、cdk7抑制剂、吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂、tgfβ抑制剂、tgfβ受体抑制剂、il-10和聚乙二醇化il-10 (例如pegilodecakin)。
58.本发明还提供了用于治疗癌症的抗体，其中所述抗体结合人tigit (seq id no:31)或tigit胞外结构域(例如seq id no:32)，所述抗体包含：a)重链，其包含具有seq id no:1的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:2的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr3；和b)轻链，其包含具有seq id no:4的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:5的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr3。
59.在一个实施方案中，所述抗体的重链与所述抗体的轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的两条重链形成至少一个二硫键。
60.本发明还提供了用于治疗癌症的抗体，所述抗体包含：a)具有seq id no:13的氨基酸序列的重链可变区；和b)具有seq id no:14的氨基酸序列的轻链可变区。
61.本发明还提供了用于治疗癌症的抗体，所述抗体包含：a)具有seq id no:21的氨基酸序列的重链；和b)具有seq id no:22的氨基酸序列的轻链。
62.在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与fcγ受体的结合的人igg1。
63.本发明还提供了用于治疗癌症的抗体，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。本发明进一步提供了用于治疗肺癌的抗体，其中所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。本发明还提供了用于治疗乳腺癌的抗体，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
64.在一个实施方案中，所述抗体与电离辐射同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述抗体与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述抗体与电离辐射和一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
65.本发明还提供了药物组合物，其包含用于治疗癌症的抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中所述抗体结合人tigit (seq id no:31)或tigit胞外结构域(例如seq id no:32)，所述抗体包含：a)重链，其包含具有seq id no:1的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:2的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr3；和b)轻链，其包含具有seq id no:4的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:5的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr3。
66.在一个实施方案中，所述抗体的重链与所述抗体的轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的两条重链形成至少一个二硫键。
67.本发明还提供了药物组合物，其包含用于治疗癌症的抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗体包含：a)具有seq id no:13的氨基酸序列的重链可变区；和b)具有seq id no:14的氨基酸序列的轻链可变区。
68.本发明还提供了药物组合物，其包含用于治疗癌症的抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗体包含：a)具有seq id no:21的氨基酸序列的重链；和b)具有seq id no:22的氨基酸序列的轻链。
69.在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与fcγ受体的结合的人igg1。
70.本发明还提供了包含用于治疗癌症的抗体的药物组合物，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。本发明进一步提供了包含用于治疗肺癌的抗体的药物组合物，其中所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。本发明进一步提供了包含用于治疗乳腺癌的抗体的药物组合物，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
71.在一个实施方案中，所述组合物与电离辐射同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述药物组合物与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述药物组合物与电离辐射和一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
72.本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述抗体结合人tigit (seq id no:31)或tigit胞外结构域(例如seq id no:32)，所述抗体包含：a)重链，其包含具有seq id no:1的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:2的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr3；和b)轻链，其包含具有seq id no:4的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:5的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr3。
73.在一个实施方案中，所述抗体的重链与所述抗体的轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的两条重链形成至少一个二硫键。
74.本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述抗体包含：a)具有seq id no:13的氨基酸序列的重链可变区；和b)具有seq id no:14的氨基酸序列的轻链可变区。
75.本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述抗体包含：a)具有seq id no:21的氨基酸序列的重链；和b)具有seq id no:22的氨基酸序列的轻链。
76.在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与fcγ受体的结合的人igg1。
77.本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。本发明进一步提供了本发明的抗体在制备用于治疗肺癌的药物中的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。本发明进一步提供了本发明的抗体在制备用于治疗乳腺癌的药物中的用途，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
78.在一个实施方案中，所述抗体与电离辐射同时、分开或依次组合施用。在另一个实
施方案中，所述抗体与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述抗体与电离辐射和一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
79.在是指如本文所述的治疗方法的实施方案中，此类实施方案也是用于该治疗中或可替代地用于制备用于该治疗中的药物的进一步实施方案。
80.有用的化学治疗剂的非限制性实例包括5-氟尿嘧啶、羟基脲、吉西他滨、培美曲塞、甲氨蝶呤、多柔比星、依托泊苷、卡铂、顺铂、环磷酰胺、美法仑、达卡巴嗪、紫杉醇(taxol)、喜树碱、folfiri、folfox、多西他赛、道诺霉素、紫杉醇(paclitaxel)、奥沙利铂及其组合。
81.本发明的抗体或包含其的药物组合物可通过肠胃外途径施用，其非限制性实例是静脉内施用。可以单独地将本发明的抗体与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂以单一或多个剂量施用于人患者。本发明的药物组合物可以通过本领域已知的方法制备(例如, remington: the science and practice of pharmacy, 第22版 (2012), a. loyd等人, pharmaceutical press)。
82.在一个实施方案中，本发明的多肽分子是无菌的。在另一个实施方案中，本发明的多肽分子是实质上纯的。在另一个实施方案中，本发明的多肽分子是实质上纯的且无菌的。
83.本发明的双特异性抗体是异二聚体，其中部分由于两条不同重链和两条不同轻链，抗体的每一臂表现出与其同源抗原的选择性单价结合。在本发明中，所述双特异性抗体的一个臂结合人pd-1 (seq id no:29)或人pd-1胞外结构域(ecd) (例如，ecd-his表达产物(seq id no:30))，而另一臂结合人tigit (seq id no:31)或tigit ecd (例如，ecd-his表达产物(seq id no:32))。在一个优选实施方案中，所述抗体的一个臂拮抗人pd-1 (seq id no:29)，且另一臂拮抗人tigit (seq id no:31)。
84.本发明还提供了抗体，其结合人pd-1 (seq id no:29)或pd-1胞外结构域(例如seq id no:30)，且结合人tigit (seq id no:31)或tigit胞外结构域(例如seq id no:32)，所述抗体包含：a)第一重链，其包含具有seq id no:1的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:2的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr3；b)第一轻链，其包含具有seq id no:4的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:5的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr3；c)第二重链，其包含具有seq id no:7的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:8的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:9的氨基酸序列的hcdr3；和d)第二轻链，其包含具有seq id no:10的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:11的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:12的氨基酸序列的lcdr3。
85.本发明还提供了抗体，其包含：a)具有seq id no:13的氨基酸序列的第一重链可变区；b)具有seq id no:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；c)具有seq id no:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和d)具有seq id no:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
86.本发明还提供了抗体，其包含：a)具有seq id no:21的氨基酸序列的第一重链；
b)具有seq id no:22的氨基酸序列的第一轻链；c)具有seq id no:23的氨基酸序列的第二重链；和d)具有seq id no:24的氨基酸序列的第二轻链。
87.本发明还提供了抗体(本文中称为抗体a)，其具有：a)具有seq id no:21的氨基酸序列的第一重链；b)具有seq id no:22的氨基酸序列的第一轻链；c)具有seq id no:23的氨基酸序列的第二重链；和d)具有seq id no:24的氨基酸序列的第二轻链。
88.在一个实施方案中，所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
89.在另一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与fcγ受体的结合的人igg1。
90.本发明还提供了dna分子，其包含编码至少一种具有seq id no:21的氨基酸序列、seq id no:22的氨基酸序列、seq id no:23的氨基酸序列和seq id no:24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一个优选实施方案中，所述dna分子包含多核苷酸，其包含seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27和seq id no:28中的至少一种。
91.本发明还提供了包含dna分子的哺乳动物细胞，所述dna分子包含编码至少一种具有seq id no:21的氨基酸序列、seq id no:22的氨基酸序列、seq id no:23的氨基酸序列和seq id no:24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
92.本发明还提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：a)第一重链，其包含具有seq id no:1的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:2的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr3；b)第一轻链，其包含具有seq id no:4的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:5的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr3；c)第二重链，其包含具有seq id no:7的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:8的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:9的氨基酸序列的hcdr3；和d)第二轻链，其包含具有seq id no:10的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:11的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:12的氨基酸序列的lcdr3。
93.在一个实施方案中，所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
94.本发明还提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：a)具有seq id no:13的氨基酸序列的第一重链可变区；b)具有seq id no:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；c)具有seq id no:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和d)具有seq id no:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
95.本发明还提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：a)具有seq id no:21的氨基酸序列的第一重链；b)具有seq id no:22的氨基酸序列的第一轻链；c)具有seq id no:23的氨基酸序列的第二重链；和d)具有seq id no:24的氨基酸序列的第二轻链。
96.本发明还提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体；其中所述抗体是经工程改造以减少所述抗体与fcγ受体的结合的人igg1。
97.本发明还提供了通过如下方法产生的抗体，所述方法包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：a)第一重链，其包含具有seq id no:1的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:2的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr3；b)第一轻链，其包含具有seq id no:4的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:5的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr3；c)第二重链，其包含具有seq id no:7的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:8的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:9的氨基酸序列的hcdr3；和d)第二轻链，其包含具有seq id no:10的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:11的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:12的氨基酸序列的lcdr3。
98.在一个实施方案中，所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
99.本发明还提供了通过如下方法产生的抗体，所述方法包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：a)具有seq id no:13的氨基酸序列的第一重链可变区；b)具有seq id no:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；c)具有seq id no:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和d)具有seq id no:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
100.本发明还提供了通过如下方法产生的抗体，所述方法包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：a)具有seq id no:21的氨基酸序列的第一重链；b)具有seq id no:22的氨基酸序列的第一轻链；c)具有seq id no:23的氨基酸序列的第二重链；和d)具有seq id no:24的氨基酸序列的第二轻链。
101.本发明还提供了药物组合物，其包含抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中所述抗体结合人pd-1 (seq id no:29)或人pd-1胞外结构域(例如seq id no:30)，且结合人tigit (seq id no:31)或人tigit胞外结构域(例如seq id no:32)，所述抗体包含：a)第一重链，其包含具有seq id no:1的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:2的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr3；
b)第一轻链，其包含具有seq id no:4的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:5的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr3；c)第二重链，其包含具有seq id no:7的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:8的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:9的氨基酸序列的hcdr3；和d)第二轻链，其包含具有seq id no:10的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:11的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:12的氨基酸序列的lcdr3。
102.在一个实施方案中，所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
103.本发明还提供了药物组合物，其包含抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗体包含：a)具有seq id no:13的氨基酸序列的第一重链可变区；b)具有seq id no:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；c)具有seq id no:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和d)具有seq id no:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
104.本发明还提供了药物组合物，其包含抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗体包含：a)具有seq id no:21的氨基酸序列的第一重链；b)具有seq id no:22的氨基酸序列的第一轻链；c)具有seq id no:23的氨基酸序列的第二重链；和d)具有seq id no:24的氨基酸序列的第二轻链。
105.在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与fcγ受体的结合的人igg1。
106.本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的抗体，其中所述抗体结合人pd-1 (seq id no:29)或人pd-1胞外结构域(例如seq id no:30)，且结合人tigit (seq id no:31)或人tigit胞外结构域(例如seq id no:32)，所述抗体包含：a)第一重链，其包含具有seq id no:1的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:2的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr3；b)第一轻链，其包含具有seq id no:4的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:5的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr3；c)第二重链，其包含具有seq id no:7的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:8的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:9的氨基酸序列的hcdr3；和d)第二轻链，其包含具有seq id no:10的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:11的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:12的氨基酸序列的lcdr3。
107.在一个实施方案中，所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
108.本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的抗
体，所述抗体包含：a)具有seq id no:13的氨基酸序列的第一重链可变区；b)具有seq id no:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；c)具有seq id no:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和d)具有seq id no:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
109.本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的抗体，所述抗体包含：a)具有seq id no:21的氨基酸序列的第一重链；b)具有seq id no:22的氨基酸序列的第一轻链；c)具有seq id no:23的氨基酸序列的第二重链；和d)具有seq id no:24的氨基酸序列的第二轻链。
110.本发明还提供了治疗方法和使用方法。
111.在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与fcγ受体的结合的人igg1。
112.本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。
113.本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述癌症是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述癌症是三阴性乳腺癌。
114.本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述抗体与电离辐射组合施用。
115.本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述抗体与一种或多种化学治疗剂组合施用。
116.本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述抗体与电离辐射和一种或多种化学治疗剂组合施用。
117.在一个实施方案中，本发明还提供了治疗癌症的方法，包括与一种或多种抗-肿瘤剂同时、分开或依次组合施用有效量的本文公开的双特异性抗体。抗-肿瘤剂的非限制性实例包括雷莫芦单抗(ramucirumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、奥拉妥单抗(olaratumab)、吉西他滨(gemcitabine)、培美曲塞(pemetrexed)、galunisertib、阿贝西利(abemaciclib)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、达卡巴嗪(dacarbazine)、脂质体多柔比星(liposomal doxorubicin)、多西他赛(docetaxel)、环磷酰胺(cyclophosphamide)和多柔比星(doxorubicin)、诺维本(navelbine)、艾瑞布林(eribulin)、紫杉醇(paclitaxel)、用于可注射混悬液的紫杉醇蛋白结合的颗粒、伊沙匹隆(ixabepilone)、卡培他滨(capecitabine)、folfox (甲酰四氢叶酸(leucovorin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)和奥沙利铂(oxaliplatin))、folfiri (甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康(irinotecan))、西妥昔单抗(cetuximab)、egfr抑制剂、raf抑制剂、b-raf抑制剂、cdk4/6抑制剂、cdk7抑制剂、吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂、tgfβ抑制剂、tgfβ受体抑制剂、
il-10和聚乙二醇化il-10 (例如pegilodecakin)。
118.本发明还提供了用于治疗癌症的抗体，其中所述抗体结合人pd-1 (seq id no:29)或人pd-1胞外结构域(例如seq id no:30)，且结合人tigit (seq id no:31)或人tigit胞外结构域(例如seq id no:32)，所述抗体包含：a)第一重链，其包含具有seq id no:1的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:2的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr3；b)第一轻链，其包含具有seq id no:4的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:5的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr3；c)第二重链，其包含具有seq id no:7的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:8的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:9的氨基酸序列的hcdr3；和d)第二轻链，其包含具有seq id no:10的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:11的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:12的氨基酸序列的lcdr3。
119.在一个实施方案中，所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
120.本发明还提供了用于治疗癌症的抗体，所述抗体包含：a)具有seq id no:13的氨基酸序列的第一重链可变区；b)具有seq id no:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；c)具有seq id no:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和d)具有seq id no:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
121.本发明还提供了用于治疗癌症的抗体，所述抗体包含：a)具有seq id no:21的氨基酸序列的第一重链；b)具有seq id no:22的氨基酸序列的第一轻链；c)具有seq id no:23的氨基酸序列的第二重链；和d)具有seq id no:24的氨基酸序列的第二轻链。
122.在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与fcγ受体的结合的人igg1。
123.本发明还提供了用于治疗癌症的抗体，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。本发明进一步提供了用于治疗肺癌的抗体，其中所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。本发明还提供了用于治疗乳腺癌的抗体，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
124.在一个实施方案中，所述抗体与电离辐射同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述抗体与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述抗体与电离辐射和一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
125.本发明还提供了药物组合物，其包含用于治疗癌症的抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中所述抗体结合人pd-1 (seq id no:29)或人pd-1胞外结构域(例如seq id no:30)，且结合人tigit (seq id no:31)或人tigit胞外结构域(例如seq id no:32)，所述抗体包含：a)第一重链，其包含具有seq id no:1的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:2的
氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr3；b)第一轻链，其包含具有seq id no:4的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:5的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr3；c)第二重链，其包含具有seq id no:7的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:8的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:9的氨基酸序列的hcdr3；和d)第二轻链，其包含具有seq id no:10的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:11的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:12的氨基酸序列的lcdr3。
126.在一个实施方案中，所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
127.本发明还提供了药物组合物，其包含用于治疗癌症的抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗体包含：a)具有seq id no:13的氨基酸序列的第一重链可变区；b)具有seq id no:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；c)具有seq id no:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和d)具有seq id no:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
128.本发明还提供了药物组合物，其包含用于治疗癌症的抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗体包含：a)具有seq id no:21的氨基酸序列的第一重链；b)具有seq id no:22的氨基酸序列的第一轻链；c)具有seq id no:23的氨基酸序列的第二重链；和d)具有seq id no:24的氨基酸序列的第二轻链。
129.在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与fcγ受体的结合的人igg1。
130.本发明还提供了包含用于治疗癌症的抗体的药物组合物，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。本发明进一步提供了包含用于治疗肺癌的抗体的药物组合物，其中所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。本发明进一步提供了包含用于治疗乳腺癌的抗体的药物组合物，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
131.在一个实施方案中，所述组合物与电离辐射同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述药物组合物与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述药物组合物与电离辐射和一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
132.本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述抗体结合人pd-1 (seq id no:29)或人pd-1胞外结构域(例如seq id no:30)，且结合人tigit (seq id no:31)或人tigit胞外结构域(例如seq id no:32)，所述抗体包含：a)第一重链，其包含具有seq id no:1的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:2的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr3；b)第一轻链，其包含具有seq id no:4的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:5的
氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr3；c)第二重链，其包含具有seq id no:7的氨基酸序列的hcdr1、具有seq id no:8的氨基酸序列的hcdr2和具有seq id no:9的氨基酸序列的hcdr3；和d)第二轻链，其包含具有seq id no:10的氨基酸序列的lcdr1、具有seq id no:11的氨基酸序列的lcdr2和具有seq id no:12的氨基酸序列的lcdr3。
133.在一个实施方案中，所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
134.本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述抗体包含：a)具有seq id no:13的氨基酸序列的第一重链可变区；b)具有seq id no:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；c)具有seq id no:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和d)具有seq id no:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
135.本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述抗体包含：a)具有seq id no:21的氨基酸序列的第一重链；b)具有seq id no:22的氨基酸序列的第一轻链；c)具有seq id no:23的氨基酸序列的第二重链；和d)具有seq id no:24的氨基酸序列的第二轻链。
136.在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与fcγ受体的结合的人igg1。
137.本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。本发明进一步提供了本发明的抗体在制备用于治疗肺癌的药物中的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。本发明进一步提供了本发明的抗体在制备用于治疗乳腺癌的药物中的用途，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
138.在一个实施方案中，所述抗体与电离辐射同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述抗体与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述抗体与电离辐射和一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
139.在是指如本文所述的治疗方法的实施方案中，此类实施方案也是用于该治疗中或可替代地用于制备用于该治疗中的药物的进一步实施方案。
140.有用的化学治疗剂的非限制性实例包括5-氟尿嘧啶、羟基脲、吉西他滨、培美曲塞、甲氨蝶呤、多柔比星、依托泊苷、卡铂、顺铂、环磷酰胺、美法仑、达卡巴嗪、紫杉醇（taxol）、喜树碱、folfiri、folfox、多西他赛、道诺霉素、紫杉醇（paclitaxel）、奥沙利铂及其组合。
141.本发明的抗体或包含其的药物组合物可通过肠胃外途径施用，其非限制性实例是静脉内施用。可以单独地将本发明的抗体与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂以单一或多个剂量施用于人患者。本发明的药物组合物可以通过本领域已知的方法制备(例如，
remington: the science and practice of pharmacy, 第22版 (2012), a. loyd等人, pharmaceutical press)。
142.在一个实施方案中，本发明的多肽分子是无菌的。在另一个实施方案中，本发明的多肽分子是实质上纯的。在另一个实施方案中，本发明的多肽分子是实质上纯的且无菌的。
143.可调整施用本发明的多肽分子的剂量方案以提供最佳期望应答(例如治疗作用)。
144.在一个实施方案中，当本发明的多肽分子结合人tigit时，其拮抗人tigit。在另一个实施方案中，当本发明的多肽分子结合人pd-1时，其拮抗人pd-1。如本文所用，术语“拮抗”是指阻断、中断、阻抑、抑制或降低目标生物活性的行为。在这方面，本发明的多肽分子(例如抗体)通过结合人pd-1并阻断人pd-l1与人pd-1的结合而拮抗人pd-1，且通过结合人tigit并阻断人tigit与cd155和或与cd112的结合而拮抗人tigit。
145.如本文所用的术语“抗体”是指具有识别并结合靶标(如蛋白、肽或多肽)的重链和轻链的单体或二聚体免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，抗体特异性结合靶标。每条重链由n-末端hcvr (重链可变区)和hccr (重链恒定区)构成。每条轻链由n-末端lcvr (轻链可变区)和lccr (轻链恒定区)构成。重链的恒定区含有ch1、ch2和ch3结构域。
146.术语“抗体片段”是保留结合完整抗体所结合的靶标的能力的抗体片段。在一个实施方案中，抗体片段特异性结合靶标。在另一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的hcdr1-3和lcdr 1-3。在另一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的hcvr和lcvr。
147.除非本文另有指示，否则“tigit”是指人tigit，且“pd-1”是指人pd-1。
148.如本文所用的术语“结合”是指两个分子(例如本发明的多肽分子与tigit、pd-1或tigit和pd-1)之间的分子相互作用。术语“单特异性结合”是指结合一个靶标(例如人tigit或人pd-1)。术语“双特异性结合”是指结合人tigit和人pd-1。术语“多特异性结合”是指结合人tigit、人pd-1和一个或两个其他靶标。
149.术语“选择性结合(selectively binds)”或“特异性结合(specifically binds)”意指本发明的多肽分子比其他物质更频繁地、更快速地、以更长的持续时间、以更大的亲和力、或以上述的一些组合与人tigit或与pd-1或与人tigit和人pd-1相互作用。在一个实施方案中，“特异性结合”意指本发明的多肽分子以约0.1 mm或更小的kd结合人tigit、或人pd-1、或人tigit和人pd-1。在另一个实施方案中，“特异性结合”意指本发明的多肽分子以约0.01 mm或更小的kd结合人tigit、或人pd-1、或人tigit和人pd-1。在另一个实施方案中，“特异性结合”意指本发明的多肽分子以约0.001 mm或更小的kd结合人tigit、或人pd-1、或人tigit和人pd-1。在另一个实施方案中，“特异性结合”意指本发明的多肽分子以约0.0001 mm或更小的kd结合人tigit、或人pd-1、或人tigit和人pd-1。在另一个实施方案中，本发明的多肽分子以不同于该多肽分子结合人pd-1的kd的kd结合人tigit。在另一个实施方案中，多肽分子结合人tigit的紧密程度是其结合人pd-1的紧密程度的约10倍。
150.在一个实施方案中，如本文所用的术语“多肽分子”是指包含氨基酸残基的聚合物的分子。在另一个实施方案中，多肽分子由氨基酸残基的聚合物组成。
151.在一个实施方案中，多肽分子是结合人tigit、或人pd-1、或人tigit和人pd-1的scfv分子。在另一个实施方案中，所述scfv分子特异性结合人tigit、或人pd-1、或人tigit和人pd-1。所述scfv分子可以是单特异性的(结合人tigit或人pd-1)、双特异性的(结合人tigit和人pd-1)或多特异性的(结合人pd-1、人tigit和/或另外的靶标)。
2009; 106(42): 17858
–
17863；lozano等人, j immunol. 2012; 188(8): 3869
–
3875。
167.用于体外测定pd-1活性的方法是本领域普通技术人员已知的，例如在以下中：carpenito等人, j immunother cancer 2018; 6(1):31；ghosh等人, mol cancer ther. 2019;18(3):632-641；stewart等人, cancer immunol res. 2015; 3(9):1052-62；maute等人, pnas 2015; 112(47): e6506-14。
168.实体肿瘤的体内鼠模型是本领域普通技术人员已知的，如本文所示，且如以下中所公开：例如sanmamed mf,等人, ann. oncol. 2016; 27: 1190-1198；manning hc,等人, j. nucl. med 2016; 57(suppl. 1): 60s-68s; teich ba. cancer ther. 2006; 5: 2435；rongvaux a,等人, ann. rev. immunol. 2013; 31: 635-74；stylli ss,等人, j. clin. neurosci 2015; 619-26；oh t,等人, j. transl. med. 2014; 12: 107-117；newcomb, ew,等人, radiation res. 2010; 173: 426-432；song y,等人, proc natl. acad. sci. usa 2013; 110: 17933-8；和rutter em,等人, scientific reports 2017; 7: doi:10.1038/s41598-017-02462-0。
169.本发明的dna分子是包含非天然存在的多核苷酸序列的dna分子，所述非天然存在的多核苷酸序列编码具有本发明的抗体中的至少一种多肽的氨基酸序列的多肽。
170.在将序列可操作连接至表达控制序列之后，可以在宿主细胞中表达本发明的多核苷酸。表达载体通常可在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体dna的整合部分复制。通常，表达载体含有选择标记(例如四环素、新霉素和二氢叶酸还原酶)以允许检测用期望dna序列转化的那些细胞。
171.可以通过已知方法将含有目标多核苷酸序列的表达载体(例如，编码多肽分子的多肽的多核苷酸和表达控制序列)转移至宿主细胞中，所述方法根据宿主细胞的类型而变化。
172.本发明的多肽分子可以容易地在哺乳动物宿主细胞中产生，所述哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括cho、ns0、hek293或cos细胞。可以使用本领域已知的技术培养宿主细胞。
173.可以采用各种蛋白纯化方法来纯化本发明的抗体，且此类方法是本领域已知的，且描述于，例如，deutscher, methods in enzymology 182: 83-89 (1990)和scopes, protein purification: principles and practice, 第3版, springer, ny (1994)中。
174.本文提及的序列根据表1中列出的序列标识符编号来编号。
hccr：重链恒定区；lccr：轻链恒定区；hcvr：重链可变区；lcvr：轻链可变区；ecd：胞外结构域。
实施例
175.抗体a表达和纯化可以基本上如下所述表达和纯化本发明的抗体。可以用使用最佳预定重链：轻链载体比率的用于分泌抗体的表达系统、或编码重链和轻链两者的单一载体系统瞬时或稳定转染适当的宿主细胞(如hek 293或cho)。可以用使用一种或多种dna分子的用于分泌抗体的表达系统瞬时或稳定转染本发明的抗体a，所述dna分子编码具有seq id no:21的氨基酸序列的第一重链、具有seq id no:22的氨基酸序列的第一轻链、具有seq id no:23的氨基酸序列的第二重链和具有seq id no:24的氨基酸序列的第二轻链。
176.所述抗体可以使用许多常用技术之一纯化。例如，可以将培养基便利地施加至已用相容缓冲液(如磷酸盐缓冲盐水(ph 7.4))平衡的mabselect柱(ge healthcare)或kappaselect柱(ge healthcare)。可以洗涤该柱以除去非特异性结合组分。可以例如通过ph梯度(如20mm tris缓冲液ph 7.0至10mm柠檬酸钠缓冲液ph 3.0，或磷酸盐缓冲盐水ph 7.4至100mm甘氨酸缓冲液ph 3.0)洗脱结合抗体。可以诸如通过uv吸光度或sds-page检测抗体级分，且然后可合并。根据预期用途，进一步纯化是任选的。可以使用常用技术浓缩和/或无菌过滤纯化的抗体。可通过常用技术(包括尺寸排阻、疏水性相互作用、离子交换、多模态或羟基磷灰石色谱)有效地除去可溶性聚集物和多聚体。纯化的抗体可以立即在-70℃冷冻或可以冻干。
177.抗体a结合人pd-1和人tigit使用biacore
®
t200(gehealthcare,piscataway,nj)在37℃通过表面等离子共振测量抗体a与可溶性人pd-1-胞外结构域(ecd)(sinobiologicals,cat＃10377-h08h)和人tigit-ecd的结合动力学和亲和力。将样品稀释于hbs-ep (10mmhepes,150mmnacl,0.05%tween-20,ph7.6)运行缓冲液(teknovacat＃h8022)中。蛋白acm5s系列传感器芯片(gehealthcarecat＃29127555)购自gehealthcare。
178.通过抗体捕获方法，使用多循环动力学评估结合。每个循环都在37℃以10μl/min的流速进行，用于将抗体捕获至蛋白a芯片，并以100μl/min的流速进行，用于分析物缔合和解离。每个循环由以下步骤组成：注入hbs-ep 中的2μg/ml的抗体a，目标为流动室上50ru的rmax值，注入180或200秒的hbs-ep 中的分析物(对于pd-1-ecd-his(人pd1-ecd-his(sinobiologicals,cat:10377-h08h)和人tigit-ecd-his(seqidno:32)，浓度范围分别为1000nm至1.95nm(通过两倍连续稀释))，随后为600秒解离阶段，并使用5μl的10mm甘氨酸盐酸盐ph1.5经30秒接触时间，利用10μl/min的流速进行再生。利用单体分子量(mw)值测定所有分析物浓度。人pd-1-ecd的缔合速率(k
on
)和解离速率(k
off
)使用双重参考(通过减去流动室1参考以及减去0nm空白)进行评估，并拟合至biaevaluation软件版本4.1中的“1:1(langmuir)结合”模型。根据关系kd=k
off
/k
on
从结合动力学计算解离常数(kd)。化学计量=[ru
max
/ru
捕获的
]/[mw
分析物
/mw
抗体
]，其中mw
抗体a
是150kda。值报告为平均值
±
标准偏差。
[0179]
在基本上如上文所述进行的实验中，表2中的结果表明抗体a结合人pd-1-ecd、人tigit-ecd、食蟹猴pd-1和食蟹猴tigit。
[0180]
表2。
[0181]
在基于细胞的测定中抗体a拮抗人pd-1/pd-l1活性使用nfat-luc报告子测定，测试抗体a拮抗由人pd-1与人pd-l1结合介导的活性的能力。简而言之，将表达人pd-l1和人工细胞表面t细胞受体(tcr)激活蛋白的cho-k1细胞(promegacs187108，pd1/pd-l1blockadeassaysystem的一部分，propagationmodelcs187109)用作抗原呈递细胞。通过逆转录病毒转移将人tigit引入表达人pd-1和nfat-luc2报告子的jurkat细胞(gloresponsenfat-luc2/pd-1jurkat,promegacs187102,pd-1/pd-l1blockadeassaysystem的一部分,propagationmodelcs187109)。cho-k1 pd-l1 pvr tcr激活蛋白细胞(在第7-9代)用胰蛋白酶分离，并以40,000个细胞/孔接种在白色不透明96-孔组织培养板(costar35-3296)中的100ul生长培养基中。cho-k1 pd-l1 tcr激活蛋白生长培养基由具有10%限定的fbs(hyclonesh30070.03)、200
µ
g/ml潮霉素b
(thermo fisher 10687-010)和250
ꢀµ
g/ml g418 (遗传霉素，corning 30-234-ci)的ham's f-12培养基(corning cellgro 10-080-cv)组成。使细胞在37℃、5% co2和95% rh生长过夜。第二天，在具有2 mm l-谷氨酰胺和10 mm hepes (gibco 22400)与2%限定的fbs (hyclone sh30070.03)的rpmi 1640中以2x工作浓度制备如表3中所示的抗体。
[0182]
将表达人pd-1、人tigit和nfat-luc2报告子的jurkat细胞在具有2 mm l-谷氨酰胺和10 mm hepes (gibco)、10%限定的fbs (hyclone)、100 μg/ml潮霉素b (thermo fisher)、500
ꢀµ
g/ml g418 (遗传霉素，corning)和1
ꢀµ
g/ml嘌呤霉素(calbiochem 540411，在无菌水中)的rpmi 1640中繁殖。将第5代至第7代间的jurkat细胞离心，并以1.25 x 106个细胞/ml的浓度重悬浮于rpmi/2%限定的fbs中。从96-孔板中的cho pd-l1 pvr tcr激活蛋白细胞的单层小心移除95
ꢀµ
l培养基。对于每次处理，一式三份地添加40 μl如上制备的2x浓度的抗体(包括单独培养基对照)，如表3中所示。然后，每孔添加40
ꢀµ
l重悬浮的jurkat pd-1 tigit nfat-luc2细胞(50,000个细胞/孔)。将测定板在37℃、5% co2、95% rh孵育6小时。在孵育结束时，将板在室温(rt)平衡5至10分钟。添加80
ꢀµ
l/孔的重构的bio-glo
™
荧光素酶底物(promega g7940)，并将板在室温进一步孵育5-10分钟。在具有envision manager软件v.1.13.3009.1409、超灵敏模式和0.2秒积分时间的perkin elmer envision multimode reader上读取板。在每个板内，将发光值(相对光单位(rlu))针对从用单独培养基处理的细胞获得的值归一化(诱导倍数(fold induction)= rlu处理/rlu单独培养基对照)。使用graphpad prism 7软件计算ec
50
值。
[0183]
在基本上如上所述进行的实验中，表3中的结果表明，抗体a和抗-人pd-1-igg4-paa的ec
50
值分别为1.838 nm和1.226 nm，并且在基于细胞的测定中，抗体a结合并拮抗-人pd-1/人pd-l1结合。
[0184]
表3。
[0185]
在基于细胞的测定中抗体a拮抗人tigit人pd-1和tigit两者在活化的肿瘤浸润淋巴细胞中表达或共表达。在jurkat nfat-luc报告子测定(其经工程改造以共表达人pd-1 (9,000个pd-1受体/细胞)和人tigit(5,500个tigit受体/细胞))中测试抗体a拮抗人tigit-介导的活性的能力。简而言之，将如表4中所示的抗体与jurkat 人tigit 人pd-1 nfat-luc细胞孵育6小时。添加bio-glo荧光素酶底物，并在孵育结束时读取发光。在表4中，数据(诱导倍数= rlu处理/rlu单独培养基对照)表示为每种处理一式三份孔的平均值。
[0186]
在基本上如上所述进行的实验中，表4中的结果表明在基于细胞的测定中，抗体a结合并拮抗人tigit。
[0187]
表4
。
[0188]
在基于细胞的测定中抗体a同时结合pd-1和tigitpd-1和tigit受体分别用prolink和酶激活蛋白标记，并在293细胞中共表达。在抗体a与人pd-1和人tigit受体结合后，使受体紧密接近，使得能够重构活性β-半乳糖苷酶，其水解底物以产生化学发光信号。
[0189]
在基本上如上所述进行的实验中，表5中的结果表明，抗体a同时与人pd-1和人tigit受体物理接合。用对照igg1或抗-人tigit和抗-人pd-1抗体或用抗-人tigit与抗-人pd1抗体的组合未看到作用。
[0190]
表5。
[0191]
在混合白细胞反应(mlr反应)中抗体a诱导t细胞活化在人同种异体(allo) mlr测定中检查抗体a的人pd-1阻断功能。人pbmc由冷冻获得(allcells)或从进行血浆去除术的新鲜全血(indiana blood center)获得，并以ficoll-paque plus (ge healthcare)密度梯度分离。用人单核细胞分离试剂盒ii或cd14 microbeads (miltenyi biotec)和automacs pro分离器(miltenyi biotec)分离cd14

单核细胞。未成熟的树突细胞(dc)通过如下生成：将单核细胞在含有10% fbs的完全rpmi-1640培养基中在1,000 iu/ml hgm-csf (r&d; 215-gm-050，或sanofi; leukine, 沙格司亭; ndc 0024-5843-01)和500 iu/ml hil-4 (r&d; 204-il-050或另外的来源)存在的情况下培养2天(表6)。使用人cd4
t细胞分离试剂盒(miltenyi biotec)从不同健康供体的新鲜人pbmc (allcells或indiana blood center)纯化cd4
t细胞。然后将来自不同供体的两种类型的细胞在96-孔v型底板中的完全aim-v培养基(thermo fisher scientific)中混合，每孔含有5x104至1x105个cd4
t细胞和5x103个未成熟dc。将表6中所示的抗体连续稀释，且以100 ul/孔一式三份添加至板。将板在37℃在5% co2中孵育4天。收获上清液，并根据制造商的说明进行人ifn-γ elisa (r&d systems; sif50, 或dy285)。在九个不同的供体对中测试抗体。用graphpad prism软件(graphpad software)，使用来自三个t:dc供体对的数据计算ec50值。
[0192]
在基本如上所述进行的实验中，表6中的结果令人惊讶地表明，当与单独的抗pd-1抗体或与抗-人pd-1 抗-人tigit组合相比时，抗体a表现出增强的人pd-1阻断活性，如通过相对于igg1对照的ifnγ水平的最大倍数增加所测量的。
[0193]
表6
。
[0194] 在破伤风回忆测定（tetanus recall assay）中抗体a诱导t细胞活化用温热的完全aim-v培养基解冻来自破伤风类毒素应答者的冷冻pbmc，并静置24小时。静置后，使细胞通过30微米过滤器以除去大碎片和聚集体。计数细胞并在完全aim-v培养基中重悬浮至2.5 x106个细胞/ml，并以200 ul以5x105个细胞/孔接种于u形底96孔板中。以20ug/ml添加如表7中所示的抗体，并以1:3连续稀释。用4 ng/ml破伤风类毒素刺激细胞，并在37℃孵育48小时。然后用msd试剂盒(mesoscale discovery)定量上清液中的ifnγ水平。
[0195]
在基本上如上所述进行的实验中，表7和表8中的结果表明，添加抗体a (表7)或抗-人pd-1 抗-人tigit组合(表8)以剂量依赖性方式增强t细胞活化，如通过ifnγ释放所测量的。测量的。
[0196]
在用人t细胞移植的hcc827 nsg肿瘤异种移植模型中抗体a表现出抗肿瘤效力。
[0197]
在第0天，将10x106个hcc827细胞重悬浮于0.2 ml基质胶溶液中，并皮下植入用人t细胞移植的雌性nod/scidγ (nsg)小鼠(jackson laboratories)的右胁腹中。在第40天，以n =8随机化小鼠，且每个治疗组以10 mg/kg每周一次腹膜内(ip)给药，持续4周。治疗组包括对照igg、抗体a、抗-人pd-1-higg4-paa、抗-人tigit-higg1-en和抗-人pd-1-higg4-paa 抗-人tigit-higg1-en抗体。抗体a也以1 mg/kg和3 mg/kg每周给药，持续4周。每周两
次测量体重和肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)计算为π/6 * 长度 * 宽度2且% t/c计算为100
ꢀ×
δt /δc，如果几何平均值的δt ＞ 0。使用sas软件中的程序进行统计学分析。
[0198]
在基本上如上所述进行的实验中，表9中的结果表明，相对于对照igg治疗组，以1 mg/kg、3 mg/kg或10 mg/kg给药的抗体a显著抑制人t细胞移植的小鼠中的肿瘤生长(分别地p ＜ .001)。令人惊讶地，当与抗-人pd-1 抗-人tigit组合治疗组相比时，所有3个剂量的抗体a也表现出统计学上显著的效力，其中分别地p ＜ .001和p ＜ .334。
[0199]
在hcc827 nsclc cd34 nsg肿瘤异种移植模型中抗体a表现出抗肿瘤效力和增加的cd226 cd8 t细胞和cd226 nk细胞。
[0200]
在第0天，将10x106个hcc827皮下植入用cd34 造血干细胞移植的雌性nod/scidγ (nsg)小鼠(jackson laboratories)的右胁腹中。在第21天，以n =8/组随机化小鼠，且每个治疗组以10 mg/kg每周一次腹膜内(ip)给药，持续4周。治疗组包括对照igg、抗体a、抗-人pd-1-higg4-paa、抗-人tigit-higg1-en和抗-人pd-1-higg4-paa 抗-人tigit-higg1-en抗体。每周两次测量体重和肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)计算为π/6 * 长度 * 宽度2且% t/c计算为100
ꢀ×ꢀ
δt /δc，如果几何平均值的δt ＞ 0。使用sas软件中的mixed程序进行统计学分析。
[0201]
在基本上如上所述进行的实验中，表10中的结果表明，相对于对照igg治疗组，以10 mg/kg给药的抗体a显著抑制人cd34 造血干细胞移植的小鼠中的肿瘤生长(p ＜ .001)。令人惊讶地，当与抗-人pd-1 抗-人tigit组合治疗组相比时，抗体a也表现出显著的抗-肿瘤效力，其中分别地p ＜ .001和p ＜ .006。
[0202]
在研究结束时，收集肿瘤并处理成单细胞悬浮液。用300 ul facs缓冲液中的抗体对肿瘤浸润淋巴细胞(til)进行染色。使用lsrfortessa x20获取流数据，并使用flowjo 10分析。cd226 cd8 t细胞在表11中显示为每只小鼠的til中总cd8 t细胞(cd8 cd3 cd45 活淋巴细胞)的%。cd226 nk细胞在表11中显示为每只小鼠的til中总nk细胞(cd56 cd3-cd45 活淋巴细胞)的%。
[0203]
在基本上如上所述进行的实验中，表11和表12中的结果表明，抗体a治疗的小鼠表现出cd226 cd8t细胞和cd226 nk细胞的百分比增加，而抗-人pd-1治疗的小鼠仅显示cd226 nk细胞的增加。由于已显示cd226信号传导对抗-肿瘤活性至关重要，所以抗体a治疗组中cd8和nk细胞群体二者中cd226 细胞的增加可指示增强的细胞毒性的潜能，此可有助于研究中观察到的抗体a的抗-肿瘤活性。
[0204]
表11
ꢀ‑ꢀ
% cd226阳性cd8 t细胞。
[0205]
表12
ꢀ‑ꢀ
% cd226阳性nk细胞
。
[0206]
最后剂量后6天，经由elisa分析抗-人pd-1-higg4-paa、抗-人tigit-higg1-en和抗体a的血清水平。重组人pd-1-his (r&d systems，cat：8986-pd)和重组人tigit-his (r&d systems，cat：9525-tg)分别用于pd-1和tigit捕获elisa。小鼠抗-人igg fc hrp (southern biotech/9040-05)用于检测。
[0207]
在基本上如上所述进行的实验中，表13中的结果表明，如通过人pd-1和人tigit抗原捕获elisa二者测量的抗体a血清水平是相当的，因此表明抗体的体内稳定性。
[0208]
。
[0209]
氨基酸和核苷酸序列