鸡血藤提取物的提取方法、鸡血藤提取物及其用途与流程

1.本发明属于中医药领域。具体地，本发明涉及一种鸡血藤提取物及其制备方法。本发明还涉及所述鸡血藤提取物或其单体活性成分及其衍生物在制备用于预防和/或治疗肿瘤转移的药物中的用途。更具体地，本发明还涉及所述鸡血藤提取物或其活性成分及其衍生物在制备用于预防和/或治疗肿瘤的骨转移的药物中的用途。


背景技术：

2.鸡血藤为豆科(leguminosae)密花豆属(spatholobus)植物密花豆(suberectus spatholobus dunn)的干燥藤茎。《中华人民共和国药典》记载该品性味苦、甘，温。归经归肝、肾经。《本草再新》中称其能补中燥胃；《本草纲目拾遗》中称其能活血，暖腰膝，具有补血活血、调经止痛、舒筋活络之功效，常用于月经不调、痛经、经闭、风湿痹痛、麻木瘫痪、血虚萎黄等患者的治疗，药用需求量大。近年来，临床上常用鸡血藤治疗贫血以及各种原因(如放疗、化疗)引起的白细胞、血小板、红细胞等全血象减少和再生障碍性贫血等疾病，且疗效较好。现代药理学研究证明，鸡血藤还具有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、对酪氨酸酶双向调节、抗炎、抗氧化、镇静催眠等作用。鸡血藤除具有改善造血系统的作用以外，还具降血脂、降血压、抗心律失常等作用。但是现有技术中对鸡血藤或其单体活性成分与肿瘤转移的相关性的研究较少。
3.鸡血藤中的化学成分主要包括黄酮类、萜类、甾醇类、木质素类、蒽醌类及一些微量元素，其中黄酮类化合物的含量最多。现有技术对鸡血藤提取方法的研究多以总黄酮提取率为指标，而未考虑提取方法对提取物药效的影响。为获得较高的总黄酮提取率，现有技术中鸡血藤的提取多采用高温(60℃以上)提取，包括浸渍、水煎煮、有机溶剂回流提取、超声提取等。但是高温提取是否会破坏鸡血藤有效成分、影响其药效，现有技术并未涉及。
4.基于以上，当前对能更多的保留鸡血藤有效成分的提取方法存在需求。


技术实现要素：

5.因此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种鸡血藤提取物或其活性成分的提取方法，本发明还提供了鸡血藤提取物或其活性成分在制备用于预防和/或治疗肿瘤的骨转移的药物中的用途。
6.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
7.一方面，本发明提供了一种鸡血藤提取物的提取方法，所述方法为低温渗漉法，包括以下步骤：
8.1)将鸡血藤粉碎，并使用有机溶剂浸泡；
9.其中，所述浸泡温度为5℃～50℃；优选地为10℃～40℃；更优选地为12℃～25℃；
10.所述浸泡时间为5～36小时；优选地为10～24小时；更优选地为12小时；
11.2)将步骤1)得到的浸泡后的鸡血藤与有机溶剂的混合物装入渗漉筒，使用有机溶剂渗漉；
12.其中所述渗漉温度为5℃～50℃；优选地为10℃～40℃；更优选地为12℃～25℃；所述渗漉时间为5～36小时；优选地为10～24小时；更优选地为12小时；
13.3)将步骤2)得到的渗漉液在20℃～40℃下旋蒸，得到浓缩液；
14.优选地，所述旋蒸温度为20℃～25℃；
15.4)将步骤3)得到的浓缩液干燥，得到鸡血藤提取物；
16.其中，所述步骤1)-4)在避光下进行。
17.根据本发明所述的方法，其中在步骤1)和步骤2)中，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇和乙酸乙酯中的一种或多种；
18.优选地，所述有机溶剂为体积浓度40％～80％的乙醇溶液；更优选地，所述有机溶剂为体积浓度50％～70％的乙醇溶液；进一步优选地，所述有机溶剂为体积浓度55％～65％的乙醇溶液；最优选地，所述有机溶剂为体积浓度为60％的乙醇溶液。
19.根据本发明所述的方法，其中在步骤1)中，所述有机溶剂的用量与药材重量之比以ml:g计为2～20:1；优选地，所述有机溶剂的用量与药材重量之比以ml:g计为4～10:1；最优选地，所述溶剂的用量与药材重量之比以ml:g计为5:1；
20.优选地，其中在步骤2)中，所述有机溶剂的用量与药材重量之比以ml:g计为2～20:1；优选地，所述溶剂的用量与药材重量之比以ml:g计为4～10:1；最优选地，所述溶剂的用量与药材重量之比以ml:g计为5:1。
21.另一方面，本发明提供了一种鸡血藤提取物，其中所述鸡血藤提取物中包含作为活性成分的原花青素；
22.优选地，所述原花青素包含儿茶素、表儿茶素、没食子酸和原花青素b2；
23.优选地，所述儿茶素为儿茶素聚合体，更优选地为儿茶素2-30聚体，，进一步优选地为儿茶素4-10聚体；
24.优选地，所述提取物中原花青素的含量为75重量％以上，更优选地为80重量％以上，进一步优选地为85重量％以上，更进一步优选地为90重量％以上。
25.再一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含所述鸡血藤提取物；
26.优选地，所述药物组合物为将鸡血藤提取物与其它食物、中药或生物药物配伍成方；
27.更优选地，所述配方使用所述的方法制备鸡血藤提取物，使其具有相应的功能与药效。
28.根据本发明所述的药物组合物，其还包含一种或多种药学上可接受的辅料和/或赋形剂；优选地，所述辅料和/或赋形剂选自填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质中的一种或多种。
29.优选地，所述填充剂选自淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素和蔗糖的一种或多种；所述崩解剂选自淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素和交联羧甲基纤维素钠的一种或多种；所述润滑剂选自硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉和二氧化硅的一种或多种；所述助悬剂选自聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂和羟丙基甲基纤维素的一种或多种；所述粘合剂选自淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基甲基纤维素的一种或多种。
30.根据本发明所述的药物组合物，其为口服制剂或注射制剂；优选地，所述口服制剂
为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、茶剂、口服液体制剂或纳米剂等；
31.优选地，所述药物为复方制剂，其包含其他中药提取物或药物活性组分。
32.再一方面，本发明提供了所述的鸡血藤提取物或药物组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤骨转移的药物中的用途；
33.优选地，所述肿瘤包括但不限于膀胱癌、脑癌、乳腺癌、骨髓癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、结直肠癌、食管癌、肝细胞癌、成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、t-细胞或b-细胞起源的淋巴样恶性肿瘤、黑素瘤、髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。
34.更优选地，所述肿瘤为三阴性乳腺癌。
35.再另一方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗肿瘤骨转移的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的鸡血藤提取物；
36.优选地，所述肿瘤包括但不限于膀胱癌、脑癌、乳腺癌、骨髓癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、结直肠癌、食管癌、肝细胞癌、成淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、t-细胞或b-细胞起源的淋巴样恶性肿瘤、黑素瘤、髓性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌或脾癌。
37.与现有技术相比，本发明的方法具备以下优点：
38.1.本发明的预防或治疗肿瘤骨转移的鸡血藤原料易得，制备方法简单，并且给药方便。
39.2.本发明提供的鸡血藤提取物采用低温渗漉提取，有效成分含量高、抗肿瘤活性好。
附图说明
40.以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
41.图1为根据本发明的鸡血藤提取物对三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231-luc细胞株的迁移抑制作用；其中图1a为十二孔板细胞划痕试验的示意图；图1b为十二孔板细胞划痕试验结果的折线图；图1c为十二孔板细胞划痕试验结果的柱状图；图1d为十二孔板细胞划痕试验结果的照片；图1a-1d说明根据本发明的鸡血藤提取物具有明显的抑制肿瘤细胞迁移的能力；
42.图2为根据本发明的鸡血藤提取物对三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231-luc细胞株的侵袭抑制作用的transwell实验的显微照片；说明经过三次重复转移实验，给予很小剂量的鸡血藤提取物后，能明显抑制肿瘤的转移；
43.图3为根据本发明的鸡血藤提取物对三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231-luc细胞株的转移作用的凝胶电泳图，从结果可以得知，给予本发明的鸡血藤提取物能减少肿瘤骨转移的原因可能与原发肿瘤的snx9的表达改变有关；
44.图4为根据本发明的鸡血藤提取物对乳腺癌骨转移的体内实验的骨转移存活率的图；
45.图5为根据本发明的鸡血藤提取物对乳腺癌骨转移的体内实验的小鼠图片。
具体实施方式
46.下面结合如下实施例对本发明做更进一步的详细说明，其并不意味着限制本发明。
47.实验药材和试剂：
48.鸡血藤药材采自中国广西；
49.唑来膦酸购自瑞士诺华公司；
50.紫杉醇购自江苏奥康药业；
51.mda-mb-231-luc细胞株来源于广州中山肿瘤医院；
52.dmem培养基购自美国gibco公司；
53.胰酶购自美国gibco公司。
54.除非特别说明，实验中所使用的的乙醇溶液均为体积浓度。
55.实验动物
56.裸鼠(品系：balb/c ann-nu(nude)mice)购自香港大学实验动物中心。
57.实施例1根据本发明的方法提取鸡血藤提取物
58.称取40g鸡血藤药品粉末，加入5倍量60％乙醇溶液，25℃浸泡12小时。然后装入渗漉筒，再用5倍量60％乙醇溶液，25℃渗漉12小时。收集渗漉液后，旋蒸(25℃)干燥后在转入低温冷冻干燥，得提取物粉末。提取过程中全程避光。
59.实施例2根据本发明的方法提取鸡血藤提取物
60.称取40g鸡血藤药品粉末，加入15倍量60％乙醇溶液，12℃浸泡10小时。然后装入渗漉筒，再用15倍量60％乙醇溶液，12℃渗漉12小时。收集渗漉液后，旋蒸(40℃)干燥后在转入低温冷冻干燥，得提取物粉末，备用。提取过程中全程避光。
61.实施例3根据本发明的方法提取鸡血藤提取物
62.称取40g鸡血藤药品粉末，加入20倍量80％乙醇溶液，10℃浸泡24小时。然后装入渗漉筒，再用20倍量80％乙醇溶液，10℃渗漉10小时。收集渗漉液后，旋蒸(40℃)干燥后在转入低温冷冻干燥，得提取物粉末，备用。提取过程中全程避光。
63.实施例4根据本发明的方法提取鸡血藤提取物
64.称取40g鸡血藤药品粉末，加入10倍量80％乙醇溶液，40℃浸泡24小时。然后装入渗漉筒，再用10倍量80％乙醇溶液，40℃渗漉24小时。收集渗漉液后，旋蒸(20℃)干燥后在转入低温冷冻干燥，得提取物粉末，备用。提取过程中全程避光。
65.实施例5根据本发明的方法提取鸡血藤提取物
66.称取40g鸡血藤药品粉末，加入20倍量40％乙醇溶液，浸泡过夜(5℃)。浸泡过夜后，装入渗漉筒，再用20倍量40％乙醇溶液，5℃渗漉12小时。收集渗漉液后，旋蒸(40℃)干燥后在转入低温冷冻干燥，得提取物粉末，备用。提取过程中全程避光。
67.实施例6根据本发明的方法提取鸡血藤提取物
68.称取40g鸡血藤药品粉末，加入10倍量60％乙醇溶液，浸泡过夜(50℃)。浸泡过夜后，装入渗漉筒，再用10倍量60％乙醇溶液、50℃渗漉12小时。收集渗漉液后，旋蒸(20℃)干燥后在转入低温冷冻干燥，得提取物粉末，备用。提取过程中全程避光。
69.实施例7根据本发明的方法提取鸡血藤提取物
70.称取40g鸡血藤药品粉末，加入5倍量80％乙醇溶液，25℃浸泡12小时。然后装入渗
漉筒，再用5倍量80％乙醇溶液，25℃渗漉12小时。收集渗漉液后，旋蒸(25℃)干燥后在转入低温冷冻干燥，得提取物粉末。提取过程中全程避光。
71.实施例1-7的结果与效果
72.1.盐酸－香草醛法测定原花青素含量
73.分别按实施例1-7方法制备鸡血藤提取物，用盐酸-香草醛法测定样品中的原花青素含量，以儿茶素为对照品溶液，按照紫外-可见分光光度法对样品进行测定，具体方法如下：
74.标准品制备：精密量取0.4g/l儿茶素标准品溶液10ml，加入10ml甲醇，制得0.2g/l标准品溶液；
75.香草醛-甲醇溶液：精密量取30g/l香草醛溶液40ml，加入80ml甲醇，制得10g/l香草醛甲醇溶液；
76.浓盐酸-甲醇溶液配制：量取75ml 37％浓盐酸溶液，加入25ml甲醇，制得浓度为9mol/l的浓盐酸溶液；
77.测量方法：儿茶素标准品(购自中国药检所)1ml(0-400g/ml)，加入试管，并加入2.5ml 10g/l的香草醛甲醇溶液，2.5ml 9mol/l的盐酸溶液，混匀后，显色30min，在500nm波长下测定吸光度。结果如表1所示。
78.2.采用mts法测定提取物抗肿瘤活性(ic
50
)
79.取处于对数期mda-mb-231-luc细胞以每孔3000个的密度接种于96孔板中；将接种好细胞的96孔板放到co2培养箱里培养过夜；
80.过夜培养后，用饥饿培养基(dmem 0.05％fbs 1％双抗)配制不同浓度梯度的鸡血藤提取物溶液，将已贴壁的细胞中加入不同浓度的鸡血藤提取物100μl，co2培养箱中孵育48小时。
81.表1 鸡血藤提取物的浓度
82.名称abcdefghi ssp(μg/ml)200.00133.3388.8959.2639.5126.3417.5611.710空白
83.ssp母液配2ml＝4mg/2ml
84.ssp a：ssp母液1ml 稀释液9ml＝2mg/10ml＝200μl/ml；
85.ssp b：a 1ml 稀释液0.5ml＝200μl/1.5ml＝133.33
86.ssp c：b 1ml 稀释液0.5ml＝133.33/1.5＝88.89
87.ssp d：c 1ml 稀释液0.5ml＝88.89/1.5＝59.26
88.ssp e：d 1ml 稀释液0.5ml＝59.26/1.5＝39.51
89.ssp f：e 1ml 稀释液0.5ml＝39.51/1.5＝26.34
90.ssp g：f 1ml 稀释液0.5ml＝26.34/1.5＝17.56
91.ssp h：g 1ml 稀释液0.5ml＝17.56/1.5＝11.71
92.结束孵育，用饥饿培养基配制mts(细胞存活测定试剂)工作液(5倍稀释)。吸出原有培养基，用pbs清洗一遍，加入mts工作液120μl于37℃，5％co2培养箱反应1.8h。用酶标仪检测样品在490nm吸光度。结果如表2所示。
93.表2 实施例1-7鸡血藤提取物原花青素含量
[0094][0095]
实施例8根据本发明的方法提取鸡血藤提取物
[0096]
称取40g鸡血藤药品粉末，加入10倍量55％乙醇溶液，浸泡过夜(25℃)。浸泡过夜后，装入渗漉筒，再用10倍量55％乙醇溶液、25℃渗漉36小时。收集渗漉液后，旋蒸(25℃)干燥后在转入低温冷冻干燥，得提取物粉末，备用。提取过程中全程避光。
[0097]
实施例9根据本发明的方法提取鸡血藤提取物
[0098]
称取40g鸡血藤药品粉末，加入15倍量65％乙醇溶液，浸泡过夜(40℃)。浸泡过夜后，装入渗漉筒，再用15倍量65％乙醇溶液、40℃渗漉24小时。收集渗漉液后，旋蒸(40℃)干燥后在转入低温冷冻干燥，得提取物粉末，备用。提取过程中全程避光。
[0099]
实施例10根据本发明的方法提取鸡血藤提取物
[0100]
称取40g鸡血藤药品粉末，加入20倍量60％甲醇溶液，浸泡过夜(30℃)。浸泡过夜后，装入渗漉筒，再用20倍量60％甲醇溶液、30℃渗漉24小时。收集渗漉液后，旋蒸(30℃)干燥后在转入低温冷冻干燥，得提取物粉末，备用。提取过程中全程避光。
[0101]
实施例11根据本发明的方法提取鸡血藤提取物
[0102]
称取40g鸡血藤药品粉末，加入20倍量50％丙酮溶液，浸泡过夜(40℃)。浸泡过夜后，装入渗漉筒，再用20倍量50％丙酮溶液、40℃渗漉24小时。收集渗漉液后，旋蒸(40℃)干燥后在转入低温冷冻干燥，得提取物粉末，备用。提取过程中全程避光。
[0103]
实施例12根据本发明的方法提取鸡血藤提取物
[0104]
称取40g鸡血藤药品粉末，加入5倍量70％乙醇溶液，浸泡过夜(20℃)。浸泡过夜后，装入渗漉筒，再用5倍量60％乙醇溶液、20℃渗漉36是小时。收集渗漉液后，旋蒸(40℃)干燥后在转入低温冷冻干燥，得提取物粉末。提取过程中全程避光。
[0105]
实施例13根据本发明的方法提取鸡血藤提取物
[0106]
称取40g鸡血藤药品粉末，加入15倍量70％乙醇溶液，浸泡过夜(50℃)。浸泡过夜后，装入渗漉筒，再用15倍量60％乙醇溶液、50℃渗漉36小时。收集渗漉液后，旋蒸(40℃)干燥后在转入低温冷冻干燥，得提取物粉末，备用。提取过程中全程避光。
[0107]
实施例14根据本发明的方法提取鸡血藤提取物
[0108]
称取40g鸡血藤药品粉末，加入20倍量50％乙醇溶液，浸泡过夜(40℃)。浸泡过夜后，装入渗漉筒，再用20倍量80％乙醇溶液、40℃渗漉36小时。收集渗漉液后，旋蒸(40℃)干燥后在转入低温冷冻干燥，得提取物粉末，备用。提取过程中全程避光。
[0109]
分别按实施例8-14方法制备鸡血藤提取物，用盐酸－香草醛法测定原花青素含量，收率在10％，原花青素含量在75％以上。
[0110]
对比例1现有技术提取鸡血藤提取物
[0111]
鸡血藤药材饮粉碎，取该粉末40g，精密称定，加入10倍量双蒸水浸泡2h，回流提取60min，过滤，收集滤液，80℃水浴加热减压浓缩，并放入-80℃冰箱内储存过夜，冷冻干燥。
[0112]
对比例2现有技术提取鸡血藤提取物
[0113]
鸡血藤药材饮粉碎，取该粉末40g，精密称定，加入10倍量60％乙醇浸泡2h，回流提取60min，过滤，收集滤液，残渣加8倍量60％乙醇提取60min，合并滤液，80℃水浴加热减压浓缩，并放入-80℃冰箱内储存过夜，冷冻干燥。
[0114]
对比例3现有技术提取鸡血藤提取物
[0115]
鸡血藤药材饮粉碎，取鸡血藤药材40g，精密称定，加入10倍量60％乙醇浸泡2h，超声温度为50℃，超声提取30min，过滤，收集滤液，40℃水浴减压浓缩，浓缩至无醇味，放入-80℃冰箱内储存过夜，冷冻干燥。
[0116]
对比例4现有技术提取鸡血藤提取物
[0117]
鸡血藤药材饮粉碎，取药材40g，精密称定，用10倍量60％乙醇完全浸没药材，浸润温度不超过40℃，浸润24h，过滤，收集滤液，40℃水浴减压浓缩，浓缩至无醇味，放入-80℃冰箱内储存过夜，冷冻干燥。
[0118]
分别按实施例1、对比例1-4制备鸡血藤提取物，测定原花青素含量和抗肿瘤活性，计算综合评分。
[0119]
结果见表3。
[0120]
表3 实施例1、对比例1-4鸡血藤提取物原花青素含量、抗肿瘤活性及综合评分
[0121]
实例例提取方法收率原花青素含量(％)药效(ic
50
)综合评分(100分)1渗漉提取14％
±
2％81％
±
3％0.6
±
0.2μg/ml891双蒸水煎煮10％
±
2％54％
±
3％1.70
±
0.4μg/ml382乙醇加热回流8％
±
2％71％
±
3％0.82
±
0.4μg/ml513超声提取7％
±
2％76％
±
3％0.73
±
0.4μg/ml564冷浸10％
±
2％78％
±
3％1.26
±
0.4μg/ml42
[0122]
以上结果表明，低温渗漉提取不仅提取物收率高，原花青素含量高，而且获得的鸡血藤提取物的抗肿瘤活性好，显著优于其他提取方法。
[0123]
对比例5
[0124]
该方法与实施例1基本相同，区别在于提取过程全程不避光。测定原花青素含量和抗肿瘤活性，计算综合评分。
[0125]
结果见表4。结果表明，避光提取得到的鸡血藤提取物抗肿瘤活性明显高于不避光提取得到的鸡血藤提取物。
[0126]
表4 避光对鸡血藤提取物原花青素含量和抗肿瘤活性的影响
[0127]
实施例收率原花青素含量(％)药效(ic
50
)综合评分(100分)114％
±
2％81％
±
3％0.6
±
0.2μg/ml89512％
±
2％81％
±
3％2.0
±
0.2μg/ml40
[0128]
该方法与实施例1基本相同，区别在于旋蒸温度为70℃，测定原花青素含量和抗肿瘤活性。
[0129]
结果见表5。实验结果表明，高温对原花青素有降解的作用，随之导致药效降低，因此，提取过程中应避免高温处理过程。
[0130]
表5 温度对鸡血藤提取物原花青素含量和抗肿瘤活性的影响
[0131]
实施例收率原花青素含量(％)药效(ic
50
)综合评分(100分)114％
±
2％81％
±
3％0.6
±
0.2μg/ml892012％
±
2％59％
±
3％1.36
±
0.2μg/ml32
[0132]
实施例15本发明的鸡血藤提取物抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭
[0133]
下述实验中：鸡血藤的计量分别以1.56μg/ml、3.12μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml的鸡血藤提取物(ssp)浓度制备药品。其中，所述鸡血藤提取物根据本技术的实施例1获得。
[0134]
1.鸡血藤提取物对三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231-luc的迁移抑制作用-细胞划痕实验
[0135]
实验原理：
[0136]
肿瘤细胞在体外仍有迁移的能力，本实验借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，利用细胞划痕法测定了肿瘤细胞的运动特性。
[0137]
实验材料：
[0138]
实验细胞：mda-mb-231-luc细胞株
[0139]
实验材料：12孔板、dmem完全培养基、dmem饥饿培养基、pbs、胰酶、
[0140]
实验仪器：酶标仪、15ml和50ml离心管、移液枪及枪头、拍照显微镜
[0141]
实验步骤：
[0142]
1.在12孔板中加入处于对数生长期的细胞约1.5
×
105个细胞(共1ml，即1.5
×
105个细胞/ml)。
[0143]
2.将培养过夜的细胞从孵育箱中取出，用200μl枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。力量不易太大。划痕后显微镜下观察划痕是否成功，是否笔直。如图1a所示。
[0144]
3.吸取培养基，用pbs轻柔地洗细胞3次，去处划下的细胞。加pbs时枪头尽量贴壁，流速尽量缓慢，防止细胞被吹散。吸出pbs后缓慢轻柔地加入含药的饥饿血清培养基。
[0145]
4.药物浓度计算：结果见表6。
[0146]
表6 ssp鸡血藤提取物给药浓度梯度(起始浓度来源依据以往数据)
[0147]
名称abcdefssp(μg/ml)25.0012.506.253.121.560
[0148]
用6孔板稀释药物。先取ssp粉末20mg溶解在10ml培养基内，浓度2mg/ml，再10倍稀释至200μg/ml，过滤除菌后，8倍稀释至25μg/ml(0.5ml 3.5ml)。
[0149]
ssp a：25μl/ml，4ml。
[0150]
ssp b：a 2ml 稀释液2ml＝12.5
[0151]
ssp c：b 2ml 稀释液2ml＝6.25
[0152]
ssp d：c 2ml 稀释液2ml＝3.12
[0153]
ssp e：d 2ml 稀释液2ml＝1.56
[0154]
ssp f：稀释液2ml
[0155]
5.给药后马上拍照，此为0h。拍照后将六孔板放入37℃、5％co2孵育箱中培养。按24，48，72小时拍照。
[0156]
实验结果：
[0157]
在细胞划痕实验中，六组不同干预的231-luc细胞的迁移率在不同时间点存在差异。各组在实验后0小时拍照时，未见明显差异(p》0.05)；在实验6小时后，亦未见明显差异(p》0.05)；在实验12小时后，对照组与25μg/ml组存在差异(p＝0.48)，但其他组未见明显差异(p》0.05)；在实验24小时后，对照组与3.12μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml组及25μg/ml组之间均存在显著差异。说明3.12组、6.25组、12.5组及25组对231-luc细胞的迁移起到明显抑制作用。结果如图1b-1d所示。
[0158]
2.药物对三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231-luc的侵袭抑制作用transwell实验
[0159]
实验原理：
[0160]
将transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
[0161]
实验材料：
[0162]
实验细胞：mda-mb-231-luc细胞株
[0163]
实验材料：transwell小室、matrigel、dmem完全培养基、dmem饥饿培养基、pbs、胰酶、4％多聚甲醛、甲醇、结晶紫或台盼蓝
[0164]
实验仪器：15ml和50ml离心管、移液枪及枪头、拍照显微镜
[0165]
实验步骤
[0166]
1.所有细胞培养试剂和细胞培养池放在37℃温育；
[0167]
2.待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用pbs和无血清培养基先后洗涤1次，用无血清培养基悬浮细胞，计数(制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的)。本实验细胞浓度为3
×
105/ml，
[0168]
3.在transwell上室加入100-150μl细胞悬液，在下室(即24孔板底部)加入600-800μl含10％血清的培养基(注意：上层小室与下层培养液之间不可有气泡，如有需要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板中)，继续在孵箱培养24h；
[0169]
4.取出transwell，慢慢吸出上层培养基，pbs洗两遍，将其浸泡在4％多聚甲醛溶液中(pbs配)，室温下2分钟，取出在pbs中清洗2遍。
[0170]
5.将其下表面浸泡在70％甲醇溶液中，固定30min～60min，pbs清洗2遍。
[0171]
6.用结晶紫或台盼蓝避光染色20分钟。
[0172]
7.pbs洗三遍以上。取出transwell，用棉签擦去pvpf膜靠近内室那一面的细胞。
[0173]
8.显微镜下观察细胞，计数pet膜下表面的细胞数，计算中间和四周5个视野，取平均值。或者取若干个视野计数细胞个数，选取16个视野，不是随机选择，而是有固定的位置。
[0174]
实验结果
[0175]
镜下对染色后的细胞进行计数，计数值高，则该组细胞迁移/侵袭能力强。结果如图2所示，其中对照组通过transwell小室的细胞数量明显多于ssp组。说明ssp对乳腺癌细胞的迁移起到抑制作用。
[0176]
实施例16本发明的鸡血藤提取物抗乳腺癌骨转移的作用
[0177]
1.本发明的鸡血藤提取物(根据实施例1制备)对三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231-luc中snx9、β-catenin等转移因子的调控
[0178]
实验原理：
[0179]
snx9作为一个新兴的乳腺癌转移调控因子，被广泛关注。申请人研究发现，ssp与snx9具有高度亲和性，可促进snx9在乳腺癌细胞中的表达。wnt/β-catenin是调控肿瘤形成及转移的经典通路之一，肿瘤组织中β-catenin的表达水平要远高于癌旁正常组织。申请人研究发现，ssp可明显抑制β-catenin的表达水平。
[0180]
实验材料：
[0181]
实验细胞：mda-mb-231-luc细胞株
[0182]
实验材料：dmem完全培养基、dmem饥饿培养基、pbs、胰酶、蛋白裂解液、标准蛋白定量试剂盒、转膜缓冲液等。
[0183]
实验仪器：15ml和50ml离心管、移液枪及枪头、拍照显微镜
[0184]
实验步骤：
[0185]
1.蛋白样本制备
[0186]
2.蛋白含量测定
[0187]
3.sds-page电泳
[0188]
4.转膜、免疫反应化学发光、显影、拍照
[0189]
实验结果：
[0190]
结果如图3所示，snx9在ssp(鸡血藤提取物)浓度为25μg/ml时表达明显减少，比对照组及3.12μg/ml组具有显著差异。β-catenin在ssp浓度为25μg/ml时表达明显减少，比对照组及3.12μg/ml组具有显著差异。n-cadherin在ssp浓度为25μg/ml时表达明显减少，比对照组及3.12μg/ml组具有显著差异。
[0191]
2.本发明的鸡血藤提取物对乳腺癌骨转移的体内实验
[0192]
实验材料：
[0193]
实验细胞：mda-mb-231-luc细胞株
[0194]
实验动物：裸鼠(品系：balb/c ann-nu(nude)mice)18只，spf级，体重16～18g(见表6)，由香港大学动物实验中心(laboratory animal unit of hong kong university,lau)提供，均饲养于lau，温度18～22℃，湿度65％。
[0195]
实验材料：dmem完全培养基、dmem饥饿培养基、pbs、胰酶、millq
[0196]
实验仪器：29号胰岛素注射器、灌胃针
[0197]
实验步骤：
[0198]
动物分组：将裸鼠随机分组后，打耳洞标记老鼠编号。左心室注射mda-mb-231-luc乳腺癌细胞(细胞浓度为5*106/ml，0.1ml/只)。并分别在注射当天及注射后2天内给与美洛昔康0.2ml/只。心室注射三天后开始预防性给药。
[0199]
给药方法：对照组按0.1ml/10g/d给予milli q水灌胃，ssgx按照0.4g/kg给予0.1ml/10g/d药液灌胃，唑来膦酸按照5μg/一周三次皮下注射。每批次模型给药时间约为28天。
[0200]
观察指标:
[0201]
每2天测量一次体重，在给药14天、28天时进行荧光拍照，28天后处死进行一般药理学实验。
[0202]
实验结果：
[0203]
结果如图4和图5以及表7所示，在造模后第28天，对照组及zol(唑来膦酸)组相继出现骨转移症状，小鼠表现为下肢行动不利，继而瘫痪，荧光拍照显示均由不同程度的腰椎或股骨转移。直至35天处死时，对照组有3只出现骨转移、zol组1只出现骨转移，ssp组未见骨转移。
[0204]
表7 鸡血藤抗乳癌骨转移
[0205]
出现转移时间(天)对照组zol组ssp开始时间(天)2625第35天都没出现处死时间(天)363535转移率100％33-35％0％
[0206]
以上结果说明，与对照组及阳性药物(唑来膦酸)组比较，本发明的鸡血藤提取物具有明显的预防肿瘤细胞骨转移的作用。
[0207]
虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式的范例，但本领域的技术人员应当理解，以上这些仅为举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均应落入本发明的保护范围。