一种防治食物过敏的组合物的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种防治食物过敏的组合物。


背景技术：

2.食物过敏是一种世界性的常见免疫性疾病，由正常的食物引起的病理性、潜在致命的过敏反应。大部分的食物过敏原具有高度热稳定性和ph稳定性，序列保守性高，且种间能够发生不同程度的交叉反应。
3.目前缓解和控制食物中各种过敏原引起的过敏普遍采用的方法有避免食用包含相应过敏原及其制品、针对食物去除其相应过敏原和临床上用于治疗的抗过敏药物。避免食用含有过敏原的食物及其制品，可以有效降低过敏发生的机率，但不能从根本上规避一种食物的食用。食品去除过敏原方法均可以显著降低过敏原的免疫活性，但其不能从根本上缓解或控制食品过敏，并且易使食物失去其本身的结构、感官性状和营养价值。临床的治疗用药主要是特异性免疫治疗诱导机体对过敏原耐受，当宿主再次接触过敏原可引发不同程度的过敏反应。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种防治食物过敏的组合物。
5.在本发明的第一方面提出了一种防治食物过敏的组合物，包括长双歧杆菌和动物双歧杆菌；所述长双歧杆菌的拉丁名称：bifidobacterium longum，保藏编号：cicc 6188；所述动物双歧杆菌的拉丁名称：bifidobacterium animalis，保藏编号：cicc 6165。
6.根据本发明的实施例的防治过敏的组合物，通过长双歧杆菌和动物双歧杆菌的协同作用，能够有效抑制th0向th2分化，显著调节升高ige和il-4，增强肠系膜淋巴结中treg分化和il-10分泌，减少嗜碱性粒细胞组胺分泌，来减少食物过敏反应，从而调节或改善人体肠道环境达到抗过敏的作用。
7.可选地，所述长双歧杆菌和所述动物双歧杆菌以1：1比例摄入，摄入量为每天1
×
10
10
～1
×
10
13
cfu。
8.在本发明的第二方面提出了一种防治食物过敏的药物，包括长双歧杆菌和动物双歧杆菌；所述长双歧杆菌的拉丁名称：bifidobacterium longum，保藏编号：cicc 6188；所述动物双歧杆菌的拉丁名称：bifidobacterium animalis，保藏编号：cicc 6165。
9.根据本发明的实施例的防治过敏的药物，通过长双歧杆菌和动物双歧杆菌的协同作用，能够有效抑制th0向th2分化，显著调节升高ige和il-4，增强肠系膜淋巴结中treg分化和il-10分泌，减少嗜碱性粒细胞组胺分泌，来减少食物过敏反应，从而调节或改善人体肠道环境达到抗过敏的作用。
10.可选地，所述药物呈片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、冻干制剂中的一种。
11.可选地，还包括药学上可接受的辅剂，所述辅剂包括稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂中的至少一种。
12.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
13.图1为根据本发明实施例2的长双歧杆菌和动物双歧杆菌对过敏患者血清中特异性ige的影响；
14.图2为根据本发明实施例3的长双歧杆菌和动物双歧杆菌过敏患者血清中组胺含量的影响；
15.图3为根据本发明实施例4的长双歧杆菌过敏患者血清中特异性ige的影响；
16.图4为根据本发明实施例5的长双歧杆菌过敏患者血清中组胺含量的影响。
具体实施方式
17.以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
18.为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
19.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
20.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
21.实施例1
22.一、菌株的分离
23.(1)用灭菌的取样匙对自然发酵酸奶进行取样，取样过程避免其他部位接触样品以防污染，无菌条件下取1ml自然发酵酸奶置于99ml浓度为0.85％的无菌生理盐水的三角瓶中，振荡15min，使样品充分混匀，制得混悬液；按倍数稀释法对混悬液进行10倍系列梯度稀释，每个梯度取100μl均匀涂布于mrs蛋白胨10g、牛肉粉5g、k2hpo4·
7h2o 2g、柠檬酸三铵2g、ch3coona
·
3h2o 5g、葡萄糖20g、吐温80 1ml、mgso4·
7h2o 0.2g、mnso4·
4h2o 0.05g、蒸馏水1000ml的平板培养基上，随后置于厌氧罐中，37℃厌氧培养过夜，次日可见mrs平板培养基上长有特征菌落(特征为菌落中等大小，凸起，微白色，湿润，边缘整齐，菌落呈圆形，直径为1.5mm
±
1mm)；按1％的接种量，对选取的特征菌落作二代划线接种到mrs平板培养基上进行纯化处理，37℃，厌氧活化1天，得到培养物，备用。
24.(2)引物：27f：5'agagtttgatcmtggctcag 3'；1492r：5'ggttaccttgttacgactt 3'。
利用细菌dna试剂盒提取培养物的dna，然后pcr扩增16srdna片段，得到扩增产物，之后将扩增产物送至生工生物工程股份有限公司进行测序，得到16srdna的全长。16srdna在eztaxon数据库进行blast比对，进行同源性比较，该菌种分别属于长双歧杆菌(bifidobacterium longum)和动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis)，其分类单元分别为：bacteria；actinomycetes；actinobacteria；bifidobacteriales；bifidobacteriaceae；bifidobacterium longum和bacteria；actinomycetes；actinobacteria；bifidobacteriales；bifidobacteriaceae；bifidobacterium animalis。
25.实施例2
26.(1)以10名食物过敏患者为研究对象，将10名患者随机分为对照组(3人)、安慰剂组(3人)和益生菌组(4人)。受试期间，益生菌组受试者每日午餐后1小时内服用独立包装的1：1混合长双歧杆菌和动物双歧杆菌(2g，活菌数为0.5
×
10
13
cfu/g)，安慰剂组受试者每日午餐后1小时内服用安慰剂粉末(烘干多孔糊精2g)，连续服用28天。所有人群在试验前和试验期间所食用的食物均保持一致。服用益生菌或安慰剂第28天采集受试者的血液样品，并对其进行高速离心获取血清进行免疫指标检测。
27.(2)血清中特异性ige测定：利用酶联免疫吸附法(elisa法)进行测定。小麦醇溶蛋白用pbs稀释至15μg/ml，然后将其固定在96孔板中4℃过夜，用200μl pbs洗涤3次，在25℃下，用200μl 5％bsa封闭2h。之后，将平板洗涤3次并与100μl 10位受试者的血清(1:30稀释)，并在37℃下孵育1.5小时，并使用非过敏血清作为阴性对照。洗涤3次后，每孔加入100μl hrp偶联山羊抗人ige(1:5000)，37℃孵育1.5小时。然后每孔加入100μl四甲基联苯胺溶液，37℃孵育15分钟。50μl 2m h2so4溶液终止显色反应。使用酶标仪(molecular devices，usa)在450nm处测量每个孔的光学密度。
28.结果如图1所示，与对照组相比，安慰剂组食物过敏人群血清中ige水平无显著变化，长双歧杆菌和动物双歧杆菌干预28天益生菌组食物过敏人群血清中ige水平显著低于对照组与安慰剂组。说明长双歧杆菌和动物双歧杆菌干预对食物过敏患者具有调节作用，能调节或改善人体肠道环境达到抗过敏的作用。
29.实施例3
30.(1)以10名食物过敏患者为研究对象，将10名患者随机分为对照组(3人)、安慰剂组(3人)和益生菌组(4人)。受试期间，益生菌组受试者每日午餐后1小时内服用独立包装的1：1混合长双歧杆菌和动物双歧杆菌(4g，活菌数为1
×
10
13
cfu/g)，安慰剂组受试者每日午餐后1小时内服用安慰剂粉末(烘干多孔糊精4g)，连续服用28天。所有人群在试验前和试验期间所食用的食物均保持一致。服用益生菌或安慰剂第28天采集受试者的血液样品，并对其进行高速离心获取血清进行免疫指标检测。
31.(2)血清中组胺测定：血清中组胺的测定采用人组胺elisa试剂盒(购于thermo fisher scientific)，按照其说明书进行测定，在450nm处测定各孔的吸光度od值。
32.结果如图2所示，与对照组相比，安慰剂组食物过敏人群血清中组胺水平无显著变化，长双歧杆菌和动物双歧杆菌干预28天益生菌组食物过敏人群血清中组胺水平显著低于对照组与安慰剂组。说明长双歧杆菌和动物双歧杆菌干预对食物过敏患者具有调节作用，能调节或改善人体肠道环境达到抗过敏的作用。
33.实施例4
34.(1)以10名食物过敏患者为研究对象，将10名患者随机分为对照组(3人)、安慰剂组(3人)、益生菌组(4人)、长双歧杆菌组(4人)和动物双歧杆菌组(4人)。受试期间，益生菌组受试者每日午餐后1小时内服用独立包装的1：1混合长双歧杆菌和动物双歧杆菌(2g，活菌数为0.5
×
10
13
cfu/g)，长双歧杆菌组受试者每日午餐后1小时内服用独立包装的长双歧杆菌(2g，活菌数为0.5
×
10
13
cfu/g)，动物双歧杆菌组受试者每日午餐后1小时内服用独立包装的长双歧杆菌(2g，活菌数为0.5
×
10
13
cfu/g)，安慰剂组受试者每日午餐后1小时内服用安慰剂粉末(烘干多孔糊精2g)，连续服用28天。所有人群在试验前和试验期间所食用的食物均保持一致。服用益生菌或安慰剂第28天采集受试者的血液样品，并对其进行高速离心获取血清进行免疫指标检测。
35.(2)血清中特异性ige测定：利用酶联免疫吸附法(elisa法)进行测定。小麦醇溶蛋白用pbs稀释至15μg/ml，然后将其固定在96孔板中4℃过夜，用200μl pbs洗涤3次，在25℃下，用200μl 5％bsa封闭2h。之后，将平板洗涤3次并与100μl 10位受试者的血清(1:30稀释)，并在37℃下孵育1.5小时，并使用非过敏血清作为阴性对照。洗涤3次后，每孔加入100μl hrp偶联山羊抗人ige(1:5000)，37℃孵育1.5小时。然后每孔加入100μl四甲基联苯胺溶液，37℃孵育15分钟。50μl 2m h2so4溶液终止显色反应。使用酶标仪(molecular devices，usa)在450nm处测量每个孔的光学密度。
36.结果如图3所示，与对照组相比，安慰剂组食物过敏人群血清中组胺水平无显著变化，长双歧杆菌和动物双歧杆菌的益生菌组干预28天益生菌组食物过敏人群血清中组胺水平显著低于对照组与安慰剂组，长双歧杆菌组干预28天益生菌组食物过敏人群血清中组胺水平低于对照组与安慰剂组，但总体水平不高。说明动物双歧杆菌、长双歧杆菌组和益生菌组均能干预对食物过敏具有调节作用，能调节或改善人体肠道环境达到抗过敏的作用，但三者效果并不相同，并且益生菌组与长双歧杆菌组和动物双歧杆菌有显著性差异，说明长双歧杆菌与动物双歧杆菌具有协同作用，比单一长双歧杆菌组和动物双歧杆菌的作用具有更好的效果。
37.实施例5
38.(1)以14名食物过敏患者为研究对象，将10名患者随机分为对照组(3人)、安慰剂组(3人)、益生菌组(4人)、长双歧杆菌组(4人)和动物双歧杆菌组(4人)。受试期间，益生菌组受试者每日午餐后1小时内服用独立包装的1：1混合长双歧杆菌和动物双歧杆菌(4g，活菌数为1
×
10
13
cfu/g)，长双歧杆菌组受试者每日午餐后1小时内服用独立包装的长双歧杆菌(4g，活菌数为1
×
10
13
cfu/g)，动物双歧杆菌组受试者每日午餐后1小时内服用独立包装的长双歧杆菌(4g，活菌数为1
×
10
13
cfu/g)，安慰剂组受试者每日午餐后1小时内服用安慰剂粉末(烘干多孔糊精4g)，连续服用28天。所有人群在试验前和试验期间所食用的食物均保持一致。服用益生菌或安慰剂第28天采集受试者的血液样品，并对其进行高速离心获取血清进行免疫指标检测。
39.(2)血清中组胺测定：血清中组胺的测定采用人组胺elisa试剂盒(购于thermo fisher scientific)，按照其说明书进行测定，在450nm处测定各孔的吸光度od值。
40.结果如图4所示，与对照组相比，安慰剂组食物过敏人群血清中组胺水平无显著变化，长双歧杆菌和动物双歧杆菌的益生菌组干预28天益生菌组食物过敏人群血清中组胺水平显著低于对照组与安慰剂组，长双歧杆菌组干预28天益生菌组食物过敏人群血清中组胺
水平低于对照组与安慰剂组，但总体水平不高。说明动物双歧杆菌、长双歧杆菌组和益生菌组均能干预对食物过敏具有调节作用，能调节或改善人体肠道环境达到抗过敏的作用，但三者效果并不相同，并且益生菌组与长双歧杆菌组和动物双歧杆菌有显著性差异，说明长双歧杆菌与动物双歧杆菌具有协同作用，比单一长双歧杆菌组和动物双歧杆菌的作用具有更好的效果。
41.综上，本发明实施例的长双歧杆菌和动物双歧杆菌能够显著食物过敏患者过敏反应特异性抗体ige和血清中组胺含量，从而缓解过敏反应。因此，该长双歧杆菌和动物双歧杆菌可用于缓解食物过敏反应。
42.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
43.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。