一种治疗肾炎的化学成分及其制备工艺、医药用途和组合物的制作方法

1.本发明涉及一个具有治疗肾炎作用的新的薄荷烷型单帖类化学成分(1r,3r,4s)-3-甲氧基-薄荷-1，3，7-三醇和(1s,3s,4r)-3-甲氧基-薄荷-1，3，7-三醇和含有该成分的挥发油，提取物及其制备工艺、医药用途和组合物。


背景技术：

2.肾脏是药物代谢和排泄的重要器官，是人体的“血筛子”。急性肾损伤(acute kidney injury，aki)，又称急性肾功能衰竭，是由各种病因引起肾功能急速下降的一种临床综合征，起病急、进展快、死亡率高，严重威胁着人类健康。aki短期内可引起严重的内环境紊乱而危及生命，远期亦可造成不可逆的肾功能损害引起慢性肾功能衰竭，需要引起高度重视。如何切实有效地预防和减轻急性肾损伤，以防肾损伤进一步恶化和发展，寻找特异的治疗靶点，开发有效的预防和治疗药物则显得尤为迫切和重要。
3.流行病学资料显示：每年约有1330万人发生aki，由于诊断和治疗的延误导致约170万人死亡。约20％～34％的急性肾功能衰竭患者与应用肾毒性药物有关，由于目前因药种类繁多，加之药物滥用问题严重，药物引起的急慢性肾功能衰竭日益增多。药物性肾损伤已严重威胁到了人类健康和生命，保护肾脏健康已是摆在我们面前的一个刻不容缓的任务。
4.现代医学并无治疗肾损伤的特异性药物，多采用去除病因、维持内环境稳定、营养支持、处理并发症和血液净化治疗等。当前应用中草药及其制剂治疗肝脏疾病在我国已相当普遍，现代药理研究表明很多中药(包括复方、单味药材及单体成分)均能有效治疗或改善肾损伤疾病，且中药以其多组分、多途径、多靶点的综合作用在治疗急性肾损伤方面具有较大的优势和广阔的临床应用前景。
5.白豆蔻为姜科植物白豆蔻amomum kravanh pjerre ex gagne p.的干燥成熟果实，白豆蔻为芳香化湿药，具有化湿行气、温中止呕的功效，主治湿阻所滞、脾胃不和、脘腹胀满、不思饮食、湿温初起、胸闷不饥、胃寒呕吐、食积不消。白豆蔻挥发油主要成分含桉油精、α-律草烯、β-蒎烯、α-蒎烯、α-荜澄茄烯、百里香素等19个化合物。现代药理研究表明，白豆蔻能增加胃黏膜血流、提高血清胃泌素水平和增强胃黏膜组织抗自由基损伤，抗氧化作用，驱蚊、抗氧化、抗失眠、抗菌等功效。白豆蔻是临床最常用蒙、中药之一。蒙医主要用于肾“赫依”，慢性肾病，肾“达日干”，气郁宫中，失眠、消化不良、尿闭、游痛症、肾虚腰痛等症。
6.然而，在急性肾损伤治疗领域对于白豆蔻的研究在国内外未见报道。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一个具有治疗肾炎作用的新的薄荷烷型单帖类化学成分3-methoxy-p-menth-1,3,7-triol{(3-甲氧基-薄荷-1，3，7-三醇}和含有该成分的挥发油及其制备工艺、医药用途和组合物。其医药用途为治疗急慢性肾炎、糖尿病肾病等肾损伤。
8.本发明提供具有治疗肾炎作用的具有式i，式ii结构的化合物或其消旋体，其中式
i化合物的化学名称为(1r,3r,4s)-3-甲氧基-薄荷-1，3，7-三醇；式ii化合物的化学名称为(1s,3s,4r)-3-甲氧基-薄荷-1，3，7-三醇
[0009][0010]
本发明还提供含式i和式ii化合物或其消旋体的白豆蔻挥发油，其特征为，3-甲氧基-薄荷-1，3，7-三醇含量为0.1％-99.8％。
[0011]
本发明还提供含有式i和式ii化合物或其消旋体的白豆蔻提取物。其特征为，提取物中3-甲氧基-薄荷-1，3，7-三醇含量为0.1％-99.8％。
[0012]
本发明还提供含有所述的式i和式ii化合物或其消旋体，或含有白豆蔻挥发油，或含有白豆蔻提取物的药物组合物，所述药物组合物选自：片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、口服液、凝胶剂和注射剂。
[0013]
本技术涉及的白豆蔻挥发油，其制备方法包括利用水或者有机溶剂提取制得，其中有机溶剂为乙醇，乙酸乙酯，最优为乙醇；乙醇所用体积百分浓度为10％-100％；
[0014]
所述挥发油的制备方法，其特征为：水蒸气蒸馏或超临界co2萃取法。水蒸气蒸馏的最佳提取工艺优选为提取时间为5h，料液比为1:15，浸泡时间为8h；超临界co2萃取最佳提取工艺条件为萃取压力为35mpa，萃取温度为35℃，co2流量为20lh-1
。
[0015]
超临界co2萃取最佳提取工艺条件为萃取压力为30-35mpa，萃取温度为15-50℃，co2流量为5-100lh-1
。最优参数为：超临界co2萃取最佳提取工艺条件为萃取压力为35mpa，萃取温度为30℃，co2流量为20lh-1
；超临界co2精馏最佳制备工艺为粒径硅胶填料150-250μm的精馏柱，温度分布为56-72℃、co2流量为2.5kg/h、在15mpa下收集挥发油。
[0016]
所述的白豆蔻提取物的制备方法。其特征为，提取物中利用水或者有机溶剂提取，经大孔树脂精制，沉淀等工艺制得，其中提取有机溶剂为乙醇，乙酸乙酯，最优为乙醇；乙醇所用体积百分浓度为10％-100％；大孔树脂工艺特征为2-20倍量大孔树脂，白豆蔻提取物水悬浮湿法上样或者干法拌样，水和低浓度乙醇洗脱除杂质，继用高浓度乙醇洗脱得到提取物，其中除杂质洗脱液为0％-50％乙醇，最优为5-15％乙醇；高浓度洗脱液为40％-100％乙醇，优化为60％-95％乙醇，最优为65％-95％乙醇。
[0017]
3-甲氧基-薄荷-1，3，7-三醇单体化合物的制备方法，其特征在于：上述制备的白豆蔻挥发油为原料，经大孔树脂，或者硅胶柱色谱，ods柱色谱，制备高效液相色谱精制制得。其特征为：用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂(石油醚-乙酸乙酯，100:2，体积比)洗脱5个柱体积，继用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂(石油醚-乙酸乙酯，100:8，体积比)洗脱10个柱体积，石油醚-乙酸乙酯100:8洗脱液经回收有机溶剂，干燥。再经ods色谱柱分离，先用60％的甲醇水洗脱4个柱体积，再用90％的甲醇水洗脱6个柱体积，90％的甲醇水洗脱液经回收有机溶剂，干燥后，用制备液相色谱88％等度甲醇水制备得纯品。
[0018]
所述的白豆蔻挥发油的医药用途，其特征为：在治疗急性肾损伤、慢性肾损伤、糖
尿病肾病中的作用。其特征为，可改善肾脏损伤，调控炎症介质，降低血清肌酐、血清尿素氮、尿蛋白浓度，抑制肾组织细胞凋亡，改善肾炎引起的肾组织中脂质过氧化反应及氧化应激反应的异常。
[0019]
本发明首次揭示：白豆蔻挥发油对庆大霉素诱导的和5/6肾切除导致的大鼠急性肾损伤具有明显的保护作用。该研究在国内外未见报道，其成果对开发aki预防和治疗药物具有重大的现实意义。
附图说明
[0020]
图1水蒸气蒸馏法制备白豆蔻挥发油气相色谱图
[0021]
图2超临界co2萃取法制备白豆蔻挥发油气相色谱图
[0022]
图3超临界co2精馏法制备白豆蔻挥发油气相色谱图
[0023]
图4单体化合物薄层色谱图
[0024]
图5化合物3-甲氧基-薄荷-1，3，7-三醇的结构及主要的hmbc关系(
“→”
：hmbc相关)
[0025]
图6 1
h-nmr核磁共振谱
[0026]
图7 13
c-nmr核磁共振谱
[0027]
图8 dept核磁共振谱
[0028]
图9 hmqc核磁共振谱
[0029]
图10 hmbc核磁共振谱
[0030]
图11 1
h-1
h cosy核磁共振谱
[0031]
图12白豆蔻挥发油对大鼠的肾脏外观形态的影响，图中a空白对照组、b模型组、c挥发油低剂量组、d挥发油中剂量组、e挥发油高剂量组、f维拉帕米阳性药组。
[0032]
图13大鼠肾组织he染色(200
×
)，图中a空白对照组、b模型组、c挥发油低剂量组、d挥发油中剂量组、e挥发油高剂量组、f维拉帕米阳性药组。
[0033]
图14大鼠肾组织中mda含量测定结果。与模型组相比**p《0.01,*p《0.05；与正常组相比#p《0.05。
[0034]
图15大鼠肾组织中sod活力测定结果。与模型组相比*p《0.05；与正常组相比#p《0.05。
[0035]
图16大鼠肾组织中gsh-px活力测定结果。与模型组相比*p《0.05；与正常组相比##p《0.01。
[0036]
图17大鼠肾组织中nos活力测定结果。与模型组相比**p《0.01,*p《0.05；与正常组相比##p《0.01。
[0037]
图18大鼠肾组织中no含量测定结果。与模型组相比*p《0.05；与正常组相比#p《0.05。
[0038]
图19白豆蔻挥发油对nf-кb p65，caspase-3，bax，bcl-2表达的影响。图中a为nf-кb p65，caspase-3，bax，bcl-2蛋白表达图、b为nf-кb p65蛋白表达的定量分析、c为caspase-3蛋白表达的定量分析、d为bcl-2蛋白表达的定量分析、e为bax蛋白表达的定量分析。
[0039]
图20白豆蔻挥发油对5/6肾脏切除后尿蛋白、血清肌酐、尿素氮水平的影响
[0040]
图21肾脏组织病理学检测
[0041]
图22肾脏皮质部中mcp-1,α-sma及tgf-β1的表达
[0042]
图23肾脏髓质部中mcp-1,α-sma及tgf-β1的表达
[0043]
图24白豆蔻可降低ckd大鼠p38mapk/nf-κb通路相关蛋白的表达
具体实施方式
[0044]
下面仅以实施例的方式结合附图对本发明作进一步的说明。
[0045]
实施例1水蒸气蒸馏法制备白豆蔻挥发油的工艺研究
[0046]
1.实验方法
[0047]
1.1白豆蔻水蒸气蒸馏法挥发油的提取
[0048]
将白豆蔻用粉碎机将其粉碎，称取粉碎后的白豆蔻50g，置于2000ml圆底烧瓶中，加入一定量的水，接于水蒸气蒸馏装置上，持续蒸馏相应时间，提取白豆蔻挥发油。
[0049]
1.2正交实验
[0050]
以白豆蔻挥发油得率为指标，对提取时间、料液比、浸泡时间进行3因素3水平l9(33)正交实验，优化提取工艺，各因素水平表见表1。
[0051]
表1正交实验因素水平表
[0052][0053]
2.结果与讨论
[0054]
2.1正交实验结果
[0055]
按照1.2中正交实验优化白豆蔻挥发油的提取工艺，计算考察指标下个因素水平的平均值和极差，正交实验结果如表2所示。
[0056]
表2正交实验结果分析表
[0057][0058]
根据表2的极差分析结果显示，浸泡时间对白豆蔻挥发油的提取结果影响最大，其次是提取时间，料液比对提取结果影响最小。通过直观分析得出的最优组合为a3b2c3，即白豆蔻挥发油的最佳提取工艺条件为提取时间为5h，料液比为1:15，浸泡时间为8h。
[0059]
2.2验证实验
[0060]
为验证正交实验的准确性，将正交实验所得最优组合a3b2c3与正交实验中白豆蔻挥发油得率最高的5号组合a2b2c3进行对比验证实验，验证结果如表3所示。
[0061]
表3验证结果分析表
[0062][0063]
通过对比验证实验发现，正交实验得到的最优组合a3b2c3的挥发油得率高于正交表中挥发油得率最高的5号组合a2b2c3。这说明正交实验筛选出来的条件组合a3b2c3为最优提取条件。因此，白豆蔻挥发油的最佳提取工艺条件为提取时间为5h，料液比为1:15，浸泡时间为8h；其气相色谱图如图1所示，3-甲氧基-薄荷-1，3，7-三醇单体浓度为0.118mg/ml。
[0064]
实施例2超临界co2法制备白豆蔻挥发油的工艺研究
[0065]
1.实验方法
[0066]
1.1白豆蔻超临界co2萃取法挥发油的提取
[0067]
将白豆蔻用粉碎机将其粉碎，称取粉碎后的白豆蔻100g，装填入萃取釜进行超临界co2萃取，控制好萃取过程中的压力、温度、co2流量等相关萃取参数。萃取完毕后，减压分离，从分离釜下端收集口收集提取得到的白豆蔻挥发油，放置于棕色样品瓶中，4℃保存。
[0068]
1.2正交实验
[0069]
以白豆蔻挥发油得率为指标，对萃取压力、萃取温度、co2流量进行3因素3水平l9(33)正交实验，优化提取工艺，各因素水平表见表1。
[0070]
表4正交实验因素水平表
[0071][0072]
2.结果与讨论
[0073]
2.1正交实验结果
[0074]
按照1.2中正交实验优化白豆蔻挥发油的提取工艺，计算考察指标下个因素水平的平均值和极差，正交实验结果如表5所示。
[0075]
表5正交实验结果分析表
[0076][0077][0078]
根据极差分析结果显示，萃取压力对白豆蔻挥发油的提取结果影响最大，其次是co2流量，萃取温度对提取结果影响最小。通过直观分析得出的最优组合为a3b2c3，即白豆蔻挥发油的最佳提取工艺条件为萃取压力为35mpa，萃取温度为35℃，co2流量为20l
·
h-1
。
[0079]
2.2验证实验
[0080]
为验证正交实验的准确性，将正交实验所得最优组合a3b2c3与正交实验中白豆蔻挥发油得率最高的9号组合a3b3c2进行对比验证实验，验证结果如表6所示。
[0081]
表6验证结果分析表
[0082][0083]
通过对比验证实验发现，正交实验得到的最优组合a3b2c3的挥发油得率高于正交表中挥发油得率最高的9号组合a3b3c2。这说明正交实验筛选出来的条件组合a3b2c3为最优提取条件。因此，白豆蔻挥发油的最佳提取工艺条件为萃取压力为35mpa，萃取温度为35℃，co2流量为20l
·
h-1
；气相色谱图如图9所示其气相色谱图如图1所示，3-甲氧基-薄荷-1，3，7-三醇单体浓度为0.207mg/ml。
[0084]
实施例3超临界co2精馏法制备白豆蔻挥发油
[0085]
首先将50g白豆蔻提取物加入萃取釜中，分别设定萃取釜温度为50℃、精馏柱温度范围为56-72℃。待温度达到设定温度后，利用高压泵将co2压入体系中，维持co2流量2.5kg/h，调节分离压力为15mpa。超临界co2从底部流入萃取釜溶解原料，携带原料自下而上流经精馏柱，分离的馏分从柱顶流出进入分离釜中，卸去压力，精油组分析出，co2循环利用，制备的白豆蔻精油气相色谱图如图10所示，3-甲氧基-薄荷-1，3，7-三醇单体浓度为0.975mg/ml。
[0086]
实施例4白豆蔻挥发油特征成分新薄荷烷型单帖类化合物
[0087]
3-methoxy-p-menth-1,3,7-triol的制备和表征
[0088]
将白豆蔻用粉碎机将其粉碎，称取粉碎后的白豆蔻100g，装填入萃取釜进行超临界co2萃取，按最佳提取工艺条件为萃取压力为35mpa，萃取温度为35℃，co2流量为20l
·
h-1
。。萃取完毕后，减压分离，从分离釜下端收集口收集提取得到的白豆蔻挥发油，放置于棕色样品瓶中，4℃保存。然后挥发油用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂(石油醚-乙酸乙酯，100:2，体积比)洗脱5个柱体积，继用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂(石油醚-乙酸乙酯，100:8，体积比)洗脱10个柱体积，石油醚-乙酸乙酯100:8洗脱液经回收有机溶剂，干燥。再经ods色谱柱分离，先用60％的甲醇水洗脱4个柱体积，再用90％的甲醇水洗脱6个柱体积，90％的甲醇水洗脱液经回收有机溶剂，干燥后，用制备液相色谱88％等度甲醇水制备得纯品。
[0089]
该单体成分为淡黄色油状物，紫外灯下无暗斑(254nm)，分子式：c
11h22
o4；gf254硅胶分析薄层，石油醚：乙酸乙酯＝8：1展开，rf＝6.1,经10％的香草醛-浓硫酸显示为深绿色(图4)，1h-nmr(chloroform-d,400mhz)和
13
c-nmr(chloroform-d,100mhz)数据及结果如下(图5-11)：
[0090]1h-nmr和
13
c-nmr数据显示了以下特征信号：4个甲基质子信号：[δh3.36(s,3h),1.24(s,6h),1.05(s,3h)；δc,30.9(c-8),28.9(c-9),27.6(c-10),55.1(och3)],[1.24(s,6h)；30.9(c-8),28.9(c-9)]信号显示这两个甲基可能处在同一个化学环境中；[δh 3.36(s,3h),55.1(och3)]信号显示这个甲基和氧原子相连；三个连氧季碳信号[δc,69.8(c-1),97.5(c-3),73.6(c-6)]。结合以上数据，初步推断该化合物为薄荷烷型单帖类化合物。此外，hmbc结果显示：h-5/c-7；h-8,h-9/c-7；h-10/c-1,c-2,c-6；och3/c-3相关，确定该化合
物为新的薄荷烷型单帖类化合物：3-methoxy-p-menth-1,3,7-triol。经过手型柱色谱拆分，发现该化合物为部分消旋体，-1.6(c 1.7,ch3oh)，包含(1r,3r,4s)-3-methoxy-p-menth-1,3,7-triol{(1r,3r,4s)-3-甲氧基-薄荷-1，3，7-三醇}和(1s,3s,4r)
--
3-methoxy-p-menth-1,3,7-triol{(1s,3s,4r)-3-甲氧基-薄荷-1，3，7-三醇}的对应异构体，其旋光值分别为其旋光值分别为
[0091]
表7.3-methoxy-p-menth-1,3,7-triol的1h-nmr和
13
c-nmr数据(400mhz,100mhz)(chloroform-d,δppm,j in hz)
[0092][0093]
实施例5白豆蔻挥发油对庆大霉素诱导的急性肾损伤肾功能的影响
[0094]
1材料、试剂及仪器
[0095]
1.1动物
[0096]
雄性清洁级sd大鼠，体重200～250g，购自新疆医科大学。实验前，所用动物均适应性饲养一周，饲养于温度湿度通风良好的动物房，不限制饮水及进食。
[0097]
1.2主要材料与试剂
[0098]
白豆蔻挥发油(按实施例3制备)；硫酸庆大霉素注射液(批号：1804164)：河南润红制药股份有限公司；维拉帕米(批号：180201)：天津市中央药业有限公司；一氧化氮合成酶(nos)(批号：20190226)、肌酐(cr)(批号：20190307)、一氧化氮(no)(批号：20190307)、尿素氮(bun)(批号：20190308)、超氧化物歧化酶(sod)(批号：20190308)、丙二醛(mda)(批号：20190308)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)(批号：20190308)、尿蛋白(批号：20190311)测试剂盒：南京建成生物工程研究所；caspase3抗体(批号：0911412da9488120)、bax抗体(批号：13cm400a)、nf-кb p65抗体(批号：bm3940)、bcl-2抗体(批号：196841)：博士德公司；β-actin抗体(批号：16a00205)、山羊抗兔抗体(批号：129256)、山羊抗小鼠抗体(批号：127655)：北京中杉金桥生物技术有限公司。
[0099]
1.3主要仪器
[0100]
legend micro 21r高速冷冻离心机(thermo fisher)、gt200震动球磨仪(上海净信)、power wave xs2酶标仪(美国bio-rad公司)、dycz-24dn制胶器(北京六一生物科技有
限公司)、axio imager 2光学显微仪(zeiss)、co2培养箱(thermo scientific公司)、dycz-40d型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。
[0101]
2实验方法
[0102]
白豆蔻挥发油按实施例3制备。给药时，取适量挥发油用0.5％的cmc-na溶液和2％的吐温-80溶液5∶1混合稀释使用。
[0103]
sd雄性大鼠，随机分成7组，每组10只，分别为空白对照组(挥发油稀释液)、模型组(挥发油稀释液)、白豆蔻挥发油低、中、高剂量组(低：62.5mg/kg/d；中：125mg/kg/d；高：250mg/kg/d)、白豆蔻提取物组(25g/kg/d)、维拉帕米阳性药组(维拉帕米：15mg/kg/d)。除空白对照组大鼠注射生理盐水外，其余各组均每天腹腔注射庆大霉素(140mg/kg/d)一次，连续7天，制备急性肾衰模型。第8天起，灌胃给药，空白组和模型组给予溶剂，白豆蔻挥发油低、中、高各组给予相应剂量的白豆蔻挥发油，阳性药组给予维拉帕米溶液，连续给药28天。
[0104]
在实验第7天，大鼠禁食不禁水24h，收集大鼠尿液，第8天给药24h后收集血液(眼眶采血)。实验35天，大鼠禁食不禁水24h，收集大鼠尿液，第36天给药24h后腹主动脉取血，将血液在4℃条件下4000r/min，离心10min，取血清备用。取血后将大鼠处死，迅速取两侧全肾，称重，右肾固定在10％中性福尔马林中，备用。所有尿液、血清和左肾样本均置于－80℃冰箱中冻存，待检。
[0105]
3指标检测
[0106]
取尿液及血液样本，对尿蛋白、scr、bun含量进行检测；取右肾组织进行苏木素-伊红(he)染色，光学显微镜下观察；取左肾组织样本，制备10％肾皮质匀浆，对mda、no含量及sod、nos，gsh-px活性进行检测；取左肾组织样本，制备肾组织匀浆，提取蛋白，用bca法进行蛋白质定量，westem blot法检测肾组织匀浆nf-кb p65，caspase-3，bax，bcl-2蛋白的表达，β-actin为内参，ecl显色，拍照，imagej图像分析软件测定条带的光密度，计算灰度值。
[0107]
4.统计学处理各组数据采用均数
±
标准差表示，采用spss 17.0统计软件分析处理数据，采用单因素方差分析进行组间比较，p《0.05认为有统计学差异。
[0108]
5实验结果
[0109]
5.1白豆蔻挥发油对庆大霉素损伤大鼠肾体指数的影响
[0110]
与空白对照组相比，模型组大鼠肾体指数显著增高(p《0.05)，提示肾脏受损；与模型组相比，维拉帕米阳性药组大鼠肾体指数显著降低，说明维拉帕米能有效缓解庆大霉素所致的急性肾损伤；同维拉帕米一样，白豆蔻挥发油中、高剂量组和白豆蔻提取物组大鼠肾体指数均显著降低(p《0.05)，表明白豆蔻挥发油和白豆蔻提取物具有抗急性肾损伤活性。各组肾体指数结果见表8及图13。
[0111]
表8白豆蔻挥发油对大鼠的肾脏指数的影响
[0112][0113]
注：与模型组相比*p《0.01；与空白对照组相比，##p《0.05。
[0114]
5.2白豆蔻挥发油对庆大霉素损伤大鼠肾脏组织病理学分析
[0115]
he染色后可发现与空白对照组比较，模型组大鼠右肾组织病变明显，肾小管上皮细胞具有明显的病变，肾小管出现高度扩张，坏死严重；与模型组比较，除挥发油低剂量外，其余每组肾小管损伤有所减轻，其中挥发油高剂量组减轻效果最好。各组大鼠右肾组织病理切片见图13。
[0116]
5.3白豆蔻挥发油对庆大霉素损伤大鼠尿蛋白、血清scr和bun的影响
[0117]
与空白对照组相比，模型组大鼠尿蛋白、血清尿素氮及血清肌酐含量均显著升高(p《0.05)，造模成功；与模型组相比，维拉帕米阳性药组大鼠血清中的尿素氮和肌酐显著降低，说明维拉帕米能有效缓解庆大霉素所致的急性肾损伤；同维拉帕米一样，与模型组相比，白豆蔻挥发油中、高各剂量组，白豆蔻提取物组大鼠血清尿素氮及血清肌酐含量均显著降低(p《0.05)，表明白豆蔻挥发油和白豆蔻提取物具有抗急性肾损伤活性。各组大鼠血清尿蛋白、尿素氮及血清肌酐测定结果见表9。
[0118]
表9白豆蔻挥发油对大鼠的尿蛋白、血清尿素氮及血清肌酐的影响
[0119][0120]
注：与空白对照组相比#p《0.05；与模型组相比*p《0.05。
[0121]
5.4白豆蔻挥发油对庆大霉素损伤大鼠右肾组织中mda、no含量及gsh-px、sod和nos活力的影响。
[0122]
与空白对照组相比，模型组mda含量显著升高(p《0.05)，而sod活性显著降低(p《0.05)，白豆蔻挥发油中、高各剂量组，白豆蔻提取物组及维拉帕米阳性药组对大鼠肾组织mda含量的升高具有显著降低作用，并且对sod活性的降低亦有明显的恢复作用。与空白对照组相比，模型组肾组织gsh-px活性显著降低(p《0.05)，白豆蔻挥发油中、高各剂量组，白豆蔻提取物组及维拉帕米阳性药组大鼠对庆大霉素所致的gsh-px活性的降低有明显升高作用，与模型组比较具有显著性(p《0.05)。与对照组相比，模型组肾组织no含量和nos活性显著增加(p《0.05)，白豆蔻挥发油中、高各剂量组，白豆蔻提取物组及维拉帕米阳性药组大鼠对庆大霉素所致的no含量的升高有明显降低作用，与模型组比较具有显著性(p《0.05)；白豆蔻挥发油低、中、高各剂量组，白豆蔻提取物组及维拉帕米阳性药组大鼠对庆大霉素所致的nos活力的升高有明显降低作用，与模型组比较具有显著性(p《0.05)，表明白豆蔻挥发油可以通过减轻脂质过氧化反应，清除自由基来保护肾组织。各组mda、no含量及sod、gsh-px、nos活力测定结果见表10和图14-18。
[0123]
表10白豆蔻挥发油对肾组织中mda、no含量及sod、gsh-px、nos活力的影响
[0124][0125]
注：与模型组相比**p《0.01,*p《0.05；与空白对照相比#p《0.05；##p《0.01。5.5白豆蔻挥发油可抑制庆大霉素引起的肾组织细胞凋亡
[0126]
与空白对照组相比，模型组大鼠肾组织中nf-кb p65，caspase-3，bax蛋白表达显著增高(p《0.05)，bcl-2蛋白表达显著降低(p《0.05)，白豆蔻挥发油中、高各剂量组及阳性药组与模型组相比nf-кb p65，caspase-3，bax蛋白表达显著下降(p《0.05)，bcl-2蛋白表达显著升高(p《0.05)，说明白豆蔻挥发油抑制了nf-кb p65、caspase-3、bax蛋白的表达，促进了bcl-2蛋白的表达，表明白豆蔻挥发油可以通过抑制肾组织凋亡，来减轻庆大霉素诱导的肾损伤，并保护肾功能。各组nf-кb p65、caspase-3、bax蛋白的表达水平见图19。
[0127]
综上所述，白豆蔻挥发油具有明显的肾保护作用，可显著抑制庆大霉素引起的肾功能下降，减轻肾组织病理损伤，抑制肾组织细胞凋亡，减轻脂质过氧化反应，清除自由基来保护肾组织。因此，白豆蔻挥发油有望成为临床aki患者的预防和治疗药物。
[0128]
实施例6白豆蔻挥发油对5/6肾切除大鼠模型的肾功能的影响
[0129]
5.1试验方法
[0130]
本研究使用ckd大鼠(体重200-250g)，在12小时的明暗循环下，随意给予标准的啮齿动物食物和自来水。将大鼠随机分为5组:1组为5/6nx组(n＝10)，除切除右肾外，切除左肾上、下极；2-4组为白豆蔻挥发油治疗5/6nx组(wc组)，分别腹腔注射2.5、5、10mg/kg白豆蔻挥发油(按实施例3制备)(5/6nx 2.5、5、10mg/kg)；n＝10)；5组为对照组(n＝10)，行假手术。连续治疗4周后，实验结束，手术在水合氯醛溶液麻醉(350mg/kg,ip)下进行。对病理组织及其他生化指标进行检测。
[0131]
5.2白豆蔻挥发油对肾脏功能指标的影响
[0132]
我们对肾脏功能型指标尿蛋白、血清肌酐、尿素氮进行了检测，结果显示白豆蔻挥发油能够显著的下调由于5/6肾脏切除所引起的尿蛋白、血清肌酐、尿素氮的升高(图20)，这表明白豆蔻挥发油能够有效的保护由于5/6肾脏切除所导致的肾功能损伤。
[0133]
5.3肾脏组织病理学检测
[0134]
进一步，我们对肾脏组织进行了病理学检测。经he染色后发现，ckd大鼠肾小球会出现膨大或萎缩的现象，且肾小管管腔会扩大，白豆蔻挥发油可轻微改善其病理改变(图21)。这表明白豆蔻挥发油能够对肾脏组织具有一定的保护功能。
[0135]
5.4肾脏皮质部和髓质部中mcp-1,α-sma及tgf-β1的表达
[0136]
进一步对肾脏中皮质部和髓质部中mcp-1,α-sma及tgf-β1的表达情况进行了分析。组织免疫组化结果显示，模型组中炎症因子α-sma和纤维化因子mcp-1、tgf-β1显著升高，提示炎症和纤维化得发生。白豆蔻挥发油治疗组中，能够剂量依赖的抑制相关因子的表达(图22，23)，提示白豆蔻挥发油能够对5/6肾所致的大鼠的炎症和纤维化有改善作用。
[0137]
5.5白豆蔻挥发油可降低ckd大鼠p38mapk/nf-κb通路相关蛋白的表达
[0138]
为了进一步明确白豆蔻挥发油潜在的分子作用机制，我们利用蛋白免疫印迹检测了相关的信号通路，结果显示白豆蔻挥发油的治疗可以显著的抑制p38mapk/nf-κb通路炎症相关蛋白表达(图24)，结果提示白豆蔻挥发油对5/6肾切除大鼠所致的炎症有较好的抑制作用，通过抑制p38mapk/nf-κb通路炎症发挥肾脏保护作用。