血清素4受体激动剂对抗应激的预防功效的制作方法

血清素4受体激动剂对抗应激的预防功效
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年4月9日提交的美国临时专利申请第62/831,517号、2019年6月4日提交的美国临时专利申请第62/857,075号和2019年10月4日提交的美国临时专利申请第62/910,859号的优先权，所述临时专利申请中的每一者通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本发明涉及血清素4受体(5-羟色胺(血清素)受体4或5-ht4r)激动剂组合物及其在治疗或预防应激诱发的情感障碍如创伤后应激障碍(ptsd)的方法中的用途。在某些方面，本发明组合物可在应激源之前施用。
4.发明背景
5.应激暴露是造成重度抑郁症(mdd)和创伤后应激障碍(ptsd)发展的重要因素。根据国家合并症研究(national comorbidity study)，大约60％的男性和51％的女性在其一生中曾接触过一次或多次创伤性事件。据估计，总人口中有7.8％在其生命中的某个时段经历过ptsd，其中女性(10.4％)的患病率明显高于男性(5.0％)[1]。女性患应激相关焦虑症或抑郁症的风险是男性的2-3倍[61]。传统上，情感障碍是通过症状抑制方法来治疗的。现有药物旨在减轻这些慢性疾病的影响，但不能治愈或预防疾病本身。然而，如果开发出增强应激韧性(stress resilience)的药物，则它们就有可能用于风险人群，以防止应激诱发的精神病症。
[0006]
焦虑症是最常见的精神病症之一，其终生患病率超过25％(a1)并且每年的经济负担超过400亿美元(a2)。苯二氮卓类药物(bzd)可有效治疗大多数焦虑症并且多年来一直是标准治疗方法，在减少患者的急性焦虑方面有超过80％的应答(a3)。然而，它们的长期日常使用与依赖和健忘症的风险相关。因此，它们通常被血清素能剂如选择性血清素再摄取抑制剂(ssri)慢性治疗所取代，指出血清素(5-ht)在治疗焦虑症方面的作用。然而，由于ssri的起效延迟数周并且在焦虑患者中的无应答率为40％(a4)，因此需要开发新型速效抗焦虑药。
[0007]
我们和其他人最近报道，(r,s)-氯胺酮在小鼠中应激前1周施用时，可作为一种增强韧性的药物(例如预防剂)来对抗应激[2-6]。此外，人类患者的有限数据表明，(r,s)-氯胺酮有可能预防精神病症如ptsd[7]以及或许以剂量特异性方式预防产后抑郁(ppd)[8,9]。预防性药物功效仅限于(r,s)-氯胺酮，直到最近gould及其同事报道，ii组代谢型谷氨酸受体(mglu
2/3
)拮抗剂也具有保护作用[10]。我们之前曾报道过ssri flx作为预防剂无效，但其他血清素能药物是否可作为有效的预防剂和/或血清素能系统是否涉及预防功效仍有待确定。
[0008]
5-ht4r是用于治疗抑郁症和焦虑症的有希望的靶标。5-ht4r是代谢型g蛋白偶联受体，其响应于5-ht而刺激gs/环状单磷酸腺苷(camp)/蛋白激酶a(pka)信号通路[11-15]。5-ht4r在外周(包括心脏和肾上腺)中以及大脑中例如杏仁核(amg)、内侧前额叶皮层(mpfc)、伏隔核(nac)和海马体(hpc)的区域中高度表达[16,17]。5-ht4r基因敲除小鼠显示出增加
的焦虑样行为和抑郁样行为，而5-ht4r的激活刺激hpc中的神经发生并产生快速作用的抗抑郁样效应[18-21]。然而，5-ht4r是否以及如何参与应激韧性还有待确定。
[0009]
对有效的预防性疗法以预防应激诱发的情感障碍的发作存在未满足的需求。


技术实现要素：

[0010]
本公开提供了一种用于在有需要的受试者中预防或延迟应激诱发的情感障碍或应激诱发的精神机能障碍的方法。所述方法可包括在应激源之前向受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含血清素4受体(5-ht4r)的激活剂(例如，血清素4受体(5-ht4r)的激动剂)，或其药学上可接受的盐、类似物、衍生物或代谢物。
[0011]
本公开还提供了一种用于在有需要的受试者中诱导和/或增强应激韧性的方法。所述方法可包括在应激源之前向受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含血清素4受体(5-ht4r)的激活剂(例如，血清素4受体(5-ht4r)的激动剂)，或其药学上可接受的盐、类似物、衍生物或代谢物。
[0012]
5-ht4r的激动剂可包括1-(4-氨基-5-氯-2-甲氧基苯基)-3-[1(正丁基)-4-哌啶基]-1-丙酮盐酸盐(rs-67,333或rs67333)、4-氨基-5-氯-2,3-二氢-n-[1-3-甲氧基丙基)-4-哌啶基]-7-苯并呋喃甲酰胺单盐酸盐(普卡必利(prucalopride))、4-[4-[4-四氢呋喃-3-基氧基)-苯并[d]异噁唑-3-基氧基甲基]-哌啶-1-基甲基]-四氢吡喃-4-醇(pf-04995274)或它们的组合。
[0013]
药物组合物可在应激源之前约48小时至约3周施用于受试者。在某些实施方案中，药物组合物在应激源之前约72小时至约2周施用于受试者。在某些实施方案中，药物组合物在应激源之前约1周施用于受试者。
[0014]
在某些实施方案中，药物组合物在应激源之前施用于受试者一次。
[0015]
在某些实施方案中，将药物组合物经口、静脉内、鼻内或通过注射施用于受试者。
[0016]
应激诱发的情感障碍可包括重度抑郁症(mdd)和/或创伤后应激障碍(ptsd)。在某些实施方案中，应激诱发的情感障碍选自由以下组成的组：抑郁样行为和相关情感障碍、快感缺失行为和相关情感障碍、焦虑和相关情感障碍、认知障碍和缺陷和相关障碍、应激诱发的恐惧，和它们的组合。
[0017]
在另外的实施方案中，应激诱发的情感障碍包括应激诱发的精神机能障碍。在某些实施方案中，应激诱发的精神机能障碍包括抑郁和/或焦虑行为。
[0018]
本发明方法可预防或延迟应激诱发的认知障碍和/或衰退。
[0019]
本发明方法还可包括向受试者施用有效量的抗抑郁剂、抗焦虑剂或它们的组合。
[0020]
本发明方法还可包括施用有效量的选择性血清素再摄取抑制剂(ssri)或其药学上可接受的盐或衍生物。
[0021]
本发明方法还可包括施用有效量的氟西汀(fluoxetine)、帕罗西汀(paroxetine)、舍曲林(sertraline)、锂、利鲁唑(riluzole)、哌唑嗪(prazosin)、拉莫三嗪(lamotrigine)、艾芬地尔(ifenprodil)或它们的组合。
[0022]
受试者可以是哺乳动物。在某些实施方案中，受试者是人。受试者可以是女性或男性。
[0023]
在某些实施方案中，药物组合物以加强系列施用。
附图说明
[0024]
图1a-1l.rs-67,333可防止雄性c57bl/6ntac小鼠中神经内分泌模型诱发的抑郁样和焦虑样行为。(1a)实验设计。(1b)测试焦虑样行为(epm、nsf)和抑郁样行为(st)的行为测定。(1c-1f)到第6周，与veh施用相比，cort施用导致体重增加。rs和flx施用导致cort治疗小鼠的体重减轻。(1g)所有组的小鼠表现出在epm的开放臂中的时间量相当。(1h)与veh veh小鼠相比，cort veh小鼠进入epm的开放臂中的次数显著较少。rs而不是flx施用增加了cort治疗小鼠中进入epm的开放臂的次数。(1i)所有组的小鼠在epm中行进的距离相似。(1j-1k)与veh施用相比，cort施用增加了nsf中的摄食潜伏期。rs而不是flx施用降低了cort治疗小鼠的摄食潜伏期。(1l)与veh施用相比，cort施用减少了st中的梳理持续时间。rs而不是flx施用增加了cort治疗小鼠的梳理持续时间。(n＝9-14只雄性小鼠/组)。误差条表示
±
sem。*，p《0.05；**p《0.01；***，p《0.001；****，p《0.0001。veh，媒介物；veh，媒介物；cort，皮质酮；flx，氟西汀；rs，rs-67,333；epm，高架十字迷宫；nsf，新奇抑制摄食；st，飞溅试验；sec，秒；no.，次数；cm，厘米；g，克。
[0025]
图2a-2o.单次预防性注射rs-67,333可减弱雄性129s6/svev小鼠的习得性恐惧并预防新奇引起的食欲减退。(2a)实验设计。(2b)与施用盐水的小鼠相比，施用30而不是1.5或10mg/kg的rs-67,333的小鼠在cfc训练期间表现出显著更少的冻结。(2c-2d)与施用盐水的小鼠相比，施用1.5或10而不是30mg/kg的rs-67,333的小鼠表现出显著更少的冻结。(2e)与在fst的第1天期间施用盐水的小鼠相比，施用10而不是1.5或30mg/kg rs-67,333的小鼠表现出减少的不动。(2f-2g)在fst的第2天期间，所有组的小鼠的不动量相当。(2h-2i)与盐水小鼠相比，rs-67,333(10mg/kg)没有改变在of中心行进的距离或花费的时间。(2j-2k)两组小鼠在epm的开放臂中花费的时间和进入epm的开放臂中的次数相当。(2l-2m)与盐水小鼠相比，施用rs-67,333(10mg/kg)的小鼠表现出显著缩短的摄食潜伏期。(2n)两组小鼠在nsf之后在家养笼中吃掉的食物量相当。(2o)在食物剥夺后，两组小鼠的体重减轻量相当。(n＝5-29只雄性小鼠/组)。误差条表示
±
sem。*，p《0.05；***，p《0.001。sal，盐水；cfc，情境恐惧条件反射；fst，强迫游泳试验；of，旷场；epm，高架十字迷宫；nsf，新奇抑制摄食；min，分钟；sec，秒；g，克；mg，毫克；kg，千克；no.，次数；cm，厘米。
[0026]
图3a-3o.在雌性129s6/svev小鼠中，单次预防性施用rs-67,333可预防新奇引起的食欲减退，但没有改变恐惧样或抑郁样行为。(3a)实验设计。(3b)所有小鼠在cfc训练期间表现出的冻结水平相当。(3c-3d)所有组在再次暴露期间表现出的冻结水平相当。(3e)所有组的小鼠在fst的第1天期间的不动量相当。(3f-3g)所有组的小鼠在fst的第2天期间的不动量相当。(3h-3i)rs-67,333没有改变在of中心行进的距离或花费的时间。(3j)所有组的小鼠在epm的开放臂中花费的时间相当。(3k)所有组的小鼠之间进入epm的开放臂的次数相当。(3l-3m)单次预防性剂量的rs-67,333(10mg/kg)显著降低了nsf中的摄食潜伏期。(3n)单次预防性剂量的rs-67,333(10mg/kg)没有改变家养笼中吃掉的食物量，或(3o)体重减轻。(n＝6-11只雌性小鼠/组)。误差条表示
±
sem。*，p《0.05；***，p《0.001。sal，盐水；cfc，情境恐惧条件反射；fst，强迫游泳试验；of，旷场；epm，高架十字迷宫；nsf，新奇抑制摄食；min，分钟；sec，秒；cm，厘米；no.，次数；g，克；mg，毫克；kg，千克。
[0027]
图4a-4m.单次预防性施用普卡必利或pf-04995274可减弱雄性129s6/svev小鼠的习得性恐惧并减少抑郁样行为。(4a)实验设计。(4b)所有小鼠在cfc训练期间表现出的冻结
水平相当。(4c-4d)与盐水施用相比，(r,s)-氯胺酮(30mg/kg)、普卡必利(3mg/kg)和pf-04995274(10mg/kg)而不是普卡必利(10mg/kg)或pf-04995274(3mg/kg)施用减弱了习得性恐惧。(4e)所有组的小鼠在fst的第1天期间的不动量相当。(4f-4g)在fst的第2天期间，(r,s)-氯胺酮(30mg/kg)、普卡必利(3mg/kg)和pf-04995274(10mg/kg)而不是普卡必利(10mg/kg)或pf-04995274(3mg/kg)显著减少不动时间。(4h)所有组的小鼠在of中行进的距离量相当。(4i)所有组的小鼠在epm的开放臂中花费的时间量相当。(4j)所有组的小鼠进入epm的开放臂的次数相当。(4k-4l)所有组的小鼠在nsf中接近团粒的潜伏期相当。(4m)所有组的小鼠在nsf的食物剥夺后的体重减轻量相当。(n＝5-10只雄性小鼠/组)。误差条表示
±
sem。*，p《0.05；**p《0.01；***，p《0.001。sal，盐水；k，(r,s)-氯胺酮；prucal，普卡必利；pf，pf-04995274；cfc，情境恐惧条件反射；fst，强迫游泳试验；of，旷场；epm；高架十字迷宫；nsf，新奇抑制摄食；min，分钟；sec，秒；cm，厘米；no，次数；mg，毫克；kg，千克。
[0028]
图5a-5f.(r,s)-氯胺酮和普卡必利表现出通过减少ca3中大的ampa驱动的突触爆发的共同机制。(5a)实验设计。(5b)各组之间的平均epsc幅值没有差异。(5c)epsc的平均次数(在20秒记录窗口内)在各组之间没有差异。(5d)经盐水治疗的小鼠通常显示出epsc的大爆发(-590.8
±
13.85pa)，其被ampa受体拮抗剂nbqx阻断。这些大的ampa受体介导的信号在(5e)(r,s)-氯胺酮-或(5f)普卡必利治疗的小鼠中均不存在。(n＝5-7只小鼠/组)。误差条表示
±
sem。sal，盐水；k，(r,s)-氯胺酮；prucal，普卡必利；ca3，cornu ammonis 3；pa，皮安；epsc，兴奋性突触后电流；no.，次数；00nbqx，2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并[f]喹喔啉；mg，毫克；kg，千克；ms，毫秒。
[0029]
图6a-6j.急性5-ht4受体刺激在焦虑的balb/cjrj小鼠品系中诱导快速抗焦虑样效应。(6a、6b)实验设计。(6a)在第一组别的动物中，在行为测试前45分钟通过腹膜内(i.p.)注射施用媒介物(v)、氟西汀(f，18mg/kg)、地西泮(d，1.5mg/kg)或rs67333(rs，1.5mg/kg)。(6b)在第二组别的动物中，在行为范例开始前45分钟将治疗(v或rs，0.5μg/侧)输注在内侧前额叶皮层(mpfc)中以及通过i.p.注射施用地西泮(d，1.5mg/kg)。(6c-6d和6g-6h)抗焦虑样效应在高架十字迷宫(epm)中测量为在开放臂中花费的平均时间或时间百分比(6c、6g和插图)，或在开放臂中的走动距离/总距离的平均比率(6d、6h)和平均总走动距离(插图)(对于全身和局部注射研究分别为n＝10只小鼠/组和n＝5-9只小鼠/组)。(6e-6f和6i-6j)在新奇抑制摄食(nsf)范例中，抗焦虑样效应表示为超过10分钟未进食的动物的分率(6e、6i)，食物消耗量平均值(插图)或摄食潜伏期平均值(6f、6j)(n＝10只小鼠/组，n＝4-8只小鼠/组)。(6c-6d和6e-6f)全身施用。(6g-6h和6i-6j)局部施用。绘制的值是平均值
±
sem。*p《0.05，**p《0.01，相对于媒介物组。
[0030]
图7a-7g.急性5-ht4受体刺激通过调节焦虑的balb/cjrj小鼠品系中的mpfc来诱导对5-ht功能的快速抗焦虑样效应。(7a)在施用rs67333(rs，1.5mg/kg)之前，进行了不同的跟踪以记录5-ht神经元持续30min。在此时期结束时，i.p.施用rs67333，并且30min后实现了两个或三个后续轨道。(7b)drn 5-ht神经元的放电频率被评估为平均放电率。测试的神经元数量显示在每个直方图中(在rs注射前后n＝25和26，总共n＝5只小鼠)。数据是在施用rs67333前确定的drn 5-ht神经元的平均值
±
频率(hz)。(7c)在不同实验条件下drn 5-ht神经元的典型记录。上图中的直方图表示每10秒的动作电位(ap)数量(比例尺)。下图表示了两种条件下血清素能神经元的充分表征的定期放电。**p《0.01，相对于rs67333施用
ht4r诱导的快速抗焦虑样效应。gaba，γ-氨基丁酸。
[0034]
图11a-11e.急性5-ht4r拮抗剂施用预防rs67333诱导的快速抗焦虑样效应。(11a)在行为测试前45分钟i.p.施用治疗(氟西汀18mg/kg，f；地西泮1.5mg/kg，d；rs67333 1.5mg/kg，rs；媒介物，v)，除了gr125487(gr，1mg/kg，i.p.)是在rs67333施用前15分钟施用。(11b和11c)在治疗施用后，焦虑在epm中测量为在开放臂中花费的平均时间或时间百分比(11b和插图)，在开放臂中的走动距离除以总距离的平均比率或平均走动距离(11c和插图)(n＝5-6只小鼠/组)。(11d和11e)在nsf中，焦虑参数表示为超过10分钟没有进食的动物的分率(11d)、食物消耗量平均值(插图)或摄食潜伏期平均值(e)(n＝4-6只小鼠/组)。所有统计检验和p值均为平均值
±
sem。*p《0.05，**p《0.01，相对于媒介物组(v)；##p《0.01，相对于rs组。
[0035]
图12a-12c.急性全身5-ht4r刺激在旷场范例中诱导快速抗焦虑样效应。(12a)实验设计。在balb/cjrj小鼠品系中行为测试前45分钟i.p.施用媒介物(v)、氟西汀(f，18mg/kg)、地西泮(d，1.5mg/kg)或rs67333(rs，1.5mg/kg)。(12b-12c)抗焦虑样效应在of中测量为在中心花费的平均时间百分比(12b)、在中心的走动距离/总距离的平均比率(12c)和平均总走动距离(插图)(n＝5-9只小鼠/组，用于全身)。所有统计检验和p值均为平均值
±
sem。*p《0.05，**p《0.01，相对于媒介物组(v)。
[0036]
图13a-13c.drn中mpfc末端的光遗传学刺激在旷场范例中诱导快速抗焦虑样效应。(13a)关于刺激drn中的皮层谷氨酸能末端后行为后果的时间线。分别在of中测试前7周和1周，将aav5-camkiiα-chr2-eyfp或aav5-camkii-eyfp病毒双侧注射到内侧前额叶皮层(mpfc)中并在中缝背核(drn)中植入光纤。(13b-13c)抗焦虑样效应在of中测量为在激光开启和激光关闭之间在中心花费的时间百分比(插图：时间，以秒为单位)(13b)、在中心的走动距离除以总距离的平均比率(插图：总走动距离)(13c)(eyfp：n＝8只小鼠/组；chr2：n＝13只小鼠/组)。绘制的值是平均值
±
sem。**p《0.01，在激光开启和激光关闭之间；##p《0.01，在激光开启期间在chr2和eyfp组之间。
[0037]
图14a-14c.drn中mpfc末端的光遗传学抑制阻断了mpfc输注rs67333和地西泮的抗焦虑活性。(14a)关于mpfc输注地西泮(d，1.5μg/侧)、rs672333(rs，0.5μg/侧)或媒介物(v)后在中缝背核(drn)中内侧前额叶皮层(mpfc)末端抑制的行为后果的时间线。在测试前7周在mpfc中双侧注射aav5-camkii-archt-gfp病毒。在测试前1周，将光纤植入drn中。(14b-14c)对于局部输注v、d或rs的行为后果，抗焦虑样效应在旷场(of)中测量为2个回合刺激(3分钟关闭和3分钟开启)之间在中心花费的时间百分比(14b)、在从mpfc到中缝背核产生的谷氨酸能轴突末端的抑制之前和之后在中心花费的时间分布(插图)、在中心的走动距离除以总距离的平均比率(14c)和平均总走动距离(插图)(n＝6-8只小鼠/组)。绘制的值是平均值
±
sem。*p《0.05，**p《0.01，相对于媒介物组，#p《0.05，##p《0.01，相对于光开启期间的适当组。
[0038]
图15a-15i.5-ht4受体的单次刺激可导致balb/cjrj小鼠中的持久抗焦虑和抗抑郁效应。(15a)balb/cjrj小鼠在进行飞溅试验前45分钟全身注射单剂量的rs67333(1.5mg/kg)或地西泮(1.5mg/kg)。第二天，小鼠在没有接受另一剂rs67333的情况下进行epm，然后在24小时后在旷场，最后在旷场24小时后进行nsf。(15b-15c)在单次施用后，rs67333增加了飞溅试验中的梳理时间(t＝2.294；p《0.05)，而不会影响发作次数(t＝1.546；p＝
0.1531)。(15d-15e)我们尚未确定在注射后24小时，rs67333在epm中的预期抗焦虑效应(t＝0.4990；p＝0.6286)。然而，在注射后48小时，rs67333增加了在of中心花费的时间(t＝1.924；p《0.05)，而不影响在中心的距离与总步行距离的比率(t＝1.281；p＝2292)(15f-15g)，并且在注射后72小时，减少了nsf中进食的滞后(t＝2.520；p《0.05)，而不影响熟悉环境中的食物消耗量(t＝0.2203；p＝0.4151)(15h-15i)。(15b-15c)飞溅试验(急性效应)。(15d-15e)高架十字迷宫(持久效应)。(15f-15g)旷场(持久效应)。(15h-15i)新奇抑制摄食(持久效应)。缩写：*p《0.05，相对于载体；d：地西泮1.5mg/kg；i.p.：腹膜内注射rs：rs 67333 1.5mg/kg；v：载体。
具体实施方式
[0039]
本公开提供了用于预防性治疗受试者中应激诱发的情感障碍或应激诱发的精神机能障碍的方法。本公开还涵盖用于诱导和/或增强受试者中的应激韧性的方法。在某些实施方案中，在应激源之前将有效量的血清素4受体(5-ht4r)激活剂(例如，血清素4受体(5-ht4r)激动剂)，例如rs-67,333(rs67333)、普卡必利、pf-04995274或其药学上可接受的盐、类似物、衍生物或代谢物施用于受试者。
[0040]
本发明药剂/组合物可治疗性施用以获得治疗益处或预防性施用以获得预防益处。治疗益处是指根除或改善所治疗的潜在应激诱发的情感障碍，和/或根除或改善与潜在病症相关的一种或多种症状。预防益处是指预防或延迟应激诱发的情感障碍的发作，和/或预防或延迟与应激诱发的情感障碍相关的一种或多种症状的发作。在某些实施方案中，待施用的有效量的本发明药剂/组合物可防止应激相关障碍发展或恶化为更严重的疾患。
[0041]
在某些实施方案中，对于预防性施用，本发明药剂/组合物可施用于有患上应激诱发的情感障碍的风险的患者，或施用于报告应激诱发的情感障碍的一种或多种生理症状的患者，即使可能尚未做出应激诱发的情感障碍的诊断。在某些实施方案中，在症状周期性表现之前，应用预防性施用以避免潜在病症的生理症状的发作。在该后一实施方案中，治疗是针对相关生理症状而非潜在适应症的预防性治疗。在某些实施方案中，本发明药剂/组合物在应激源重现之前施用。在某些实施方案中，本发明药剂/组合物在特定症状出现之前施用。
[0042]
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明药剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物、其生理功能衍生物或类似物、或其代谢物在制备用于治疗应激诱发的情感障碍的药物中的用途。
[0043]
状态、病症或疾患的“治疗”包括：(1)预防或延迟在可能患有或易患所述状态、病症或疾患但尚未经历或显示出所述状态、病症或疾患的临床症状的人员中发展的所述状态、病症或疾患的临床症状的出现；或(2)抑制所述状态、病症或疾患，即阻止、减少或延迟疾病的发展或其复发(在维持治疗的情况下)或其至少一种临床症状、体征或测试；或(3)缓解疾病，即造成所述状态、病症或疾患或其至少一种临床或亚临床症状或体征的消退。
[0044]
对于待治疗受试者的益处是统计学显著的或至少对患者或医师而言是可察觉的。
[0045]
本发明药剂包括5-ht4r激动剂，例如rs-67,333(rs67333)、普卡必利、pf-04995274、其药学上可接受的盐或溶剂化物、其类似物、其衍生物(例如其生理功能衍生物或类似物)、其代谢物和它们的组合。
[0046]“预防有效量”是指在必要的剂量下和时间段内有效实现所需预防结果的量。在某些实施方案中，由于在病症之前或早期阶段在受试者中使用预防剂量，因此预防有效量小于治疗有效量。在某些实施方案中，预防有效量与治疗有效量相似、相同或更多。
[0047]
药物的治疗有效量或有效量是有效展现药物所需活性的量。“治疗有效量”将根据化合物、病症及其严重程度以及待治疗受试者的年龄、体重、身体状况和反应性而变化。在某些实施方案中，5-ht4r激动剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物、或其生理功能衍生物或类似物、或其代谢物的有效量是有效预防或延迟应激诱发的情感障碍发作的量，和/或有效减轻应激诱发的情感障碍的一种或多种症状的量。
[0048]
本公开提供了一种用于在有需要的受试者中预防或延迟应激诱发的情感障碍或应激诱发的精神机能障碍的方法。所述方法可包括在应激源之前向受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含血清素4受体(5-ht4r)的激活剂(例如，血清素4受体(5-ht4r)的激动剂)，或其药学上可接受的盐、类似物、衍生物或代谢物。
[0049]
本公开还提供了一种用于在有需要的受试者中诱导和/或增强应激韧性的方法。所述方法可包括在应激源之前向受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含血清素4受体(5-ht4r)的激活剂(例如，血清素4受体(5-ht4r)的激动剂)，或其药学上可接受的盐、类似物、衍生物或代谢物。
[0050]
本发明组合物可通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于鼻内、口服、透皮、经眼、腹膜内、吸入、静脉内、脑室内(icv)、脑池内注射或输注、皮下、植入、阴道、舌下、尿道(例如，尿道栓剂)、皮下、肌肉内、静脉内、直肠、舌下、粘膜、眼部、脊髓、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管和淋巴管施用。局部制剂可以是凝胶、软膏、乳膏、气雾剂等形式；鼻内制剂可作为喷雾剂或滴剂递送；透皮制剂可通过透皮贴剂或离子电渗疗法施用；吸入制剂可使用雾化器或类似装置递送。组合物还可采用片剂、丸剂、胶囊、半固体、粉剂、持续释放制剂、溶液、悬浮液、酏剂、气雾剂或任何其他适当的组合物的形式。
[0051]
在某些实施方案中，通过静脉内、口服、透皮或鼻内施用，用本发明药剂/组合物治疗受试者。在某些实施方案中，向受试者注射本发明药剂/组合物。
[0052]
在某些实施方案中，在应激源之前、期间和/或之后，用单一剂量的有效量的本发明药剂/组合物治疗受试者。在一些方面，在应激源之前、期间和/或之后，用多个剂量的有效量的本发明药剂/组合物治疗受试者。
[0053]
在某些实施方案中，5-ht4r激动剂(例如rs-67,333(rs67333)、普卡必利和pf-04995274)或其药学上可接受的盐或溶剂化物、其类似物、其衍生物或其代谢物以包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物形式施用。本文还提供了一种药物组合物，其包含5-ht4r激动剂(例如rs-67,333(rs67333)、普卡必利和pf-04995274)，或其药学上可接受的盐或溶剂化物、其类似物、其衍生物，或其代谢物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，用于预防性治疗应激诱发的情感障碍。
[0054]“患者”或“受试者”是指哺乳动物并且包括人类和兽医受试者。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物。
[0055]
本发明药剂(例如5-ht4r激活剂)可通过任何机制激活5-ht4r，包括但不限于激活/增加5-ht4r活性、激活/增加5-ht4r水平和/或激活/增加5-ht4r基因表达。术语“5-ht4r的激活剂”、“5-ht4受体的激活剂”、“5-ht4受体激活剂”和“5-ht4r激活剂”在本文中可互换使
用。
[0056]“激活”、“上调”或“增加”是指对所研究的疾患的任何积极影响；这可能是全部的或部分的。因此，当检测蛋白质(例如，5-ht4受体或5-ht4r)的水平或活性时，本发明药剂/组合物能够激活、上调或增加蛋白质的水平或活性(例如，5-ht4受体或5-ht4r)。与不存在本发明药剂/组合物的蛋白质(例如，5-ht4受体或5-ht4r)的水平或活性相比，本发明药剂实现的蛋白质水平或活性的活化或上调可以是至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多。
[0057]
半数最大有效浓度(ec50)是指在指定的暴露时间后在基线和最大值之间引起一半反应的药剂浓度。pec50定义为ec50的负对数：
[0058]
pec50＝-log
10
(ec50)。
[0059]
在某些实施方案中，本发明药剂在激活5-ht4受体活性方面的pec50范围为约3至约13、约4至约12、约5至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约7至约10、约7至约9、约7至约8、约8至约10、约8至约9、约9至约10、约5至约10、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5或约10。
[0060]
ki表示药剂(例如，激活剂，如激动剂)对受体的亲和力。当使用放射性配体竞争结合测定法测量时，如果不存在放射性配体，则竞争配体的摩尔浓度将占据50％的受体。pki是ki值的负对数。
[0061]
在某些实施方案中，本发明药剂对5-ht4受体的pki范围为约3至约13、约4至约12、约5至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约7至约10、约7至约9、约7至约8、约8至约10、约8至约9、约9至约10、约5至约10、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5或约10。
[0062]
5-ht4r激动剂
[0063]
5-ht4r是一种g蛋白偶联受体(gpcr)，其激活g蛋白gs并刺激camp/pka信号通路，导致camp反应元件结合蛋白(creb)磷酸化，以及因此许多参与神经可塑性的基因的表达(a10)。大多数5-ht4r在灵长类动物和啮齿类动物的大脑中表达，特别是在纹状体的中等多刺神经元、海马体的阿蒙氏角(ammon's horn)(ca1和ca3)、齿状回的颗粒细胞以及皮层和杏仁核中的谷氨酸能神经元中表达(a11)。此外，在下丘脑、苍白球腹侧、嗅球、间隔区和黑质中也发现了5-ht4r。缺乏5-ht4r的小鼠显示出快感缺乏和情境相关的焦虑样行为(a12)，并且各种5-ht4r激动剂可发挥抗抑郁和抗焦虑样活性(a6)。
[0064]
无论是在人类还是在啮齿动物中，血清素能4型受体(5-ht4)的表达都存在于边缘区域(mpfc、hpc和nac)。此外，基底神经节，即尾状核和豆状核(壳核和苍白球)、黑质和杏仁核，也表达5-ht4受体。5-ht4受体在胞体树突水平以及在纹状体的传出脊髓gaba能神经元的轴突末端、海马体的阿蒙氏角(ca1和ca3)、齿状回的颗粒细胞以及皮层、海马体和杏仁核的谷氨酸能神经元水平表达。
[0065]
5-ht4受体也存在于外周水平，特别是心脏水平，其激活发挥正性肌力作用，在胃肠道水平，它参与肠道运动，在肾上腺水平，它在皮质酮的分泌中起作用，以及在膀胱水平，它导致平滑肌收缩。
[0066]
5-ht4受体是具有七个跨膜结构域的受体。n末端区域面向细胞外环境，而与gs蛋白偶联的c末端结构域面向细胞质。例如通过激动剂激活5-ht4受体，可导致gs蛋白的募集，
其刺激负责产生camp的腺苷酸环化酶(ac)。被camp激活的蛋白激酶a(pka)调节不同的离子电流，特别是钾电流，其抑制会导致神经元过度兴奋。pka还能够磷酸化将反应元件与camp结合的蛋白质(creb
–
camp反应元件结合蛋白)，从而导致参与认知、情绪和细胞存活的神经营养脑因子(bdnf，脑源性神经营养因子)的转录增加。
[0067]
术语“激动剂”可指能够结合并激活一种或多种受体如5-ht4r的物质、药剂或化合物。术语“激动剂”可指无论通过增强或启动靶蛋白的活性或表达，能够启动或增强靶蛋白(例如，一种或多种受体，例如5-ht4r)的生物学功能的化合物。5-ht4r激动剂可以是激活5-ht4受体作用的化合物。术语“激动剂”可在靶蛋白的生物学作用的上下文中定义。在一个实施方案中，激动剂是与受体(例如，5-ht4r)结合并激活受体以产生生物反应的药剂。虽然本文提供的激动剂可与靶蛋白特异性相互作用(例如结合)，但通过与靶蛋白作为成员的信号转导途径的其他成员相互作用来启动或增强靶蛋白的生物活性的化合物也明确包括在该定义中。5-ht4r激动剂可以是激活5-ht4r作用的化合物或药剂。5-ht4r激动剂可以是通过或对5-ht4r直接或间接起作用以产生药理作用的任何试剂。术语“5-ht4r的激动剂”、“5-ht4受体的激动剂”、“5-ht4受体激动剂”和“5-ht4r激动剂”在本文中可互换使用。
[0068]
5-ht4r激动剂可对5-ht4受体具有选择性，或者其可以是非选择性的，对其他血清素受体表现出激动剂或拮抗剂活性。在一个实施方案中，5-ht4r激动剂对5-ht4受体具有选择性。
[0069]
5-ht4r激动剂可包括完全激动剂、部分激动剂、混合5-ht4r激动剂/拮抗剂等。
[0070]“完全激动剂”可指以激动剂可在受体处引起的最大反应结合并激活受体的药剂。取决于受体的相对数量和受体偶联的差异，药剂可在某些组织中作为完全激动剂而在其他组织中作为部分激动剂。
[0071]“部分激动剂”可指能够结合和激活给定受体，但相对于“完全激动剂”或全面激动剂仅对受体具有部分功效的化合物。当与完全激动剂竞争受体占有率时，部分激动剂可作为拮抗剂，并且与单独使用完全激动剂观察到的效应或活化相比，产生受体活化的净减少。部分激动剂可指混合激动剂/拮抗剂，它们在不同剂量范围内对受体功能产生不同的影响。例如，部分激动剂可在较低剂量下作为激动剂，并且在较高剂量下作为拮抗剂。部分激动剂可以是相对于完全激动剂具有降低的诱导受体构象变化功效的化合物(通常为40-80％)，并且其可在低剂量下诱导激动剂作用但在高剂量下诱导拮抗剂作用。
[0072]
5-ht4r激动剂可以是吲哚、苯甲酰胺、苯甲酸酯、芳基酮或苯甲酰胺。
[0073]
5-ht4r激动剂的非限制性实例包括：1-(4-氨基-5-氯-2-甲氧基苯基)-3-[1(正丁基)-4-哌啶基]-1-丙酮盐酸盐(rs-67,333或rs67333)、4-氨基-5-氯-2,3-二氢-n-[1-3-甲氧基丙基)-4-哌啶基]-7-苯并呋喃甲酰胺单盐酸盐(普卡必利)、4-[4-[4-四氢呋喃-3-基氧基)-苯并[d]异噁唑-3-基氧基甲基]-哌啶-1-基甲基]-四氢吡喃-4-醇(pf-04995274)和它们的组合。5-ht4r激动剂的非限制性实例还包括：2-[1-(4-胡椒基)哌嗪基]苯并噻唑(ppb)、5-甲氧基色胺、prx-03140、西沙必利(cisapride)((
±
)-顺式-4-氨基-5-氯-n-[1-[3-(4-氟苯氧基)丙基]-3-甲氧基-4-哌啶基]-2-甲氧基苯甲酰胺一水合物)、bimu-8(2,3-二氢-n-[(3-内)-8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基]-3-(1-甲基乙基)-2-氧代-1h-苯并咪唑-1-甲酰胺、rs67506(甲基磺酰基氨基)乙基-4-哌啶基]-1-丙酮盐酸盐)、莫沙必利(mosapride)(4-氨基-5-氯-2-乙氧基-n-[[4-[(4-氟苯基)甲基]-2-吗啉基]甲基]苯甲酰
胺柠檬酸盐)、替加色罗(tegaserod)(2-[(5-甲氧基-1h-吲哚-3-基)亚甲基]-n-戊基-肼甲酰亚胺马来酸盐)，ml10302(4-氨基-5-氯-2-甲氧基苯甲酸2-(1-哌啶基)乙酯盐酸盐)、维司曲格(velusetrag)(td-5108)(n-[(1r,3r,5s)-8-[(2r)-2-羟基-3-(n-甲基甲磺酰胺基)丙基]-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基]-2-氧代-1-(丙-2-基)-1,2-二氢喹啉-3-甲酰胺)、那洛必利(naropride)(ati-7505)(6-[(3s,4r)-4-[(4-氨基-5-氯-2-甲氧基苯甲酰基)氨基]-3-甲氧基哌啶-1-基]己酸[(3r)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]酯、西尼必利(cinitapride)(4-氨基-n-[1-(环己-3-烯-1-基甲基)哌啶-4-基]-2-乙氧基-5-硝基苯甲酰胺)、甲氧氯普胺(metoclopramide)(4-氨基-5-氯-n-(2-(二乙基氨基)乙基)-2-甲氧基苯甲酰胺)、伦扎必利(renzapride)(atl-1251、brl 24924、(
±
)-内-4-氨基-5-氯-2-甲氧基-n-(1-氮杂双环[3.3.1]壬-4-基)苯甲酰胺)、rq-00000010(4-{[4-({[4-(2,2,2-三氟乙氧基)-1,2-苯并异噁唑-3-基]氧基}甲基)哌啶-1-基]甲基}四氢-2h-吡喃-4-甲酸)、suvn-d4010(1-异丙基-3-{5-[1-(3-甲氧基丙基)哌啶-4-基]-[1,3,4]噁二唑-2-基}-1h-吲唑)、td-8954(4-{(4-[(2-异丙基-1h-苯并咪唑-4-羰基)氨基]甲基}-哌啶-1-基甲基)哌啶-1-甲酸甲酯)、sc53116(4-氨基-5-氯-n-[[(1s,7as)-六氢-1h-吡咯嗪-1-基]甲基]-2-甲氧基-苯甲酰胺)、bimu-1(3-乙基-2,3-二氢-n-(8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)-2-氧代-1h-苯并咪唑-1-甲酰胺盐酸盐)、多奈必利(donecopride)(mr31147，即：1-(4-氨基-5-氯-2-甲氧基苯基)-3-[1-(环己基甲基)-4-哌啶基]丙-1-酮)；ls 650155(caeserod，即：5-(8-氨基-7-氯-2,3-二氢苯并[b][1,4]二噁英-5-基)-3-(1-苯乙基哌啶-4-基)-1,3,4-噁二唑-2(3h)-一盐酸盐)；pf-00885706：n-[2-[(1r,8s)-4-[[4-(环丁基氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基]-11-氮杂三环[6.2.1.02,7]十一碳-2(7),3,5-三烯-11-基]-2-氧代乙基]乙酰胺和它们的组合。
[0074]
rs-67,333是一种高亲和力的5-ht4r部分激动剂[22]。这种药物可有效改善行为缺陷，减少淀粉样蛋白斑块的数量以及淀粉样蛋白β(aβ)种类的水平，并减少阿尔茨海默病(ad)5xfad小鼠模型中的海马星形胶质细胞增生症和小胶质细胞增生症[23]。rs67333是一种芳基酮。在哌啶上并入一个正丁基提高了激动剂活性，并具有很大的效果、最佳的选择性和优异的生物利用度。其增加的疏水性有助于通过血脑屏障，从而允许渗透到大脑中(eglen等人,pharmacological characterization of two novel and potent 5-ht4receptor agonists,rs 67333and rs 67506,in vitro and in vivo.br.j.pharmacol.1995；115(8):1387-92)。
[0075]
普卡必利是一种选择性、高亲和力的5-ht4r激动剂[24]。普卡必利是苯并呋喃家族的衍生物，其对5-ht4受体表现出增加的选择性，但对herg(人ether-a-go-go相关基因)通道没有亲和力。在2018年，其获fda批准用于慢性便秘并且目前正在测试用于慢性假性肠梗阻。普卡必利也在两项独立的临床试验中进行了测试，以研究其在急性(例如，单剂量)或慢性(例如，1周)施用后对健康志愿者情绪处理的影响[25,26]。
[0076]
pf-04995274是一种有效的部分5-ht4r激动剂[27]。进行了一项临床试验以评价单独或与多奈哌齐(donepezil)组合的pf-04995274对东莨菪碱诱导的健康成人精神运动和认知功能缺陷的影响；然而，该试验被终止，但并非出于安全考虑[28]。目前，正在进行一项临床试验，以测试pf-04995247的辅助施用与安慰剂相比是否对介导的难治性(trd)抑郁患者的情绪处理和神经活动产生积极影响[29]。
[0077]
替加色罗是一种5-ht4受体的部分激动剂，其对5-ht1(激动剂)和5-ht
2a-c
(拮抗剂)受体具有中等亲和力。
[0078]
西沙必利是一种副交感神经药，其通过激活5-ht4受体，增加肠神经系统中释放的乙酰胆碱。
[0079]
西尼必利是一种苯甲酰胺，其可作为5-ht
1a
和5-ht4受体激动剂以及5-ht
2a
受体拮抗剂。
[0080]
莫沙必利是一种选择性5-ht4受体激动剂，其主要活性代谢物可作为5-ht3受体拮抗剂。
[0081]
甲氧氯普胺是一种5-ht4和5-ht
3a
受体激动剂。它是d2受体拮抗剂。它也是m1毒蕈碱受体激动剂和乙酰胆碱酯酶抑制剂。
[0082]
suvn-d4010是一种强效、选择性和有效的5-ht4受体部分激动剂，其通过口服途径具有良好的生物利用度。
[0083]
混合5-htr激动剂/拮抗剂包括但不限于：丁螺环酮(buspirone)、米安色林(mianserin)、曲唑酮(trazodone)和米氮平(mirtazapine)。
[0084]
术语“血清素”、“5-羟色胺”和“5-ht”是指在中枢神经系统的血清素能神经元和胃肠道的肠嗜铬细胞中通过羟化和脱羧由色氨酸产生的酚胺神经递质。血清素是褪黑激素的前体。
[0085]
术语“药学上可接受的衍生物”是指化合物的任何药学上可接受的盐、溶剂化物、前药，例如酯或其他前体，其在施用于接受者后能够(直接或间接)提供活性化合物或其活性代谢物或残留物。此类盐包括药学上可接受的碱性或酸加成盐以及药学上可接受的金属盐、铵盐和烷基化铵盐。此类衍生物对于本领域技术人员来说是可识别的，无需过度实验。衍生物例如描述于burger's medicinal chemistry and drug discovery,第5版,第1卷:principles and practice中，所述文献通过引用并入本文。在某些实施方案中，药学上可接受的衍生物包括盐、溶剂化物、酯、氨基甲酸酯和磷酸酯。
[0086]
本发明药剂/组合物可通过多种途径施用，包括口服、静脉内(i.v.或iv)、鼻内(i.n.或in)、肌肉内(i.m.或im)、尾侧、鞘内和皮下(s.c.)途径。
[0087]
药物化合物
[0088]
本发明方法中使用的药剂包括本文所述化合物的所有水合物、溶剂化物和复合物。如果手性中心或另一种形式的异构中心存在于本发明化合物中，则此类一种或多种异构体的所有形式，包括对映异构体和非对映异构体，都旨在涵盖在本文中。含有手性中心的化合物可用作外消旋混合物、对映异构富集的混合物，或者可使用公知技术分离外消旋混合物并且可单独使用个别对映异构体。本公开中描述的化合物可以是外消旋形式或作为个别对映异构体。可使用已知技术分离对映异构体，例如在pure and applied chemistry 69,1469-1474,(1997)iupac中描述的那些。在化合物具有不饱和碳碳双键的情况下，顺式(z)和反式(e)异构体均在本公开的范围内。在化合物可以互变异构形式(例如酮-烯醇互变异构体)存在的情况下，每个互变异构形式都被认为包括在本公开内容中，无论是以平衡状态存在还是主要以一种形式存在。
[0089]
当本公开中使用的化合物的结构包括不对称碳原子时，此种化合物可作为外消旋物、外消旋混合物和分离的单一对映异构体出现。这些化合物的所有此类异构形式均明确
包括在本公开中。每个手性碳可以是r或s构型。因此应理解，除非另有说明，否则由这种不对称性产生的异构体(例如，所有对映异构体和非对映异构体)包括在本公开的范围内。此类异构体可通过经典的分离技术和立体化学控制的合成以基本上纯的形式获得，例如在j.jacques,a.collet和s.wilen,"enantiomers,racemates and resolutions",pub.john wiley&sons,ny,1981中描述的那些。例如，可通过手性柱上的制备型色谱法进行拆分。
[0090]
本公开还旨在包括使用在本文公开的化合物上出现的所有原子同位素。同位素包括那些原子序数相同但质量数不同的原子。同位素标记的化合物通常可通过本领域技术人员已知的常规技术或通过类似于本文所述那些的方法使用适当的同位素标记的试剂代替所采用的非标记试剂来制备。
[0091]
本公开的化合物可以是盐形式。如本文所用，“盐”是通过制备化合物的酸或碱盐而改性的本化合物的盐。在用于治疗哺乳动物的化合物的情况下，盐是药学上可接受的。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机或有机酸盐；酸性残基如苯酚的碱金属盐或有机盐。可使用有机酸或无机酸制备盐。此类酸盐是氯化物、溴化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、磺酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、抗坏血酸盐等。酚盐是碱土金属盐、钠盐、钾盐或锂盐。在这方面，术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒的无机和有机酸或碱加成盐。这些盐可在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，或者通过用合适的有机或无机酸或碱单独处理游离碱或游离酸形式的纯化的本发明化合物，并分离由此形成的盐。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。(参见例如berge等人,(1977)"pharmaceutical salts",j.pharm.sci.66:1-19)。
[0092]
本发明方法还涵盖施用本发明化合物的生理功能衍生物。如本文所用，术语“生理功能衍生物”是指在体内转化以产生本发明化合物或其活性代谢物的化合物(例如，药物前体)，或所述化合物的药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。转化可通过各种机制(例如，通过代谢或化学过程)发生，例如通过血液中的水解。前药是这样的衍生物，并且关于前药使用的讨论提供于t.higuchi和w.stella,“pro-drugs as novel delivery systems,”a.c.s.研讨会系列的第14卷；以及bioreversible carriers in drug design,edward b.roche编辑,american pharmaceutical association and pergamon press,1987。
[0093]
剂量
[0094]
在某些实施方案中，本发明药剂的有效量是约0.01至约3mg/kg受试者体重(mg/kg)的剂量，即约0.01mg/kg至约3mg/kg体重。在某些实施方案中，本发明化合物的有效量范围为0.001至约3mg/kg体重、0.001至约2mg/kg体重、约0.01mg/kg至约3mg/kg体重、约0.01至约2mg/kg体重、约0.01至约1.5mg/kg体重、约0.05至约1.4mg/kg体重、约0.05至约1.3mg/kg体重、约0.05至约1.2mg/kg体重、约0.05至约1.1mg/kg体重、约0.01至约1mg/kg体重或约0.05至约0.7mg/kg体重。在一些方面，剂量为约0.05至约0.5mg/kg。在一些方面，剂量小于约0.5mg/kg、小于约0.4mg/kg或小于约0.3mg/kg体重。在一些方面，本发明化合物的有效量为约0.01mg/kg至约1.5mg/kg体重范围内的剂量。在一些方面，本发明化合物的有效量为约0.01mg/kg至约1mg/kg体重范围内的剂量。在一些方面，本发明化合物的有效量为约
0.01mg/kg至约0.75mg/kg体重范围内的剂量。在一些方面，本发明化合物的有效量为约0.75mg/kg至约1.5mg/kg体重范围内的剂量。在一些方面，本发明化合物的有效量为约0.5mg/kg至约1.2mg/kg体重范围内的剂量。在一些方面，本发明化合物的有效量为约0.05mg/kg至约0.5mg/kg范围内的剂量。在一些方面，本发明化合物的有效量为约0.2mg/kg或约0.4mg/kg体重的剂量。在一些方面，本发明化合物的剂量为约0.01至约1mg/kg、约0.1至约0.5mg/kg、约0.8至约1.2mg/kg、约0.7至约1.1mg/kg、约0.05至约0.7mg/kg、约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1.0mg/kg、约1.1mg/kg、约1.2mg/kg、约1.3mg/kg、约1.4mg/kg、约1.5mg/kg、约1.6mg/kg、约1.7mg/kg、约1.8mg/kg、约1.9mg/kg、约2.0mg/kg或约3mg/kg体重。
[0095]
在某些实施方案中，本发明化合物每次施用的剂量为约1至约250mg、约10mg至约300mg、约10mg至约250mg、约10至约200mg、约15至约175mg、约20至约175mg、约8mg至约32mg、约50mg至约75mg、约25至约150mg、约25至约125mg、约25至约100mg、约50至约100mg、约50mg至约75mg、约75mg至约100mg、或约75mg至约200mg、约1mg、2mg、4mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg和250mg。在一些方面，本发明化合物的剂量为约50mg。在一些方面，本发明化合物的剂量为约75mg。在一些方面，本发明化合物的总剂量为约100mg。
[0096]
在某些实施方案中，本发明药剂的治疗有效量低于导致药剂的一种或多种副作用的水平。
[0097]
在一些方面，本发明药剂d的(治疗)有效量为约0.01mg至约1000mg、约0.01mg至约500mg、约0.1mg至约250mg，或其中的任何量或范围。在另一方面，本发明药剂的(治疗)有效量为例如0.01mg、0.025mg、0.05mg、0.1mg、0.5mg、1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、90mg、95mg、100mg、150mg、200mg、250mg或500mg。
[0098]
在某些实施方案中，本发明药剂的治疗有效剂量可根据以下进行调整：待治疗或预防性治疗的疾病/病症的状况，受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，剂量时间间隔，施用途径，排泄率和药物组合。
[0099]
本发明药剂的初始剂量可以更大，然后是一个或多个较小的维持剂量。其他范围也是可能的，这取决于受试者对治疗的反应。初始剂量可与随后施用的剂量相同、或更低或更高。
[0100]
本发明药剂/组合物可以每天一次、每周一次、每两周一次、每天数次、每半周一次、每隔一天一次、每两周一次、每季度一次、每周数次、每半周一次、每月一次等施用。治疗的持续时间和频率可取决于受试者对治疗的反应。
[0101]
在某些实施方案中，可向受试者施用1剂、2剂、3剂、4剂、5剂、6剂或更多剂的本发明药剂/组合物。在某些实施方案中，在本发明方法中施用单个剂量的本发明药剂/组合物。在某些实施方案中，在本发明方法中施用多个剂量的本发明药剂/组合物(例如，2剂、3剂、4剂、5剂、6剂、7剂、8剂、9剂、10剂或更多剂)。
[0102]
在某些实施方案中，当向受试者施用多于一个剂量的本发明药剂/组合物时，第二剂量低于第一剂量。在某些实施方案中，第二剂量是第一剂量的至多二分之一、四分之一或
十分之一的量。
[0103]
剂量的数量和频率可基于受试者对组合物施用的反应来确定，例如，患者的一种或多种症状是否有所改善和/或受试者是否耐受组合物的施用而没有不良反应。
[0104]
在某些实施方案中，每天至少一次、每天至少两次、每天至少三次或更多次施用本发明药剂/组合物。在某些实施方案中，每周至少一次、每周至少两次、每周至少三次或更频繁地施用本发明药剂/组合物。在某些实施方案中，每月至少两次或每月至少一次施用本发明药剂/组合物。
[0105]
只要需要，就可以继续使用本发明方法进行治疗。
[0106]
给药时间范围
[0107]
在某些实施方案中，在应激源之前将本发明药剂/组合物施用于受试者。在某些实施方案中，在应激源之前和之后将本发明药剂/组合物施用于受试者。在某些实施方案中，在应激源之后向受试者施用本发明药剂/组合物。在某些实施方案中，在应激源之前和再次在应激源或不同的应激源重现之前将本发明药剂/组合物施用于受试者。
[0108]
在某些实施方案中，在应激源之前和/或之后约12小时至约4周、约18小时至约4周、约1天至约3.5周、约2天至约3周、约3天至约3周、约4天至约3周、约5天至约3周、约6天至约3周、约2天至约2.5周、约3天至约2.5周、约4天至约2.5周、约5天至约2.5周、约6天至约2.5周、约1周至约2.5周、约1周至约2.5周、约1周至约2周、约5分钟至约3天、约10分钟至约2天、约15分钟至约24小时、约20分钟至约12小时、约30分钟至约8小时、约45分钟至约5小时、约1小时至约12小时、约2小时至约5小时、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约15小时、约1天、约1.5天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约2周、约2.5周、约3周、约3.5周或约4周，将本发明药剂/组合物施用于受试者。
[0109]
在某些实施方案中，本发明药剂/组合物的施用持续长达2天、长达3天、长达4天、长达5天、长达6天、长达1周、长达2周、长达3周、长达4周、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周或更长的时期。
[0110]
在某些实施方案中，在每次治疗时，本发明药剂/组合物被施用一次、两次、至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或更多次。
[0111]
在某些实施方案中，每天至少一次、每天至少两次、每天至少三次、每周至少一次、每周至少两次、每周至少三次、每月至少一次，每月至少两次或更频繁地施用本发明药剂/组合物。只要需要，治疗可以继续。本发明药剂/组合物可每天一次、每周一次、每两周一次、每天数次、每半周一次、每隔一天一次、每两周一次、每季度一次、每周数次、每半周一次、每月一次等施用。治疗的持续时间和频率可取决于受试者对治疗的反应。
[0112]
应激源
[0113]
应激源是引起应激的刺激物。它可以是破坏身体的温度、血压和/或其他功能的稳态的事件或其他因素。在某些实施方案中，应激源是创伤性或应激性事件。由于人类拥有复杂的大脑和思维过程，因此预测中断也可能是一种应激源。在某些实施方案中，应激源是伤害、创伤、战斗、战争、手术、事故、刑事攻击、虐待儿童、自然或人为灾难、碰撞、悲伤、饥饿、热、冷、化学暴露、自身免疫性疾病、传染病、病毒感染、癌症、疲惫、身体不适、神经病、痛觉
过敏、异常性疼痛、情绪困扰或抑郁。创伤性事件可能是威胁个人生命或亲人生命的事件或事物，或者它可能是目击事件。美国专利申请第20140018339号。
[0114]
应激源可能是急性的，或者可能是慢性的。
[0115]
有许多生理过程会响应于应激而改变。其中包括皮质醇、促肾上腺皮质激素、儿茶酚胺和血清素水平的改变。这些水平在急性应激源消除后恢复到基线(mcewen n eng j med 1998 338(3):171-179)。这些应激的生化标志物反过来导致健康状况不佳和社会心理障碍。因此，应激在身体和心理健康方面起着重要作用。应激会影响疾病的发生或易感性。即使存在另一种潜在的疾病病理生理学，它也会影响疾病的进展或病程。现有疾病的康复也可能因应激而延迟。例如，应激是导致高血压、心脏病、头痛、结肠炎、肠易激综合征、颞下颌关节病症、癌症、消化性溃疡、失眠、皮肤病症和哮喘的一个因素。应激还会加重其他疾患，例如多发性硬化症、糖尿病、疱疹、精神疾病、药物滥用和以存在暴力或攻击倾向为特征的精神障碍。特别是，应激会导致功能性躯体障碍、情感障碍和重度抑郁症(mdd)。这些疾病包括例如慢性疲劳综合征(cfs)、纤维肌痛(fms)、海湾战争综合征、焦虑症和创伤后应激障碍(ptsd)的病症。破坏正常运动或睡眠模式的应激源。
[0116]
其他使用例包括在军事部署之前施用以保护服务人员(现役作战士兵、战场外科医生等)以及甚至军用工作犬免受应激。潜在的非军事使用例包括但不限于：警察、消防员、急救人员、紧急医疗技术人员(emt)、急诊室(er)医生、狱警(和囚犯)、人道主义援助工作者和难民。
[0117]
在某些实施方案中，可在受试者(例如早期应答者或军事人员)可能暴露于创伤性应激的情形之前、在暴露于创伤性应激之后立即，和/或当受试者觉得他或她的ptsd症状可能出现时，向受试者施用本发明药剂或组合物。
[0118]
应激韧性
[0119]
应激韧性是指受试者在面对应激源(例如逆境)时成功适应或改变和/或维持生理、神经或心理稳态的能力。如本文所用，术语“增强韧性”是指增加受试者经受应激源(例如创伤性事件)的能力而不遭受应激诱发的情感障碍和/或具有较少的事件后症状或破坏体内平衡和/或日常生活的正常活动。在某些实施方案中，提高韧性可预防应激诱发的情感障碍。在某些实施方案中，提高韧性可减少应激诱发的情感障碍的体征、症状或症状群中的至少一种。在某些实施方案中，本发明方法增强了受试者对应激的韧性，帮助防止发展成应激源相关的精神机能障碍，减少应激源诱发的障碍(例如ptsd等)的功能后果，并降低医学发病率和死亡率。
[0120]
connor-davidson韧性量表(cd-risc)是一个25项的自陈报告量表，每个项目以5分制(0-4)评定，评分越高反映韧性越大(connor k m和davidson,j r t.development of a new resilience scale:the connor-davidson resilience scale(cd-risc).depression and anxiety,2003:18:71-82)。
[0121]
韧性、心理成长和生活满意度可用cd-risc、生活目的量表、简略mos社会支持调查、ptgi和q-les-q来衡量。
[0122]
组合疗法
[0123]
本发明药剂或组合物可单独施用于受试者，或者可与一种或多种其他治疗/药剂组合施用于受试者。
[0124]
在某些实施方案中，第二药剂是抗抑郁药、抗焦虑药或它们的组合。在某些实施方案中，第二药剂是血清素再摄取抑制剂(sri)或选择性血清素再摄取抑制剂(ssri)。在某些实施方案中，第二药剂是氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、锂、利鲁唑、哌唑嗪、拉莫三嗪、艾芬地尔或它们的组合。在某些实施方案中，第二药剂是双重血清素去甲肾上腺素再摄取抑制剂化合物(dri)。在某些实施方案中，第二药剂是文拉法辛(venlafaxine)、度洛西汀(duloxetine)、米那普仑(milnacipran)或它们的组合。在某些实施方案中，第二药剂是非三环三重再摄取抑制剂(tri)。
[0125]
在某些实施方案中，本发明药剂或组合物与一种或多种治疗/药剂如抗抑郁剂、镇痛剂、肌肉松弛剂、食欲减退剂、兴奋剂、抗癫痫药和镇静剂/催眠剂联合施用于受试者。可与本发明化合物或组合物联合施用的化合物的非限制性实例包括neurontin、普瑞巴林(pregabalin)、普拉克索(pramipexole)、左旋多巴、安非他命(amphetamine)、替扎尼定(tizanidine)、可乐定(clonidine)、曲马多(tramadol)、吗啡、三环抗抑郁药、可待因、卡马西平(carbamazepine)、西布曲明(sibutramine)、安非他命、安定(valium)、曲唑酮(trazodone)和它们的组合。
[0126]
在某些实施方案中，组合疗法意指以相同剂型同时施用药剂、以不同剂型同时施用或单独施用药剂。
[0127]
在某些实施方案中，第二药剂/治疗用作本发明药剂或组合物的辅助疗法。在某些实施方案中，治疗包括这样一个阶段，其中在用本发明药剂或组合物进行的治疗已经停止之后，用第二药剂/治疗进行治疗。在某些实施方案中，治疗包括这样一个阶段，其中用本发明药剂或组合物进行的治疗与用第二药剂/治疗进行的治疗重叠。
[0128]
组合疗法可以是顺序的，或者可以同时施用。在任何一种情况下，这些药物和/或疗法都被称为“共同施用”。应当理解，“共同施用”不一定意味着药物和/或疗法以组合形式施用(即，它们可在相同或不同的时间单独施用(例如，作为单独的组合物或制剂)或一起施用(例如，在相同的制剂或组合物中)于相同或不同的位点)。
[0129]
在某些实施方案中，用本发明药剂或组合物和第二药剂同时(或伴随)治疗受试者。在某些实施方案中，受试者最初用本发明药剂或组合物治疗，然后停止本发明化合物或组合物治疗并开始用第二药剂进行治疗。在某些实施方案中，本发明药剂或组合物用作初始治疗，例如，通过施用一剂、两剂或三剂，并施用第二药剂以延长本发明药剂或组合物的作用，或者可替代地，以增强本发明药剂或组合物的效果。本领域普通技术人员将认识到，所提出方案的其他变体是可能的，例如，开始用本发明化合物或组合物治疗受试者，随后是用第二药剂作为本发明化合物或组合物治疗的辅助疗法来治疗受试者的时期，然后停止本发明化合物或组合物治疗。
[0130]
本发明化合物和其他药物活性剂可一起或分开施用，并且当分开施用时，这可以同时或以任何顺序依次发生。将选择本发明药剂和其他药物活性剂的量和相对施用时间，以实现所需的组合治疗效果。
[0131]
在各种实施方案中，所述疗法(例如，本文提供的组合物和组合疗法中的第二药剂)相隔小于5分钟、相隔小于30分钟、相隔1小时、相隔约1小时、相隔约1至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时
至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔约12小时至18小时、相隔18小时至24小时、相隔24小时至36小时、相隔36小时至48小时、相隔48小时至52小时、相隔52小时至60小时、相隔60小时至72小时、相隔72小时至84小时、相隔84小时至96小时、或相隔96小时至120小时施用。在某些实施方案中，疗法相隔不超过24小时或不超过48小时施用。在某些实施方案中，在同一患者访视内施用两种或更多种疗法。在其他实施方案中，本文提供的组合物和第二药剂同时施用。在其他实施方案中，本文提供的组合物和第二药剂以相隔约2至4天、相隔约4至6天、相隔约1周、相隔约1至2周、或相隔超过2周的方式施用。在某些实施方案中，相同药剂的施用可重复并且施用可相隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或6个月。在其他实施方案中，相同药剂的施用可重复并且施用可相隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或6个月。在某些实施方案中，将本文提供的组合物和第二药剂按顺序和在时间间隔内施用于受试者，使得本文提供的组合物可与其他药剂一起作用以提供比以其他方式施用时增加的益处。例如，第二活性剂可同时施用或在不同时间点以任何顺序依次施用；然而，如果不是同时施用，则它们应该在足够接近的时间施用以提供所需的治疗或预防效果。在一个实施方案中，本文提供的组合物和第二活性剂在重叠的时间发挥它们的作用。每种第二活性剂可以任何适当的形式和通过任何合适的途径单独施用。在其他实施方案中，本文提供的组合物在施用第二活性剂之前、同时或之后施用。术语“约”是指参考值的
±
10％。在其他实施方案中，对患者同时施用多个疗程，即单独剂量的第二药剂在一定时间间隔内单独施用，使得本文提供的化合物可与第二活性剂一起起作用。例如，一种组分可每周给药一次，与其他组分组合，其他组分可每两周施用一次或每三周施用一次。换句话说，即使治疗剂不是同时或在同一天施用，给药方案也是同时进行的。第二药剂可与本文提供的化合物相加或协同作用。在一个实施方案中，本文提供的组合物与相同药物组合物中的一种或多种第二药剂同时施用。在另一个实施方案中，本文提供的组合物与单独的药物组合物中的一种或多种第二药剂同时施用。在另一个实施方案中，在施用第二药剂之前或之后施用本文提供的组合物。还考虑通过相同或不同的施用途径，例如口服和肠胃外途径，来施用本文提供的组合物和第二药剂。在某些实施方案中，当本文提供的组合物与可能产生包括但不限于毒性在内的不利副作用的第二药剂同时施用时，可以有利地以低于引起不利副作用的阈值的剂量施用第二活性剂。
[0132]
本公开涵盖在应激源之前预防性治疗受试者的方法。在某些实施方案中，本发明药剂/组合物和方法在受试者中预防或延迟应激诱发的情感障碍或应激诱发的精神机能障碍。在某些实施方案中，应激诱发的情感障碍包括重度抑郁症和创伤后应激障碍。
[0133]
应激诱发的情感障碍
[0134]
有许多由应激引起或加剧的病症。本发明药剂/组合物和方法可预防或延迟应激诱发的情感障碍或应激诱发的精神机能障碍。可通过本发明药剂/组合物和方法预防或治疗的应激诱发的情感障碍或应激诱发的精神机能障碍包括但不限于：成瘾性障碍，例如药物滥用、厌食症、贪食症、肥胖症、吸烟成瘾和体重上瘾；焦虑症，例如广场恐惧症、焦虑症、强迫症、惊恐发作、表现焦虑症、恐惧症和创伤后应激障碍(ptsd)；精神障碍，例如应激诱发的精神障碍；自身免疫性疾病，例如过敏、关节炎、纤维肌痛、纤维肌病、狼疮、多发性硬化症、类风湿性关节炎、干燥综合征和白癜风；癌症，例如骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、
霍奇金病、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌；心血管病症，例如心律失常、动脉硬化、伯格氏病(burger's disease)、原发性高血压、纤维性颤动、二尖瓣脱垂、心悸、外周血管疾病、雷诺氏病(raynaud's disease)、中风、心动过速和沃尔夫-帕金森-怀特综合征(wolff-parkinson-white syndrome)；和发育障碍，例如注意力缺陷障碍、注意力不集中、品行障碍、诵读障碍、运动过度、语言和言语障碍以及学习障碍。
[0135]
焦虑症
[0136]
本发明药剂/组合物和方法可预防或延迟焦虑症。焦虑症的五种主要类型是：恐慌症、强迫症、创伤后应激障碍、广泛性焦虑症和恐惧症(包括社交恐惧症，也称为社交焦虑症)。每种焦虑症都有其独特的特征，但它们都因过度、非理性的恐惧和畏惧这一共同主题而联系在一起。焦虑症通常伴随抑郁症、进食障碍、药物滥用或另一种焦虑症。
[0137]
恐慌症的特征是强烈恐惧的反复发作，经常在没有警告的情况下侵袭。身体症状包括胸痛、心悸、气短、头晕、腹部不适、不真实感和对死亡的恐惧。强迫症的特征是反复出现的不想要的想法或强迫行为，其似乎无法停止或控制。广泛性焦虑症的特征是对日常生活事件和活动的过度担忧和紧张，持续至少六个月。几乎总是预料到最坏的情况，即使没有理由这样预期；伴有身体症状，如疲劳、颤抖、肌肉紧张、头痛或恶心。恐惧症分为两大类恐惧症，即社交恐惧症和特定恐惧症。患有社交恐惧症的人对社交场合中的审视、尴尬或羞辱有着压倒性的和致残性的恐惧，这导致避免许多可能令人愉快和有意义的活动。患有特定恐惧症的人会对几乎没有或没有实际危险的事物产生极端的、致残的和非理性的恐惧；恐惧导致回避物体或情况并且可能导致人们不必要地限制他们的生活。
[0138]
创伤后应激障碍(ptsd)
[0139]
通常，患有ptsd的受试者暴露于创伤性事件，其中这个人经历、目睹或面临涉及实际或威胁死亡或严重伤害的一个或多个事件，或者对自己或他人身体完整性的威胁并且这个人的反应包括强烈的恐惧、无助或厌恶。
[0140]
对创伤暴露的反复侵入性记忆是ptsd的核心症状之一。ptsd患者已知在神经心理测试期间表现出学习和记忆障碍。ptsd的其他核心症状包括应激敏感度升高(惊吓)、紧张和焦虑、记忆障碍和分离。
[0141]
在某些实施方案中，本发明方法预防或抑制受试者的创伤后应激障碍(ptsd)的发展。在某些实施方案中，本发明方法预防或抑制一种或多种ptsd样症状的发展。在某些实施方案中，可在受试者(例如早期应答者或军事人员)可能暴露于创伤性应激的情形之前、在暴露于创伤性应激之后立即，和/或者当受试者觉得他或她的ptsd症状可能出现时，向受试者施用本发明药剂或组合物。
[0142]
通常，创伤性事件以下列一种或多种方式持续地重新体验：反复发生和侵入性的事件的痛苦回忆，包括图像、想法或感知，反复发生的事件痛苦的梦，行为或感觉好像创伤性事件反复发生(包括重温经历的感觉、错觉、幻觉和分离性闪回事件，包括那些发生在醒来或醉酒时的事件)，在暴露于象征或类似于创伤性事件的一个方面的内部或外部线索时的强烈心理困扰，在暴露于象征或类似于创伤性事件的一个方面的内部或外部线索时的生理反应。患有ptsd的个体还会持续回避与创伤相关的刺激和一般反应性麻木(创伤前不存在)，如以下3项或更多项所指示：努力避免与创伤相关的想法、感受或对话，努力避免引起创伤回忆的活动、地点或人，无法回忆创伤的重要方面，对重要活动的兴趣或参与显著减
少，感觉与他人疏离或疏远，影响范围受限(例如，无法有爱的感觉)，未来缩短的感觉(例如，不希望有事业、婚姻、孩子或正常的寿命)，持续的唤醒增加的症状(在创伤前不存在)，如由以下2项或更多项所指示：难以入睡或保持睡眠，易怒或愤怒爆发，难以集中注意力，过度警觉，夸张的惊吓反应。这种障碍已持续了至少一个月，导致临床上显著的痛苦或社交、职业或其他重要功能领域的损害。
[0143]
在某些实施方案中，本发明化合物或组合物预防、减少、消除或延迟一种或多种症状，包括但不限于：以侵入性记忆、噩梦、闪回的形式重新体验创伤经历；由创伤的提醒引发的情绪和身体反应；与他人保持距离；对活动和其他人的兴趣下降；麻木的感觉；避免创伤提醒；过度觉醒症状，包括睡眠中断、易怒、过度警觉、注意力下降；惊吓反射增加；和它们的组合。
[0144]
不管问题的根源是什么，一些患有ptsd的人在白天以噩梦和令人不安的回忆的形式反复重温创伤。他们也可能会经历其他睡眠问题，感到疏离或麻木，或者很容易受到惊吓。他们可能对以前喜欢的事物失去兴趣并且难以感受到亲情。他们可能会感到烦躁，比以前更具攻击性，甚至暴力。使他们想起创伤的事情可能会非常令人痛苦，这可能会导致他们回避带回那些记忆的某些地方或情形。
[0145]
所述障碍可能伴有抑郁症、药物滥用或一种或多种其他焦虑症。在严重的情况下，这个人可能无法工作或社交。
[0146]
重度抑郁症
[0147]
重度抑郁症是指以负面情绪和抑郁反复发作为特征的一类综合征，没有任何符合躁狂标准的独立情绪升高和过度活动史。认识到重度抑郁症的多种亚型，包括具有非典型特征、精神病成分等的亚型。抑郁症的发病年龄和严重程度、持续时间和发作频率都是高度可变的。所述病症可在任何年龄开始。重度抑郁症的症状通常会在数天至数周内出现。前驱症状包括广泛性焦虑、惊恐发作、恐惧症或抑郁症状，并且可能发生在发作前几个月。个别发作也持续3至12个月，但复发频率较低。大多数患者在发作之间没有症状，但少数患者可能会出现持续性抑郁症，主要是在老年时。任何严重程度的个别发作通常是由压力大的生活事件促成的。抑郁发作的常见症状包括精神集中和注意力下降；降低自尊和自信；内疚和不配的想法，自残或自杀的想法或行为；睡眠不安；和食欲减退。在某些实施方案中，重度抑郁发作在社会心理应激源例如亲人去世、分居、分娩或重要关系的结束之后。
[0148]
低落的情绪每天变化不大，并且通常对环境没有反应，但随着时间的推移可能会表现出典型的昼夜变化。与躁狂发作一样，临床表现显示出明显的个体差异，并且非典型表现在青春期尤为常见。在一些情况下，焦虑、痛苦和运动激动有时可能比抑郁更突出，并且情绪变化也可能被例如易怒、过度饮酒、表演行为、和先前存在的恐惧或强迫症状加重或疑病症的额外特征所掩盖。
[0149]
精神评价
[0150]
在某些实施方案中，用本发明药剂/组合物治疗的效果或功效由受试者和/或医学专业人员，例如受试者的医师进行评价。在某些实施方案中，评价在应激源和/或本发明药剂/组合物的施用后约10分钟内、约15分钟内、约20分钟内、约25分钟内、约0.5小时内、约1小时内、约2小时内、约2.5小时内、约3小时内、约3.5小时内、约4小时内、约4.5小时内、约5小时内、约5.5小时内、约6小时内、约6.5小时内、约7小时内、约7.5小时内、约8小时内、约
8.5小时内、约9小时内、约9.5小时内、约10小时内、约10.5小时内、约11小时内、约11.5小时内、约12小时内、约18小时内、约1天内、约2天内、约3天内、约4天内、约5天内、约6天内、约1周内、约2周内、约3周内、约4周内、约1个月内、约2个月内、约3个月内、约4个月内、约5个月内、约6个月内、约1年内、约2年内或更长时间内进行。
[0151]
可对用本发明方法治疗的患者进行精神病学评价以确定所述方法是否有效。在某些实施方案中，可在治疗前、治疗时、治疗期间和/或治疗后进行精神病学评价。当使用本发明方法在治疗前和治疗后(和/或治疗期间)进行精神病学评价时，治疗前的评价结果可提供用于与治疗期间和/或治疗后的评价结果进行比较的基线。在某些实施方案中，仅在治疗之后进行精神病学评价。
[0152]
可进行心理生理应激测试来测量身体各个系统(即肌肉、心血管、消化、呼吸和神经系统)中存在的应激诱发的焦虑量。这些应激测试在本领域中是常规使用的。将测试结果与当地和国家标准进行比较，以确定个体是否表现出过量的生理焦虑以及他们是否能够在适当的时间长度内从标准化的应激刺激中恢复过来。
[0153]
精神病学测试可用于监测受试者以确定应激障碍的情绪和/或社会病因。这些测试是本领域已知的并且包括与健康相关的评估、心理健康评估、性格测试和性格类型评估。
[0154]
在某些实施方案中，使用临床医生管理的评价和/或自陈报告工具，目的是测量基线症状以及关于以下的药物作用：(1)病症的总体严重程度，(2)核心症状，和(3)情绪低落。
[0155]
精神病学评价工具和问卷的非限制性实例包括以下度量方法。
[0156]
精神病症诊断和统计手册(dsm-5)包括修订的ptsd诊断标准。参见american psychiatric association:diagnostic and statistical manual of mental disorders,第五版.arlington,va.,american psychiatric association,2013。还参见ptsd.va.gov/professional/ptsd-verview/dsm5_criteria_ptsd.asp。
[0157]
dsm-iv轴i障碍患者版的结构化临床访谈(scid-p)是一种半结构化访谈，其提供探索性问题以及临床医生提出的后续问题以协助诊断。first等人,structured clinical interview for dsm-iv tr axis i disorders,research version,patient edition(scid-i/p).new york:new york state psychiatric institute,biometrics research；2001。它包括获取有关人口统计、工作、主诉、现病史、过去病史、治疗史和当前功能的信息的概述。scid-p的主体包括9个模块，其被设计用于诊断总共51种精神疾病。
[0158]
dsm-5的scid-p是scid
‑‑
患者版本，并且是被修改以纳入新的dsm-5标准的scid的下一版本。
[0159]
临床医生管理的ptsd量表(caps)是一种结构化临床访谈，其被设计用于评估如通过dsm-iv定义的ptsd的基本特征。weathers等人,clinician-administered ptsd scale:a review of the first ten years of research.depress anxiety.2001；13(3):132-156。caps可用于提供诊断状态的分类评定以及症状严重程度的定量指数。频率和强度评分都是针对每个单独的症状得出的。caps总分是基于个体对评估当前ptsd症状的频率和强度的17个项目的反应。caps的分量表用于评估特定的症状群。总分可以在0至136的范围内。
[0160]
dsm-5的临床医生管理的ptsd量表(caps-5)是一种30项结构化访谈，其可用于对ptsd进行当前(过去一个月)诊断、对ptsd进行终生诊断，以及评估过去一周的ptsd症状。caps-5是一种30项问卷，对应于ptsd的dsm-5诊断。caps-5的语言既反映了现有症状的变
化，又反映了dsm-5中新症状的增加。weathers,f.w.等人,(2013).the clinician-administered ptsd scale for dsm-5(caps-5)。
[0161]
治疗结果ptsd量表(top-8)是一个简短的采访者管理的量表，其专门设计用于评估ptsd的常见体征和症状，这些体征和症状会响应于治疗而发生改变(davidson,j.r.和colket,j.t.(1997).the eight-item treatment-outcome post-traumatic stress disorder scale:a brief measure to assess treatment outcome in post-traumatic stress disorder.international clinical psychopharmacology,12(1),41-45)。top-8包括8个项目，每个项目在0-4的量表上进行测量，并为每个项目提供了定义的锚点。所述项目代表了ptsd的三个核心特征，最高可能评分为32。
[0162]
汉密尔顿焦虑精神病学评定量表(hamilton psychiatric rating scale for anxiety，ham-a)是一种广泛使用的焦虑严重程度的观察评定量表。该量表由14个项目组成。每个项目在0至4的量表上进行评定。该量表被施用于评估焦虑的严重程度及其在治疗过程中的改善情况。ham-a总分是14个项目的总和并且评分范围为0至56。hamilton m.the assessment of anxiety-states by rating.br j med psychol.1959；32(1):50-55。
[0163]
蒙哥马利-阿斯伯格抑郁评定量表(montgomery-asberg depression rating scale，madrs)是一种10项工具，用于评价成人的抑郁症状以及评估这些症状的任何变化。montgomery s.a.等人,a new depression scale designed to be sensitive to change.br j psychiatry.1979年4月,134:382-389。10个项目中的每一个都在0至6的量表上进行评定，每个项目有不同的描述词。这些单独的项目评分相加在一起形成总分，总分可在0至60分的范围内。
[0164]
杨氏躁狂评定量表第1项(young mania rating scale,item 1，ymrs-1)用于评估输液日的情绪高涨。young r c等人,rating-scale for mania
‑‑
reliability,validity and sensitivity.br j psychiatry.1978；133(11月):429-435。
[0165]
简要精神病评定量表(brief psychiatric rating scale，bprs)用于评估输注期间的急性行为变化。overall j e等人,the brief psychiatric rating-scale.psychol.rep.1962；10(3):799-812。使用了精神病阳性( )症状的四个关键bprs项目：概念混乱、幻觉行为、多疑和不寻常的思想内容。还将使用代表精神病阴性(-)症状的三个项目：情感迟钝、情绪退缩和运动迟缓。
[0166]
临床医生管理的解离状态量表(cadss)用于测量输注期间的解离效应。bremner j d等人,measurement of dissociative states with the clinician-administered dissociative states scale(cadss).j trauma stress.1998；11(1):125-136。所述量表包括19个问题和8个观察者评定，评分从0(完全没有)至4(非常)。cadss衡量身体知觉、环境知觉、时间知觉、记忆障碍和不真实感的损害。
[0167]
患者副作用评定调查表(patient rating inventory of side effects，prise)是一份患者自陈报告，用于通过鉴定和评价每种症状的耐受性来确定副作用。levine j,schooler n r.saftee:a technique for the systematic assessment of side effects in clinical trials.psychopharmacol bull.1986；22(2):343-381。
[0168]
临床总体印象(clinical global impression，cgi)量表评估精神病患者的治疗反应。施用时间为2分钟。该量表由三个项目组成：疾病严重程度(第1项)；总体改善(第2
2-subtest，wasi-2)是6至89岁的可靠的iq简短度量方法，包括词汇(语言流畅能力的估计)和矩阵推理(非语言流畅能力的估计)。wechsler d.wechsler abbreviated scale of intelligence san antonio,tex.:psychological corporation；1999。它广泛用于临床、教育和研究环境。平均信度系数为0.96并且重测信度(test-retest reliability)为0.88。
[0176]
霍普金斯语言学习测试(hopkins verbal learning test，hvlt)是一项记忆获取和延迟回忆单词的可重复测试。受试者在3次学习试验中看到相同的12个项目列表，并被要求每次重复每个列表上的项目。延迟回忆和识别条件稍后进行。本研究中使用的因变量包括3次试验的总学习(对于习得变量)和总延迟回忆评分(对于回忆分量)。brandt j,benedict r.hopkins verbal learning test,revised.odessa,fla.:psychological assessment resources；1997。
[0177]
情绪状态概况-双极(profile of mood states-bipolar，poms-bi)量表衡量主要在临床而不是非临床环境中的情绪和感觉。它可以帮助确定个体的精神状态以进行治疗，或用于比较与各种人格障碍相关的情绪概况。它也是确定药物治疗效果的有用工具。
[0178]
创伤后认知调查表(post-traumatic cognitions inventory，ptci)是一种33项量表，按李克特型(likert-type)量表评定，范围从1(完全不同意)至7(完全同意)。三个分量表形成量表评分，其显示出高度的相关性(rs＝0.57-0.75)。
[0179]
新认知量表是一种6项试验量表，按李克特型量表评定，范围从1(根本不是)至4(很多)。所述量表是基于创伤后成长调查表(post traumatic growth inventory，ptgi)，从中直接选择项目(也将新项目添加到量表中)，以及基于brief-cope(参见carver,c.s.(1997)"you want to measure coping but your protocol's too long:consider the brief cope."international journal of behavioral medicine 4；92-100)。
[0180]
医疗结果研究(mos)社会支持调查是一种19项的自陈报告度量方法，其被设计用于评估功能性社会支持的水平。mos-ss有两个分量表(情感和工具性社会支持)来识别潜在的社会支持缺陷(sherbourne,c.d.和stewart,a.l.(1991)."the mos social support survey."soc sci med 32(6):705-714)。
[0181]
人生目的测试-简短形式(pil-sf)是20项人生目的测试的简短4项形式。这个量表要求受访者报告他们在多大程度上实现了他们的生活目标，以及他们在多大程度上认为自己的生活有意义或有目的。(schulenberg等人,2010；psychotherapy(chic).2008年12月；45(4):447-63)。
[0182]
创伤后成长调查表(posttraumatic growth inventory，ptgi)-简短版是ptgi自陈报告问卷(ref)的10项缩略版。它要求受访者对他们因经历高应激生活事件而改变的程度进行评定。项目跨越以下五个领域的积极变化：与他人相关、新的可能性、个人力量、精神变化和对生活的欣赏(cann,a.等人,(2010).a short form of the posttraumatic growth inventory.anxiety,stress&coping,23,127-137)。
[0183]
生活质量享受和满意度问卷(quality of life enjoyment and satisfaction questionnaire，q-les-q)是一种自陈报告量表，用于衡量受试者在日常功能的各个领域所体验到的享受和满足程度。总分是一组抑郁受试者中这些维度的可靠且有效的度量(endicott j等人,quality of life enjoyment and satisfaction questionnaire:a new measure.psychopharmacology bulletin；1993；29:321-326)。
[0184]
在某些实施方案中，对被治疗的受试者进行自我评价。
[0185]
药物组合物
[0186]
虽然本发明药剂以及其盐、溶剂化物和生理功能衍生物可作为原料化学品施用，但也可将活性成分作为药物组合物提供。相应地，本发明还提供了一种药物组合物，其包含本发明化合物和/或其盐、溶剂化物和生理功能衍生物，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。载体、稀释剂或赋形剂在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上必须是可接受的。根据本发明的另一方面，还提供了一种制备药物组合物的方法，包括将本发明化合物或其盐、溶剂化物和生理功能衍生物与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。
[0187]
术语“组合物”，如在药物组合物中一样，旨在涵盖包含构成载体的活性成分和惰性成分(药学上可接受的赋形剂)的产品，以及由任何两种或更多种成分的组合、复合或聚集，或由一种或多种成分的解离，或由一种或多种成分的其他类型的反应或相互作用直接或间接产生的任何产品。因此，本发明的药物组合物涵盖通过混合化合物20和药学上可接受的赋形剂制成的任何组合物。
[0188]
用于治疗用途的可接受的赋形剂、稀释剂和载体在制药领域中是众所周知的，并且描述于例如remington:the science and practice of pharmacy.lippincott williams&wilkins(a.r.gennaro编辑.2005)。药物赋形剂、稀释剂和载体的选择可根据预期的施用途径和标准药物实践进行选择。
[0189]
如本文所用，短语“药学上可接受的”是指“通常被认为是安全的”的分子实体和组合物，例如当施用于人类时，其为生理上可耐受的并且通常不会产生过敏或类似的不良反应，例如胃部不适、头晕等。优选地，如本文所用，术语“药学上可接受的”是指经联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出用于动物，更特别地用于人类。
[0190]
本发明的药物组合物可以单位剂量形式存在，每单位剂量含有预定量的活性成分。根据所治疗的疾患、施用途径以及患者的年龄、体重和状况，这样的单元可包含例如5μg至1g、优选地1mg至700mg、更优选地5mg至100mg的本发明化合物。因此，此类单位剂量可以每天施用多于一次。优选的单位剂量组合物是含有如上文所述的日剂量或分剂量(用于每天施用多于一次)或其适当分率的活性成分的那些组合物。此外，此类药物组合物可通过药学领域众所周知的任何方法来制备。
[0191]
本发明的药物组合物可适于通过任何适当途径，例如通过口服(包括口腔或舌下)、吸入、经鼻、经眼或肠胃外(包括静脉内和肌肉内)途径施用。可注射本发明组合物。此类组合物可通过药学领域已知的任何方法制备，例如通过将活性成分与载体或赋形剂结合。
[0192]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种适于通过口服途径施用治疗应激诱发的情感障碍的药物组合物。
[0193]
适于口服施用的本发明药物组合物可以离散单元形式提供，例如胶囊或片剂；粉末或颗粒；于水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；可食用的泡沫或鞭状物；或水包油液体乳液或油包水液体乳液。
[0194]
例如，对于片剂或胶囊形式的口服施用，活性药物组分可与口服的、无毒的药学上
可接受的惰性载体如乙醇、甘油、水等组合。通过将化合物粉碎至合适的细粒度并与类似粉碎的药物载体如可食用碳水化合物(例如淀粉或甘露醇)混合来制备粉末。还可存在调味剂、防腐剂、分散剂和着色剂。
[0195]
胶囊通过制备如上所述的粉末混合物并填充形成的明胶鞘而制成。在填充操作之前，可将助流剂和润滑剂如胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固体聚乙二醇添加到粉末混合物中。还可加入崩解剂或增溶剂，例如琼脂、碳酸钙或碳酸钠，以提高胶囊摄入时药物的可用性。
[0196]
此外，当需要或必要时，还可将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入混合物中。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。例如，通过制备粉末混合物，造粒或压块，添加润滑剂和崩解剂并压制成片剂来配制片剂。通过将适当粉碎的化合物与上述稀释剂或碱以及任选地与粘合剂如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮、溶液阻滞剂如石蜡、再吸收促进剂如季铵盐和/或吸收剂如膨润土、高岭土或磷酸二钙混合来制备粉末混合物。粉末混合物可通过用粘合剂如糖浆、淀粉糊、阿拉伯胶或纤维素或聚合物材料的溶液润湿并强制过筛来制粒。作为制粒的替代方法，粉末混合物可通过压片机，结果是破碎成颗粒的不完全成型的块状物。可通过添加硬脂酸、硬脂酸盐、滑石粉或矿物油来润滑颗粒以防止粘附在片剂成型模具上。然后将润滑的混合物压制成片剂。本发明的化合物还可与自由流动的惰性载体组合并直接压制成片剂，而无需经过制粒或压块步骤。可提供由虫胶密封涂层、糖或聚合物材料涂层和蜡抛光涂层组成的透明或不透明保护涂层。可将染料添加到这些涂层中以区分不同的单位剂量。
[0197]
口服液例如溶液、糖浆和酏剂可以剂量单位形式制备，使得给定量含有预定量的化合物。糖浆可通过将化合物溶解在适当调味的水溶液中来制备，而酏剂可通过使用无毒的酒精媒介物来制备。悬浮液可通过将化合物分散在无毒媒介物中来配制。还可加入增溶剂和乳化剂如乙氧基化异硬脂醇和聚氧乙烯山梨糖醇醚、防腐剂、风味添加剂如薄荷油或天然甜味剂或糖精或其他人造甜味剂等。
[0198]
应当理解，除了上面特别提到的成分之外，考虑到所讨论的制剂的类型，组合物可包括本领域常规的其他试剂，例如适合口服施用的那些可包括调味剂。
[0199]
本发明化合物的治疗有效量将取决于许多因素，包括例如受试者的年龄和体重、需要治疗的确切疾患及其严重程度、制剂的性质和施用途径，并最终由主治医师或兽医决定。
[0200]
药盒
[0201]
还提供了用于预防性治疗应激诱发的情感障碍的本发明方法的药盒。
[0202]
药盒可包括本文提供的药剂或组合物，以及向医疗保健提供者提供关于根据本发明方法的使用的信息的说明。药盒可任选地包含第二药剂或组合物。说明可以印刷形式或电子介质(例如软盘、cd或dvd)的形式提供，或者以可获得此类说明的网站地址的形式提供。本文提供的化合物或组合物或第二药剂或组合物的单位剂量可包括这样的剂量，使得当施用于受试者时，化合物或组合物的治疗或预防有效血浆水平可在受试者中维持至少1
天。在一些实施方案中，化合物或组合物可作为无菌水性药物组合物或干粉(例如冻干)组合物被包括在内。在一些实施方案中，提供了合适的包装。如本文所用，“包装”包括通常用于系统中并且能够将本文提供的化合物和/或适合施用于受试者的第二药剂保持在固定限度内的固体基质或材料。此类材料包括玻璃和塑料(例如聚乙烯、聚丙烯和聚碳酸酯)瓶、小瓶、纸、塑料和塑料箔层压封套等。
[0203]
本文所述的药盒包含一个或多个容器，其含有如所述的化合物、信号实体、生物分子和/或颗粒。药盒还包含用于混合、稀释和/或施用化合物的说明。药盒还包括装有一种或多种溶剂、表面活性剂、防腐剂和/或稀释剂(例如，盐水(0.9％nacl)或5％右旋糖)的其他容器，以及用于将组分混合、稀释或施用到样品或需要这种治疗的患者的容器。
[0204]
药盒的组合物可以任何合适的形式提供，例如，作为液体溶液或作为干粉。当所提供的组合物是干粉时，可通过添加合适的溶剂来重构所述粉末，所述溶剂也可以被提供。在使用液体形式的组合物的实施方案中，液体形式可以是浓缩的或即用的。溶剂将取决于化合物和使用或施用模式。用于药物组合物的合适溶剂是众所周知的并且可在文献中获得。溶剂将取决于化合物和使用或施用模式。
[0205]
药盒包括被隔开以在密闭空间中接收一个或多个容器如小瓶、管子等的载体，每个容器包含要在所述方法中使用的单独元件之一。例如，容器之一可包含测定法中的阳性对照。此外，所述药盒可包括用于其他组分的容器，例如可用于测定的缓冲液。
[0206]
除非另有说明，否则在本公开和相关权利要求中使用的所有表示成分、性质等的数量的数字应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则本公开和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，其可根据本发明的实施例寻求获得的所需特性而变化。至少，而不是试图将等效原则的应用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。需要说明的是，当“约”在数字列表的开头时，“约”修饰数字列表的每个数字。此外，在范围的一些数字列表中，所列出的一些下限可能大于所列出的一些上限。本领域技术人员将认识到，所选子集将需要选择超过所选下限的上限。术语“约”是指参考值的
±
10％。换句话说，数值可在所述值的90％至所述值的110％的范围内。
[0207]
根据以下实施例将更好地理解本发明。然而，本领域技术人员将容易理解，所讨论的具体方法和结果仅仅是对本发明的说明，如在随后的权利要求中更充分地描述的。
[0208]
实施例
[0209]
实施例1：5-ht4r激动剂对抗应激的预防功效
[0210]
增强应激韧性可防止高危人群免受应激诱发的精神病症。我们之前曾报道过，在应激前1周施用时，(r,s)-氯胺酮可作为对抗应激的预防剂。虽然我们已经证明选择性5-羟色胺(5-ht)(血清素)再摄取抑制剂(ssri)氟西汀(flx)作为预防剂无效，但我们假设其他血清素能化合物如血清素4受体(5-ht4r)激动剂可起到预防剂作用。我们测试了三种具有不同亲和力的5-ht4r激动剂是否可通过利用慢性皮质酮(cort)施用或情境恐惧条件反射(cfc)来防止两种小鼠品系中的应激。向小鼠施用不同剂量的盐水、(r,s)-氯胺酮、flx、rs-67,333、普卡必利或pf-04995274，然后在1周后接受慢性cort或cfc。在c57bl/6n小鼠中，慢性flx施用减弱了cort诱导的体重变化，并增加了高架十字迷宫(epm)中的开放臂进入。慢性rs-67,333施用减弱了cort介导的体重变化，并防止抑郁样和焦虑样行为。在129s6/svev
小鼠中，rs-67,333减弱了雄性而非雌性小鼠的习得性恐惧。rs-67,333在强迫游泳试验(fst)中对应激诱发的抑郁样行为无效，但可防止两种性别中的焦虑样行为。普卡必利和pf-04995274减弱了习得性恐惧并减少了应激诱发的抑郁样行为。(r,s)-氯胺酮或普卡必利施用后的电生理学记录揭示，这两种药物都改变了ca3中ampa受体介导的突触传递。这些数据表明，除了(r,s)-氯胺酮外，5-ht4r激动剂也是有效的应激预防剂，表明5-ht4r可能是预防性药物开发的新型靶标。
[0211]
在此，我们假设由于5-ht4r与抑郁和焦虑密切相关，因此它们可能在应激韧性中起作用。我们将研究重点放在了三种具有不同亲和力的5-ht4r激动剂上。首先，rs-67,333(1-(4-氨基-5-氯-2-甲氧基苯基)-3-[1(正丁基)-4-哌啶基]-1-丙酮盐酸盐)是一种高亲和力的5-ht4r部分激动剂[22]。这种药物可有效改善行为缺陷，减少淀粉样蛋白斑块的数量以及淀粉样蛋白β(aβ)种类的水平，并减少阿尔茨海默病(ad)5xfad小鼠模型中的海马星形胶质细胞增生症和小胶质细胞增生症[23]。其次，普卡必利(4-氨基-5-氯-2,3-二氢-n-[1-3-甲氧基丙基)-4-哌啶基]-7-苯并呋喃甲酰胺单盐酸盐)是一种选择性、高亲和力的5-ht4r激动剂[24]。在2018年，其获fda批准用于慢性便秘并且目前正在接受测试用于慢性假性肠梗阻。普卡必利还在两项独立的临床试验中进行了测试，以研究其在急性(例如，单剂量)或慢性(例如，1周)施用后对健康志愿者情绪处理的影响[25,26]。第三，pf-04995274(4-[4-[4-四氢呋喃-3-基氧基)-苯并[d]异噁唑-3-基氧基甲基]-哌啶-1-基甲基]-四氢吡喃-4-醇)是一种有效的部分5-ht4r激动剂[27]。进行了一项临床试验，以评价单独或与多奈哌齐组合的pf-04995274对东莨菪碱诱导的健康成人精神运动和认知功能缺陷的影响；然而，该试验被终止，但并非出于安全考虑[28]。目前，正在进行一项临床试验，以测试与安慰剂相比，pf-04995247的辅助施用是否对介导的难治性(trd)抑郁患者的情绪处理和神经活动产生积极影响[29]。
[0212]
为了确定5-ht4r激动剂是否可能是对抗应激的潜在预防剂，我们在两种不同的小鼠品系(c57bl/6ntac和129s6/svev)中使用了两种不同的应激模型(急性和慢性)。我们发现rs-67,333、普卡必利和pf-04995274可减弱习得性恐惧。rs-67,333在慢性施用时可防止抑郁样行为，并且在急性施用时可在两种性别中防止应激诱发的焦虑样行为。普卡必利和pf-04995274减少fst中应激诱发的抑郁样行为。为了研究预防性(r,s)-氯胺酮和5-ht4r激动剂的共同或不同机制，我们利用切片电生理学来研究ca3中的自发性谷氨酸能传递。我们发现(r,s)-氯胺酮和普卡必利减弱了大幅值ampa受体介导的突触电流的爆发。这些数据表明，除了(r,s)-氯胺酮外，5-ht4r激动剂也是有效的应激预防剂，并且可能改变与ampa相关的谷氨酸能传递以增强应激韧性。
[0213]
材料和方法
[0214]
小鼠：所有小鼠均饲养在22℃的12小时(06:00-18:00)明暗居室中。随意提供食物和水。在光照阶段进行行为测试。
[0215]
c57bl/6ntac小鼠：雄性c57bl/6ntac小鼠购自taconic farms(lille skensved,denmark)，8周龄，并在cort治疗开始前每笼饲养5只。所有测试均按照实验室动物护理指南和机构动物护理和使用委员会(iacuc)批准的方案进行(european directive,2010/63/eu for the protection of laboratory animals,permissions#92-256b,authorization ethical committee ceea n
°
26 2012_098)。
[0216]
129s6/svev小鼠：雄性和雌性129s6/svevtac小鼠购自taconic(hudson,ny)，7-8周龄。本文所述的程序是根据美国国立卫生研究院(nih)的规定进行的，并经纽约州精神病学研究所(nyspi)的iacuc批准。
[0217]
应激模型：
[0218]
皮质酮(cort)模型：在该模型中，c57bl/6ntac小鼠的糖皮质激素水平外源性增加。这种慢性cort升高以类似于临床抑郁症中观察到的方式使下丘脑-垂体-肾上腺轴(hpa)失调。cort治疗的剂量和持续时间是根据以前的研究选择的[20,30]。溶解在0.45％羟丙基-β-环糊精(β-cd)或媒介物(veh)(0.45％β-cd)中的cort(35μg/ml，相当于约5毫克/千克/天)在避光的不透明瓶中于饮用水中随意使用。经veh和cort处理过的水每3天更换一次，以防止可能的降解。
[0219]
情境恐惧条件反射(cfc)：如先前所公开[31,32]，施用了3次电击cfc程序。简而言之，将小鼠置于环境a中，并在置于环境a后的180s、240s或300s施用3次2s电击(0.75ma)。在电击终止后15s(在317s)，将小鼠从环境中移出。对于环境检索，将小鼠放回环境a持续300s。
[0220]
电生理学：电生理学按照之前的描述进行[33]。
[0221]
统计分析：数据分析的结果表示为平均值
±
sem。所有分析的alpha均设置为0.05。使用graphpad prism v7.0或v8.0分析数据。对于所有实验，除非另有说明，否则在适当时将重复测量的单向或双向anova应用于数据。显著的主效应和/或相互作用之后是费舍尔plsd事后分析或非配对t检验。所有主效应、相互作用和p值都列在表2中。
[0222]
药物：除非另有说明，否则所有药物均在生理盐水中制备，并且所有注射液均以每10mg体重0.1cc的体积腹膜内(i.p.)施用。
[0223]
盐酸氟西汀(flx)：在cort开始前3周，将flx(biotrend chemicals ag,bg197,zurich,德国)于饮用水(18毫克/千克/天)中施用持续3周。
[0224]
rs-67,333(rs)：rs-67,333(tocris bioscience,0989,bristol,英国)慢性施用或单次注射施用。对于慢性实验，rs-67,333(1.5毫克/千克/天)通过alzet渗透微型泵(alzet,2004型,cupertino,ca)施用[30]。对于急性实验，rs-67,333在cfc开始前1周以1.5、10或30mg/kg体重的单剂量施用。使用超声匀浆器(biologics,3000型,manassas,va)将rs-67,333溶解在盐水中。
[0225]
(r,s)-氯胺酮(k)：(r,s)-氯胺酮(ketaset iii，盐酸氯胺酮注射液，fort dodge animal health,fort dodge,ia)在cfc开始前1周以30mg/kg体重的单剂量施用。在129s6/svev实验中选择了30mg/kg体重的剂量，因为之前的研究表明这是预防功效的有效剂量[s1]。
[0226]
普卡必利：普卡必利(sigma,179474-81-8,st.louis,mo)在cfc开始前1周以3或10mg/kg体重的单剂量施用。使用超声匀浆器(biologics,3000型,manassas,va)将普卡必利溶解在盐水中。
[0227]
pf-04995274：pf-04995274(sigma,目录号1331782-27-4,st.louis,mo)在cfc开始前1周以3或10mg/kg体重的单剂量施用。使用超声匀浆器(biologics,3000型,manassas,va)将pf-04995274溶解在盐水中。
[0228]
渗透微型泵植入：alzet渗透微型泵(2004型，0.25μl/hr，28天)在异氟烷麻醉下皮
m systems,sequium,wa)使用微量移液器拉拔器(p-1000型；sutter instruments)制成。记录是在没有校正结电位的情况下进行的。通过axioskop-2fs(zeiss)上的红外差分干涉对比(ir-dic；40x物镜)光学器件可视化并靶向锥体细胞。
[0236]
结果
[0237]
rs-67,333的慢性施用可预防雄性小鼠中的应激
[0238]
我们之前曾报道过，慢性flx施用(施用3周)对129s6/svev小鼠没有预防作用[3]。然而，其他血清素能药物是否可作为预防剂仍有待确定。在此，我们在c57bl/6ntac雄性小鼠中施用cort之前，在饮用水中施用flx(18毫克/千克/天)或在渗透微型泵中施用rs-67,333(1.5毫克/千克/天)，持续3周，然后是一系列行为测定，包括epm、新奇抑制摄食(nsf)和蔗糖飞溅试验(st)(图1a-1b)。cort在6周的行为方案中使体重增加，如先前观察到的[34]，(图1c-1f)，但这通过flx和rs-67,333施用减弱。
[0239]
在epm中，与veh veh施用相比，cort veh、cort flx和cort rs-67,333施用没有改变在开放臂中花费的时间(图1g)。然而，与veh veh小鼠相比，cort veh小鼠表现出进入epm开放臂的次数显著减少(图1h)。与cort veh小鼠相比，cort flx和cort rs-67,333小鼠显著更多地进入epm的开放臂。在epm中行进的总距离在任何组之间没有差异(图1i)。
[0240]
接下来，施用nsf任务来测定焦虑样行为(图1j-1k)。与veh veh小鼠相比，cort veh小鼠表现出接近食物团粒的潜伏期增加。与cort veh小鼠相比，cort rs-67,333而不是cort flx小鼠表现出接近团粒的潜伏期显著降低。
[0241]
最后，在st中，与veh veh小鼠相比，cort veh小鼠表现出减少的梳理持续时间(图1l)。与cort veh小鼠相比，cort rs-67,333而不是cort flx小鼠表现出增加的梳理持续时间。这些数据表明，慢性rs-67,333而不是慢性flx施用可预防各种cort诱发的行为异常。
[0242]
单次注射rs-67,333减弱雄性小鼠的习得性恐惧并防止应激诱发的食欲减退
[0243]
以前，我们已经证实，单次注射(r,s)-氯胺酮可在129s6/svev小鼠中预防应激诱发的抑郁样行为并减弱习得性恐惧[3]。在此，我们试图确定单次注射rs-67,333是否也可预防单一急性应激源后的各种适应不良行为。向雄性129s6/svev小鼠注射盐水或rs-67,333(1.5、10或30mg/kg)(图2a)。一周后，对小鼠执行3次电击cfc。与施用盐水的小鼠相比，施用30而不是1.5或10mg/kg的rs-67,333的小鼠在cfc训练期间表现出显著更少的冻结(图2b)。五天后，小鼠重新暴露于训练环境。与施用盐水的小鼠相比，施用1.5或10而不是30mg/kg rs-67,333的小鼠表现出显著更少的冻结(图2c-2d)。
[0244]
在cfc之后，对小鼠执行fst。在第1天，与盐水小鼠相比，施用10而不是1.5或30mg/kg的rs-67,333的小鼠的不动显著较少(图2e)。然而，在第2天，所有组之间的不动时间相当(图2f-2g)。
[0245]
接下来，在of中测试施用盐水或rs-67,333(10mg/kg)的小鼠。两组小鼠的行进距离相当(图2h)，并且在竞技场中心花费的时间量相当(图2i)。随后，小鼠在epm中进行了测试，并且盐水或rs-67,333小鼠之间的开放臂中时间和进入迷宫的开放臂的次数都没有显著差异(图2j-2k)。
[0246]
最后，对小鼠执行nsf。被给予预防性rs-67,333(10mg/kg)的小鼠表现出接近团粒的潜伏期显著缩短(图2l-2m)。然而，在家养笼里吃掉的食物和食物剥夺后的体重减轻在各组之间都没有差异(图2n-2o)。总之，这些数据表明，在雄性129s6/svev小鼠中，如通过fst
所测量，单次注射rs-67,333可有效作为减弱习得性恐惧和预防应激诱发的食欲减退而不是抑郁样行为的预防剂。
[0247]
单次预防性注射rs-67,333防止雌性小鼠中应激诱发的焦虑样行为
[0248]
我们接下来试图确定单次注射rs-67,333是否也可对雌性小鼠起到预防作用。向雌性129s6/svev小鼠注射盐水或rs-67,333(1.5或10mg/kg)(图3a)。一周后，对小鼠执行3次电击cfc。所有组的小鼠在cfc训练期间都表现出相当的冻结水平(图3b)。五天后，小鼠重新暴露于训练环境。同样，所有组的小鼠表现出的冻结水平相当(图3c-3d)。在cfc之后，对小鼠执行fst。在fst的第1天(图3e)和第2天(图3f-3g)，所有组的小鼠的不动水平相当。
[0249]
接下来，小鼠在of和epm中进行了测试。所有组中的小鼠在of中行进的距离相当，并且在竞技场中心花费的时间量相当(图3h-3i)。类似地，在epm中，小鼠在迷宫的开放臂中花费的时间量相当(图3j)，并且进入开放臂的次数相当(图3k)。
[0250]
最后，在nsf范例中对小鼠进行测定。预防性rs-67,333(10mg/kg)而不是rs-67,333(1.5mg/kg)显著缩短了摄食潜伏期(图3l-3m)。在家养笼中吃掉的食物和食物剥夺后的体重减轻在各组之间均无差异(图3n-3o)。总之，这些数据表明rs-67,333在雌性129s6/svev小鼠中的nsf中不会减弱习得性恐惧或防止应激诱发的抑郁样行为，但可防止应激诱发的食欲减退。
[0251]
单次预防性注射普卡必利或pf-04995274可预防雄性小鼠中的应激
[0252]
我们接下来试图确定其他5-ht4r激动剂是否也可对雄性129s6/svev小鼠起到预防作用。向雄性129s6/svev小鼠注射盐水、(r,s)-氯胺酮(30mg/kg)、普卡必利(3或10mg/kg)或pf-04995274(3或10mg/kg)(图4a)。一周后，对小鼠执行3次电击cfc。所有组的小鼠在cfc训练期间表现出的冻结水平相当(图4b)。五天后，小鼠重新暴露于训练环境。正如我们之前所公开，(r,s)-氯胺酮减弱了习得性恐惧(图4c-4d)。有趣的是，与盐水施用相比，3mg/kg而不是10mg/kg的普卡必利和10mg/kg而不是3mg/kg的pf04995274减弱了习得性恐惧。
[0253]
在cfc之后，对小鼠执行fst。在第1天期间，所有组的小鼠的不动水平相当(图4e)。在第2天期间，与盐水施用相比，(r,s)-氯胺酮施用减少了不动时间(图4f-4g)。此外，与盐水施用相比，3mg/kg而不是10mg/kg的普卡必利和10mg/kg而不是3mg/kg的pf04995274减少了不动时间。
[0254]
接下来量化应激诱发的焦虑样行为。在of中，所有组的小鼠行进的距离相当(图4h)。在epm中，所有组的小鼠在开放臂中花费的时间相当(图4i)，并且进入开放臂的次数相当(图4j)。在nsf范例中，所有组的小鼠接近团粒的时间量相当(图4k-4l)。最后，所有小鼠在nsf范例期间的体重减轻量相当(图4m)。总之，这些数据表明，单次注射普卡必利或pf0499574通过减弱习得性恐惧和减少应激诱发的抑郁样行为而产生预防功效。然而，这些药物不能预防应激诱发的焦虑样行为。
[0255]
(r,s)-氯胺酮和普卡必利表现出通过减少ca3中大ampa受体驱动突触电流的爆发的共同机制
[0256]
我们接下来试图阐明(r,s)-氯胺酮和5ht4r激动剂如普卡必利之间的潜在共同机制。具体来说，我们假设(r,s)-氯胺酮和普卡必利之间对ca3中谷氨酸能传递的影响可能存在相似性，因为我们之前报道了预防性(r,s)-氯胺酮改变腹侧ca3(vca3)的活性，但在dg中并非如此[6]。为了测试这一点，向小鼠注射盐水、(r,s)-氯胺酮(30mg/kg)或普卡必利
(3mg/kg)，并在1周后实施安乐死(图5a)。我们对ca3锥体细胞中的自发兴奋性突触后电流(epsc)进行了全细胞电压钳记录。我们发现各组之间的平均epsc幅值(图5b)或epsc次数(图5c)没有差异。然而，我们确实发现经盐水治疗的小鼠通常显示出epsc的大爆发(-590.8
±
13.85pa)，这被ampa受体阻断剂nbqx完全阻断(图5d)。这些大的ampa受体介导的信号在(r,s)-氯胺酮治疗的小鼠(图5e)或普卡必利治疗的小鼠(图5f)中均不存在，表明尽管这些药物靶向不同的受体，但它们都以类似的方式改变了ampa介导的突触传递。
[0257]
讨论
[0258]
在此，我们假设5-ht4r激动剂可预防恐惧、抑郁样和/或焦虑样行为。我们测试了三种具有不同亲和力的5-ht4r激动剂是否可防止应激。rs-67,333的慢性施用可预防cort应激。单次注射rs-67,333可减弱雄性而非雌性129s6/svev小鼠的习得性恐惧，并预防两种性别中的nsf中应激诱发的食欲减退。rs-67,333的急性施用对应激诱发的抑郁样行为无效。单次注射普卡必利或pf-04995274可减弱习得性恐惧并减少抑郁样行为，但对焦虑样行为没有影响。此外，单次注射(r,s)-氯胺酮或普卡必利可减少ca3中大的、自发的ampa受体驱动的爆发，表明任一种药物可防止应激诱发的适应不良行为的共同机制。
[0259]
5-ht4r广泛分布于整个大脑，并在与情绪调节和认知功能相关的区域中大量表达。5-ht4r也在整个外周大量表达，并且在调节ens活动和功能中起着至关重要的作用。
[0260]
本研究中选择的三种5-ht4r激动剂对5-ht4r具有不同的亲和力(表1)。rs-67,333、普卡必利和pf-04995274对5-ht4r具有不同的选择性和亲和力。这些差异可能有助于药物在预防应激后的恐惧、抑郁样或焦虑样行为方面的预防功效。rs-67,333和pf-04995274是高亲和力5-ht4r部分激动剂，而普卡必利是一种选择性的高亲和力5-ht4r激动剂。rs-67,333减弱了习得性恐惧并防止新奇引起的食欲减退，但没有减少应激诱发的抑郁样行为。普卡必利和pf-04995274减弱了习得性恐惧并减少了抑郁样行为，但对焦虑样行为的各种度量没有影响。这些数据表明，rs-67,333对5-ht4r表现出的高pki和部分选择性的独特组合足以预防焦虑样行为，而普卡必利和pf-04995274对于5-ht4r的不同活性可防止应激诱发的抑郁样行为。需要进一步研究以确定5-ht4r是否以及如何有助于应激韧性的潜在神经生物学机制。
[0261]
表1.雄性小鼠中的行为结果的汇总
[0262][0263]
5-ht4r在中枢神经系统(cns)和外周内的表达和活性可能有助于深入了解这些机制。在大脑中，5-ht4r在与处理情绪有关的大脑区域中表达，包括hpc、amg和pfc[11,16,21,35,36]。除了许多其他功能，例如调节多巴胺和乙酰胆碱释放[36]，以及促进突触可塑性[36]，已知5-ht4r与钙效应蛋白p11相互作用[37]。5-ht4r与p11高度共表达，p11增加了hpc和amg中受体的表面表达，促进了其下游信号通路，并且是5-ht4r刺激的抗抑郁作用所必需的[37,38]。p11的水平与自杀倾向和ptsd的度量相关，表明其作为自杀意念和ptsd的生物标志物的潜力[39-41]。此外，pfc中5-ht4r的表达和活性受酪蛋白激酶2(ck2)的调节，ck2可能是抑郁样和焦虑样行为的重要调节剂[42]。检查5-ht4r激动剂及其对5-ht4r表达和活性的这些细胞调节剂的影响的进一步研究可进一步深入了解预防功效。
[0264]
因为所有三种5-ht4r激动剂都表现出类似于(r,s)-氯胺酮的预防特性，所以我们研究了这些化合物是否对ca3中的神经活动具有类似的影响。我们发现单次注射(r,s)-氯胺酮或普卡必利消除了在盐水对照中通常可见的ampa受体介导的突触电流的大量爆发，而不会显著改变epsc的整体幅值或次数。因此，尽管这些化合物靶向不同的受体，但它们可通过以收敛方式改变ampa受体依赖性谷氨酸能传递来实现类似的行为效果。尽管已知(r,s)-氯胺酮可抑制nmda受体[43-45]，但新出现的证据表明，(r,s)-氯胺酮还可作用于ampa受体以发挥其抗抑郁作用[46,47]。我们的结果与这些数据一致，并表明(r,s)-氯胺酮对ampa受体介导的谷氨酸能活性的作用可能有助于所述化合物的预防作用。此外，先前的研究表明，5-ht4r的药理学激活导致沿schaffer侧支的ca3-ca1突触的长期增强(ltp)[48]。结合这些数据，我们的结果表明，(r,s)-氯胺酮和5-ht4r激动剂通过减弱ca3自联网络中大的、自发的ampa受体驱动的突触事件，可降低海马回路中的整体噪声，这可能允许相关刺激的更大信噪比[49]。然而，需要进一步的研究来证实这一假设，并检查这种潜在机制是否直接有助于增强韧性。
[0265]
除了大脑内5-ht4r激动剂的作用外，这些化合物很可能在外周内产生另外的变化。5-ht4r在外周例如肠神经系统(ens)、肾上腺和心脏中表达[17]。重要的是，5-ht4r在维持沿肠脑轴交流方面发挥着重要作用。最近的数据表明，ens中的微生物群通过刺激存在于整个肠道中的5-ht4r来刺激大脑中的血清素释放[50]，从而与cns进行交流。同时，许多先前的研究表明，5-ht4r的激活对氧化应激具有神经保护作用，减少炎症，并刺激大脑和ens中的神经发生[50-52]。我们的操作可能刺激了肠脑交流，以促进神经保护和神经发生，从而增强对抗应激的韧性。我们假设这种作用可能对大脑中5-ht4r刺激的众多充分表征的结果产生了累加效应，例如增加内侧pfc(mpfc)中的神经元放电和增强hpc中的有丝分裂发生[19,35]，尽管这还有待确定。
[0266]
为了开发安全有效的增强应激韧性的药理学方法，有必要确定5-ht4r激动剂的毒性。由于5-ht4r在整个外周广泛表达，长期接触这些药物可能会导致负面结果[17]。我们发现慢性施用rs-67,333不会导致不良副作用。然而，由于我们没有进行额外的测定，例如评估心血管活动或肝脏毒性的变化，因此不可能知道慢性5-ht4r施用是否会对外周器官产生负面影响。尽管如此，我们测试的药物即使在单次给药后也能有效增强应激韧性，从而避免慢性施用。
[0267]
在此，我们利用两种品系，即c57bl/6ntac和129s6/svev，以验证rs,67-333在应激和基于恐惧的应激源的神经内分泌模型中的作用。在c57bl/6ntac小鼠中，我们发现预防性rs-67,333可有效减少抑郁样和焦虑样行为，而在129s6/svev小鼠中，我们发现在nsf中预防性rs-67,333可有效减弱习得性恐惧和预防焦虑样行为，但不会减少抑郁样行为。
[0268]
研究将5-ht4r激动剂作为速效抗抑郁药的先前研究仅使用雄性受试者[19,20,54]。然而，先前的研究表明，抗抑郁药(r,s)-氯胺酮表现出性别特异性的行为和神经生物学效应。在整个发情周期中，抗抑郁药(r,s)-氯胺酮在雌性小鼠中的功效各不相同，并且这种差异可能归因于神经营养因子(例如bdnf)水平的变化或整个发情周期中nmda受体活性的变化[55,56]。此外，急性(r,s)-氯胺酮施用可能导致雄性而不是雌性小鼠的mpfc和hpc中glur1和glur2ampa受体亚基的持续增加[45,46,57,58]。尽管大量研究表明对雄性啮齿动物具有预防功效，但迄今为止只有一项研究对雌性啮齿动物进行了检查[59]。maier及其同事表明，预防性(r,s)-氯胺酮减少了应激诱发的中缝背核(drn)激活，并消除了雌性大鼠中的drn依赖性社会探索缺陷。然而，这项研究并没有像此处所做的那样衡量恐惧、抑郁样和焦虑样行为。尽管如此，我们表明rs-67,333不会减弱雌性129s6/svev小鼠中的习得性恐惧或预防抑郁样行为，但确实可防止应激诱发的焦虑样行为。因此，我们的数据表明，5-ht4r激动剂可能专门靶向雌性小鼠中的焦虑样而不是与抑郁或恐惧相关的行为的潜在神经回路。我们没有使用雌性c57bl/6ntac小鼠，因为我们之前的一项研究表明雌性c57bl/6ntac小鼠对慢性cort不敏感[60]。
[0269]
总体而言，本研究已确定三种新型化合物可有效预防两种类型的应激，并且适用于两种性别。这些数据表明5-ht4r可成为预防性发展的新靶标，并且未来的研究可针对在应激源之前施用的5-ht4r激动剂如何产生应激韧性。
[0270]
表2.统计分析汇总
[0271]
[0272]
[0273]
[0274]
[0275]
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[0301]
[0302]
[0303]
[0304]
[0305]
[0306]
[0307]
[0308]
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s5 petit-demouliere b，chenu f，bourin m.forced swimming test in mice：a review of antidepressant activity.psyhopharmacology(berl).2005；177(3)：245-55.
[0378]
s6 lindholm js，autio h.vesa l，antila h，lindemann l，hoener mc，et al.the antidepressant-like effects of glutamatergic drugs ketamine and ampa receptor potentiator ly 451646are preserved in bdnf( )/(-)heterozygous null mice.neuropharmacology.2012；62(1)：391-7.
[0379]
s7 ghasemi m，raza m，dehpour ar.nmda receptor antagonists augment antidepressant-like effects of lithiun in the mouse forced swimming test.j psychopharmacol.2010；24(4)：585-94.
[0380]
s8 liu rj，iee fs，li xy，bambico f，duman rs，aghajanian gk.brain-derived neurotrophic factor val66met allele impairs basal and ketamine-stinulated synaptogenesis in prefrontal cortex.biol psychiatrv.2012；71(11)：996-1005.
[0381]
实施例2 rs67333(一种血清素4型受体激动剂)和地西泮(一种苯二氮卓类药物)的快速抗焦虑效应是由从前额叶皮层向中缝背核的投射介导
[0382]
概要
[0383]
背景：激活血清素(5-ht)4受体(5-ht4r)已被证明在多种动物模型中具有抗焦虑
效应。表征导致这些效应的回路应提供对治疗焦虑的新方法的深入见解。
[0384]
方法：我们评价了从内侧前额叶皮层(mpfc)到中缝背核(drn)产生的谷氨酸能轴突末端中的急性5-ht4r激活是否会诱导快速抗焦虑效应。在小鼠中检查了急性全身施用(1.5mg/kg，腹膜内，i.p.)或mpfc内输注5-ht4r激动剂rs67333(0.5mg/侧)的抗焦虑效应。为提供rs67333的抗焦虑效应募集mpfc-drn神经回路的证据，进行了drn血清素(5-ht)神经元放电率、大脑5-ht消耗和光遗传学激活/沉默的体内记录。
[0385]
结果：rs67333的急性全身施用和mpfc内输注产生快速抗焦虑效应并增加drn 5-ht细胞放电。血清素消耗阻止了mpfc输注rs67333引起的抗焦虑效应。令人惊讶的是，mpfc输注地西泮(1.5mg/侧)的抗焦虑效应也被5ht消耗阻断。靶向drn的光遗传学激活mpfc末端减少了焦虑，而使该回路沉默可阻断rs67333和地西泮mpfc输注诱导的抗焦虑效应。最后，在光遗传学抑制drn中的皮层谷氨酸能末端后，由急性全身rs67333或地西泮施用引起的抗焦虑效应被部分阻断。
[0386]
结论：我们的研究结果表明，急性激活mpfc中的5-ht4r或靶向drn中的mpfc锥体细胞末端，可能构成产生快速抗焦虑反应的策略。
[0387]
与ssri不同，用rs67333(一种5-ht4r激动剂)进行治疗(a13)，通过独立于神经发生的机制(a5)诱导快速抗焦虑/抗抑郁样效应。尽管许多研究已评估了亚慢性或慢性治疗后5-ht4r调节的抗焦虑/抗抑郁样活性，但很少有人对其急性抗焦虑样概况进行评价。相互矛盾的证据表明5-ht4r拮抗剂具有急性抗焦虑样效应(a14,a15)。两份报告显示5-ht4r拮抗剂sb 204070、gr 113808(a15)和sb 207266a(a14,a15)在高架十字迷宫(epm)中对大鼠有抗焦虑效应。然而，另一项研究没有检测到拮抗剂sb 204070和gr 113808对epm中开放臂进入次数的影响(a15)。类似地，在明/暗选择测试中未检测到5-ht4r拮抗剂对焦虑样行为的直接影响(a16)。这些差异的原因尚不清楚。相比之下，急性5-ht4r激活已被证明是获得快速抗焦虑样反应的令人鼓舞的药理学策略。最近，rs67333的急性施用在小鼠中诱导了抗焦虑样效应(a17)，并逆转了青春期长期接触大麻素的致焦虑效应(a18)。
[0388]
有趣的是，在内侧前额叶皮层(mpfc)中记录的锥体神经元中大约60％含有5-ht4r转录物和蛋白质。mpfc中这些胞体树突5-ht4r的激活导致drn中的谷氨酸释放，以刺激5-ht神经元的放电(a19)。大量证据还表明，mpfc向drn的投射会调节焦虑和抑郁相关行为(a20-a22)。事实上，对pfc中v层锥体细胞的慢性光刺激在焦虑/抑郁小鼠模型中诱导了持久的抗焦虑样效应(a23)，并且对靶向drn的mpfc末端的抑制诱导了社交应激小鼠的焦虑样行为的持久抑制(a24)。最后，最近的一项研究揭示了drn回路在特异于环境的适应性行为中的关键作用(a25)。因此，从mpfc到drn的投射可能会介导5-ht4r激活的抗焦虑效应。
[0389]
在此，我们使用预测抗焦虑样活性的行为范例，首先评价了在雄性balb/cjrj焦虑小鼠中使用rs67333或gabaa调节剂地西泮进行急性全身或mpfc内施用的后果(a26)。然后，使用光遗传学技术，我们评估了从mpfc到drn产生的谷氨酸能轴突末端对快速抗焦虑样效应的贡献。
[0390]
材料和方法
[0391]
受试者
[0392]
雄性balb/cjrj小鼠(janvier labs,le genest-st-isle,法国)为7-8周龄，体重25-30g，并保持12h光照:12h黑暗时间表(在06:00小时光开启)。除了在行为观察期间，随意
提供食物和水。这些方案是根据符合国家和国际法律和政策的机构指导方针进行的(council directive#87-848,1987年10月19日,minist
è
re de l’agriculture et de la for
ê
t,service v
é
t
é
rinaire de la sant
é
et de la protection animale,permissions#92-256b to djd,institutional animal care and use committee 26authorization#4074)。
[0393]
药物
[0394]
将以1.5mg/kg腹膜内(i.p.)施用(a-s1)或以0.5μg/侧在内侧前额叶皮层(mpfc)局部施用(a-s2,a-s3)的1-(4-氨基-5-氯-2-甲氧基苯基)-3-(1-丁基-4哌啶基)-1-丙酮盐酸盐[rs67333，一种血清素4受体(5-ht4r)激动剂]和以1mg/kg i.p.施用(1)的5-氟-2-甲氧基-[1-[2-[(甲基磺酰基)氨基]乙基]-4-哌啶基]-1h-吲哚-3-甲基羧酸酯氨基磺酸盐(gr125487，一种5-ht4r拮抗剂)溶解在盐水(0.9％nacl)溶液中并购自tocris bioscience(bristol,英国)。rs67333显示对5-ht4r的高结合亲和力，pki为8.7(a-s4,a-s5)。除了以与5-ht4r相当的亲和力结合的σ受体(σ1:pki＝8.9；和σ2:pki＝8.0)外，rs67333对其他神经递质受体的pki小于6.7。在测试前45分钟，盐酸地西泮(溶解在0.5％20溶液，sigma-aldrich,saint-quentin fallavier,法国)以1.5mg/kg i.p.施用(a-s6)，或以1.5μg/侧在mpfc中局部施用(a-s7)。在测试前45分钟，盐酸氟西汀(溶解在盐水中，anawa trading,zurich,switzerland)以18mg/kg i.p.施用(a-s6)。对氯苯丙氨酸甲酯(p-cpa，溶解在tween 1％溶液中，sigma-aldrich,saint-quentin fallavier,法国)以150mg/kg i.p.施用，每天两次，连续3天(a-s8,a-s9)。
[0395]
治疗
[0396]
全身施用rs67333、地西泮或氟西汀
[0397]
在高架十字迷宫(epm)、新奇抑制摄食(nsf)或旷场(of)中测试前45min在三个独立的雄性balb/cjrj小鼠组别中注射rs67333(1.5mg/kg,i.p.)、地西泮(1.5mg/kg,i.p.)、氟西汀(18mg/kg,i.p.)。
[0398]
为了确保rs67333的抗焦虑样效应的选择性，在一个新组别的雄性balb/cjrj小鼠中，在rs67333施用(1.5mg/kg,i.p.)前15分钟注射溶解在0.9％nacl溶液中的gr125487(1.0mg/kg,i.p.)。epm或nsf在rs67333施用后45min发生(a-s1)。将gr125487 rs67333共同施用的行为后果与单独的rs67333、地西泮(1.5mg/kg,i.p.)、氟西汀(18mg/kg,i.p.)和媒介物组(0.9％盐水溶液，i.p.)进行比较。
[0399]
rs67333的mpfc局部输注
[0400]
对于mpfc药物输注，在麻醉(水合氯醛，400mg/kg,i.p.)下将两个双侧插管(插入27g不锈钢导管中的75μm直径二氧化硅毛细管)植入mpfc[从前囟开始的立体坐标(mm)：a＝ 2.10，l＝
±
0.50，v＝-2.60，a，前部；l，横向；和v，腹侧，根据(a-s10)]。第二天，在epm中以及在nsf中测试前45min，将rs67333(0.5μg/侧)以0.2μl/min的流速连续灌注到清醒自由移动的雄性balb/cjrj小鼠体内2分钟(legato
tm 180注射泵，kd scientific inc.,holliston,ma,usa)。地西泮(1.5mg/kg)用作阳性对照。
[0401]
血清素消耗
[0402]
在一个新组别的雄性balb/cjrj小鼠中，连续3天每天两次(在0900和1700h)施用p-cpa。然后在最后一次p-cpa施用后24h mpfc内施用rs67333(0.5μg/侧)和地西泮(1.5μg/
侧)，并且在局部输注后45分钟进行行为测试(epm)。
[0403]
对于p-cpa研究，在行为测试后立即处死动物，解剖额叶皮层并通过elisa方法(immusmol,法国)测量皮层脑匀浆中5-ht浓度减少以验证组织内容物的5-ht消耗。
[0404]
行为测试
[0405]
高架十字迷宫
[0406]
epm是一种广泛使用的啮齿动物行为测定法，并且它已被验证可评估药物制剂的抗焦虑效应(a-s11)。该测试如(a-s1)所述进行。迷宫是一个正十字形的装置，有两个开放臂和两个被墙壁围起来的臂，由中央平台连接，高于地面50cm。小鼠被单独放在迷宫的中心，面向开放臂，并被允许在5min内(对于急性全身施用或mpfc输注的行为后果)以及在6min内(对于光遗传学实验)探索迷宫。在开放臂中花费的时间和进入开放臂的次数被用作焦虑指数。使用视频跟踪器(epm3c，bioseb,vitrolles,法国)测量所有参数。
[0407]
新奇抑制摄食
[0408]
nsf是一项引发竞争动机的冲突试验：进食的动力和冒险进入灯火通明的竞技场中心的恐惧。开始进食的潜伏期被用作焦虑/抑郁样行为的指标，因为经典的抗焦虑药以及慢性抗抑郁药会降低这一量度。如前所述(a-s12)，nsf测试在10min时期内进行。简而言之，测试装置由一个塑料盒(50x50x20cm)组成，其地板上覆盖着大约2cm的木质衬垫。在行为测试前24小时，从家养笼中取出所有食物。在测试时，将一粒食物(常规饲料)放在位于盒子中央的白色纸平台上。将每只动物放在盒子的一角，并立即启动秒表。对摄食潜伏期(定义为小鼠坐在臀部并用前爪咬住团粒)计时。其后立即将动物转移到其家养笼中，并且测量小鼠在随后5min内消耗的食物量，作为食欲变化对照的一个可能混杂因素。
[0409]
旷场范例(of)
[0410]
在四个39
×
39cm perpex塑料露天箱(vivo-tech/ugo basile,salon de provence,法国)中量化运动活动。所述装置用特殊设计的40x40cm红外背光(单色波长850nm高均匀性，vivo-tech,salon de provence,法国)从地面照明。活动室由四个具有变焦光学和偏振滤光片的黑白相机(vivo-tech,salon de provence,法国)监测。对于光遗传学实验，专门选择了光学带通滤波器来改善跟踪检测。使用anymaze第6版视频跟踪软件(stoelting co/vivo-tech,salon de provence,法国)控制整个设置。相关的量度是在中心超过10min的全身施用时间或6min的光遗传学实验测试时间、总走动距离和在中心行进的走动距离除以总距离。
[0411]
体内电生理学记录
[0412]
中缝背核(drn)5-ht神经元根据以下标准进行鉴定：缓慢(0.5-2.5hz)和规律的放电率以及长持续时间、正动作电位，如先前所报道的(a-s13)。
[0413]
光遗传学操作
[0414]
病毒注射
[0415]
为了将视蛋白表达选择性地靶向drn中的皮层谷氨酸能末端，将获自karl deisseroth和ed boyden(unc vector core,nc,usa)的aav5-camkiiα-chr2增强黄色荧光蛋白(eyfp)、aav5-camkii-archt-绿色荧光蛋白(gfp)或aav5-camkii-eyfp双侧注射到mpfc(距前囟的mm，a＝ 2.10，l＝
±
0.50，v＝-2.60)中。注射有aav5-camkii-eyfp的小鼠用作对照。
[0416]
光纤构造
[0417]
正如我们之前描述的，对于所有实验，使用200μm芯、0.37数值孔径(na)多模光纤(thorlabs,maison laffitte,法国)通过连接到100mw 473nm蓝色和532nm绿色激光二极管(oem laser systems,usa)的跳接电缆进行光刺激(a-s14)。
[0418]
光纤植入和光遗传学程序
[0419]
balb/cjrj小鼠通过手术植入靶向drn的光纤(距前囟的mm，a＝-4.50，l＝ 1.20，v＝-4.0，角度15
°
)。一根200mm芯、0.37na光纤(thorlabs，对于chr2和arch-t分别为～10-12和15-16mw，位于光学器件的尖端)通过连接到473或532nm激光二极管(oem laser systems,usa)的跳接电缆进行光刺激，如前所述(a-s15)。对于行为实验，aav5-camkiiα-chr2-eyfp小鼠及其对照在3分钟时期内接受10hz刺激、20ms脉冲，而在整个3min测试时期内持续向aav5-camkii-archt-gfp传递绿光。将类似剂量的rs67333(局部地，在mpfc中，以0.5μg/侧或以1.5mg/kg，i.p.)和地西泮(局部地，在mpfc中，以1.5μg/侧或以1.5mg/kg，i.p.)输注在mpfc中或i.p.施用。在drn中mpfc投射的刺激或抑制与行为范例同时发生。
[0420]
免疫组织化学
[0421]
为了确保视蛋白表达，在麻醉(100mg/ml氯胺酮和20mg/ml甲苯噻嗪，i.p.)后对小鼠进行经心脏灌注(冷盐水2分钟，然后是4％冷pfa)。取出大脑并在4℃下用30％蔗糖进行冷冻保护。切开整个大脑得到35μm厚的冠状切片，并储存在含有0.1％叠氮化钠的1x磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。自由浮动切片在封闭缓冲液(0.5％triton x-100、5％正常驴血清(nds)、1x pbs)中室温孵育2小时。使用兔gfp tag多克隆抗体(1:500，thermo fisher scientific，目录#a-11122)在同一缓冲液中于4℃过夜检测eyfp和gfp。在1x pbs中洗涤后，将cy3-affinipure驴抗兔二次抗体(1:250，jackson immunoresearch,711-165-152)加入含10％nds的1x pbs缓冲液中，室温保持2小时。在1x pbs中冲洗几次后，将切片安装在载玻片上，风干，用fluoromont盖片并使用适当的滤光片在共焦显微镜(olympus bx51)下检查。
[0422]
统计分析
[0423]
使用prism 8.1.2软件(graphpad,san diego,ca,usa)分析数据分析结果，表示为平均值
±
sem。对于所有实验，适当时将student检验、单向或双向anova应用于数据。显著的主效应和/或相互作用之后是费舍尔plsd事后分析。在nsf中，由于数据缺乏正态分布，我们使用kaplan-meier生存分析和mantel-cox对数秩检验来评价实验组之间的差异。统计学显著性设定为p《0.05。所有统计检验和p值都列在表3-6中。
[0424]
结果
[0425]
急性全身5-ht4r刺激诱导快速抗焦虑样效应。
[0426]
为了评估推定的快速抗焦虑5-ht4r激活，在epm或nsf中的行为测试前45分钟，i.p.施用媒介物、氟西汀(18mg/kg)、地西泮(1.5mg/kg)或rs67333(1.5mg/kg)(图6a)。在epm中，与balb/cjrj小鼠中的媒介物和氟西汀施用相比，rs67333和地西泮的急性全身注射诱导了快速的抗焦虑样效应。rs67333和地西泮增加了在开放臂中花费的时间和时间百分比(单向anova，**p《0.01，相对于媒介物组，图1c和插图)。这种效应不太可能是自主活动变化的结果，因为对于两种药物，没有检测到该参数的变化，并且在开放臂中的走动距离除以总距离的比率显著增加(单向anova，**p《0.01，相对于媒介物组，图6d和插图)。
[0427]
为了评估rs67333诱导的抗焦虑样效应的选择性，我们还测试了5-ht4r拮抗剂gr125487(1mg/kg,i.p.)是否影响rs67333(1.5mg/kg)对焦虑样行为的反应。在此，gr125487在rs施用前15分钟施用(图11a)。在epm中，gr125487施用预防了rs67333引起的在开放臂中花费的时间和时间百分比增加，或在开放臂中的走动距离除以总距离的比率增加而不影响自主活动(单向anova，*p《0.05、**p《0.01或##p《0.01，分别相对于媒介物组和相对于rs67333组，图11b-11c和插图)。
[0428]
在另一项与焦虑相关的试验nsf中，我们发现rs67333和地西泮，与诱导致焦虑样效应的氟西汀不同，与盐水施用相比，减少了摄食潜伏期(kaplan-meier生存分析和单向anova，**p《0.01，相对于媒介物组，插图，图6e-6f和插图)而不影响家养笼食物消耗量。此外，gr125487在不影响食物消耗量的情况下屏蔽了rs67333对摄食潜伏期的影响(kaplan-meier生存分析和单向anova，**p《0.01或##p《0.01，分别相对于媒介物组和相对于rs67333组(图11d-11e和插图)。
[0429]
为了进一步验证这些结果，我们接下来在另一个与焦虑相关的试验即旷场(of)中测试了rs67333、氟西汀和地西泮的作用(图12a-12c)。我们发现，与氟西汀不同，急性rs67333和地西泮增加在中心花费的时间百分比(单向anova，*p《0.05，**p《0.01，图12b)而不影响自主活动。实际上，对于地西泮来说，在中心的走动距离除以总距离的比率显著增加，并且对于rs67333观察到趋势(单向anova，*p《0.05，**p《0.01，相对于媒介物组，图12c和插图)。总之，这些数据表明rs67333通过5-ht4r激活诱导快速抗焦虑样效应。
[0430]
急性皮层5-ht4r激活诱导快速抗焦虑样效应。
[0431]
由于5-ht4r在mpfc(a27)中表达，mpfc是涉及与中枢5-ht功能障碍相关的情绪障碍的病理生理学的大脑区域(a19,a28,a29)，我们检查了5-ht4r激活在mpfc中对快速抗焦虑样活动的贡献(图6b)。在epm中，如全身施用地西泮(1.5mg/kg)所观察到的那样，局部输注rs67333(1μg)可显著增加开放臂中花费的时间和时间百分比，而不影响自主移动(单向anova，*p《0.05，**p《0.01，相对于媒介物组，图6g和插图)，因为观察到在开放臂中的走动距离除以总距离的比率显著增加(单向anova，*p《0.05，相对于媒介物组，图6h)。在nsf中，rs67333和全身施用地西泮减少了摄食潜伏期，而不影响家养笼食物消耗量(kaplan-meier生存分析和单向anova，*p《0.05，**p《0.01，相对于媒介物组，图6i-6j和插图)，证实了mpfc中5-ht4r激活的抗焦虑样效应。
[0432]
来自中缝背核的血清素参与急性rs67333和地西泮施用的快速抗焦虑样效应。
[0433]
在此，我们开始测试rs67333的急性施用是否可引起血清素能活性的持续变化(图7a)。事实上，我们发现rs67333(1,5mg/kg)的急性全身施用使drn 5-ht神经元的放电频率增加了63％(student检验，**p《0.01，相对于rs6733之前，图2b-2c)。
[0434]
为了进一步证实mpfc 5-ht4r刺激的抗焦虑样效应取决于完整的5-ht系统，在rs67333(0.5μg/侧)或地西泮(1.5μg/侧)mpfc内输注之前，小鼠用p-cpa预处理3天(图7d)。p-cpa诱导媒介物小鼠的mpfc中5-ht含量平均降低86％(双向anova，#p《0.05，##p《0.01，相对于适当的媒介物组，图7e)。使用rs67333或地西泮进行的急性mpfc内输注增加了在epm的开放臂中花费的时间、时间百分比以及在开放臂中的走动距离/总距离的比率，在5-ht耗尽的p-cpa小鼠中消除(双向anova，**p《0.01，相对于媒介物/媒介物，或#p《0.05，##p《0.01，相对于媒介物/适当组，图7f-7g)。p-cpa诱导的5-ht消耗不影响自主活动(插图图7g)。这些
结果指出了5-ht神经传递在快速抗焦虑样效应中的关键作用。总之，rs67333(如前所述(a29))和地西泮通过对mpfc的调节作用于5-ht功能。
[0435]
5-ht4r激动剂的快速抗焦虑样效应募集内侧前额叶皮层-脑干神经回路。
[0436]
虽然情绪行为是由投射到drn的mpfc锥体神经元介导(a22)，但没有直接证据表明这些投射与抗焦虑样效应有关。因此，使用光遗传学策略，我们开始检查drn中的传入皮层谷氨酸能末端对急性地西泮或rs67333施用诱导的快速抗焦虑样效应的特定贡献。
[0437]
首先，为了将视蛋白表达选择性地靶向对drn的皮层谷氨酸能投射，我们采用了aav5-camkiiα-病毒，该病毒在drn中的mpfc锥体细胞末端中特异性表达chr2(图8a-8b)。将注射aav5-camkiiα-chr2-eyfp的小鼠与注射aav5-camkii-eyfp的对照进行比较。在epm中，注射camkii-chr2的balb/cjrj小鼠的drn中mpfc投射的照明诱导在开放臂中花费的时间、时间百分比或时间分布变化与光关闭相比以及与对照组相比显著增加(双向anova，**p《0.01或##《p0.01，分别相对于在光开启期间的camkiiα-chr2-eyfp或camkii-eyfp，图8c和插图)。这种效应不太可能是自主活动变化的结果，因为即使在光开启期间注射camkii-chr2的小鼠的总走动距离减少，在开放臂中的走动距离除以总距离的比率相比于光关闭有所增加(双向anova，**p《0.01或##《p0.01，分别相对于在光开启期间的camkiiα-chr2-eyfp或camkii-eyfp，图3d和插图)。为了进一步证实5-ht4r激动剂的快速抗焦虑样效应募集mpfc-脑干神经回路，我们评价了of范例中drn中mpfc末端的光遗传学刺激的行为后果(图13a-13c)。我们发现，在注射camkii-chr2的balb/cjrj小鼠中，drn中mpfc投射的照明诱导了与光关闭相比以及与对照组相比在中心花费的时间显著增加(双向anova，**p《0.01相对于光关闭期间，##p《0.01相对于光开启期间的eyfp，图13b和插图)。这种效应不太可能是自主活动变化的结果，因为与光关闭相比，总走动距离不受影响并且在中心的走动距离除以总距离的比率增加(双向anova，**p《0.01或##《p0.01，相对于在光开启期间的camkiiα-chr2-eyfp或camkii-eyfp，图13c和插图)。
[0438]
接下来，我们探讨了在皮层输注rs67333或地西泮后mpfc投射到drn的光遗传学抑制的影响(图9a)。在mpfc中注射aav5-camkii-archt的小鼠显示出archt-gfp在mpfc中以及drn中皮层谷氨酸能末端中的稳固表达(图9b)。在epm中，注射到camkii-archt小鼠的mpfc中的rs67333(0.5μg/侧)和地西泮(1.5μg/侧)显著增加了在光关闭期间在开放臂中花费的时间、时间百分比或时间分布变化并且在3分钟的绿光照射期间逆转(rs67333和地西泮分别抑制70
±
8％和85
±
5％，双向anova，**p《0.01或##《p0.01，分别相对于用于适当治疗的在光开启期间的camkiiα-archt或camkii-gfp，图9c和插图)。类似地，与对照相比，急性rs67333和地西泮施用增加了在光关闭期间在开放臂中的走动距离除以总距离的比率，并在光开启期间被阻断，证实了两种药物的抗焦虑效应(双向anova，**p《0.01，分别相对于用于适当治疗的在光关闭期间的camkiiα-archt或#《p0.05camkii-gfp，图9d)。在光关闭或光开启期间没有观察到走动距离的变化(图9d和插图)。这些结果也在of中得到证实(图14a-14c)。实际上，在camkii-archt小鼠的mpfc中输注rs67333(0.5μg/侧)和地西泮(1.5μg/侧)诱导抗焦虑效应，其被drn中mpfc末端的光遗传学抑制所阻断。具体而言，在camkii-archt小鼠的mpfc中注射rs67333和地西泮显著增加了在光关闭期间在中心花费的时间，并且这种效应在3分钟绿光照明期间逆转(对于rs67333和地西泮分别为85
±
20％和80
±
22％的抑制作用，双向anova，*p《0.05，**p《0.01或#p《0.05，##《p0.01，相对于在光开启期间的
camkiiα-archt或camkii-gfp，图14b-14c和插图)。这些数据支持rs67333和地西泮均募集mpfc-drn神经回路以诱导抗焦虑样效应。
[0439]
然后，我们继续研究靶向drn回路的mpfc末端是否足以产生由急性全身地西泮或rs67333治疗引起的快速抗焦虑样效应(图9a-9b)。在epm范例中，如先前所示，在camkii-archt-mpfc注射的小鼠中，rs67333(1.5mg/kg)或地西泮(1.5mg/kg)的急性全身施用增加了在开放臂中花费的时间、时间百分比和在开放臂中的走动距离除以总距离的比率，引起抗焦虑样效应，而不影响在关闭回合期间的自主活动(双向anova，**p《0.01，相对于在光关闭期间的媒介物组，图9e-9f和插图)。在drn中皮层谷氨酸能末端的3分钟绿光照明期间，即使急性rs67333或地西泮诱导了抗焦虑样效应，但与光关闭相比，效应的大小减弱(双向anova，
§§
p《0.01，相对于在光开启期间的媒介物组，#p《0.05相对于在光关闭期间的适当组，图9e-9f和插图)。实际上，在epm中观察到在开放臂中花费的时间显著减少24％(对于rs67333)和17％减少(p《0.09)(对于地西泮)。在急性全身rs67333或地西泮施用后，在光开启之间在开放臂中花费的时间分布和在开放臂中的走动距离除以总距离的比率降低，证实drn中mpfc锥体细胞末端的抑制显著降低了这两种化合物的抗焦虑效应(双向anova，#p《0.05，##p《0.01，相对于光关闭期间的适当组，图9e-9f和插图)。总体而言，这些数据表明drn中的mpfc末端被募集用于rs67333和地西泮的快速抗焦虑效应。
[0440]
评价5-ht4受体激动剂在balb/cjrj小鼠中的长期活性
[0441]
在证明rs 67333具有预防特性后，我们随后寻求长期了解该分子，即找出rs 67333带来的抗焦虑反应是否随着时间的推移是可持续的。为了实现这一目标，在进行飞溅试验前45分钟，向balb/cjrj小鼠全身注射单剂量的rs 67333(1.5mg/kg)或地西泮(1.5mg/kg)。第二天，小鼠在没有接受另一剂rs的情况下进行epm，然后在24小时后在旷场，最后在旷场24小时后进行nsf(图15a)。
[0442]
正如预期的那样，rs 67333在飞溅试验中增加了梳理时间(t＝2.294；p《0.05)，而不影响单次施用后的发作次数(t＝1.546；p＝0.1531)(图15b-15c)。我们尚未确定注射后24小时在epm中rs 67333的预期抗焦虑效应(t＝0.4990；p＝0.6286)(图15d-15e)。然而，在注射后48小时，rs 67333增加了在of中心花费的时间(t＝1.924；p《0.05)，而不影响中心距离与总步行距离的比率(t＝1.281；p＝2292)(图15f-15g)，并且在注射后72小时，减少了nsf中的进食滞后(t＝2.520；p《0.05)，而不影响熟悉环境中的食物消耗量(t＝0.2203；p＝0.4151)(图15h-15i)。由于地西泮不表现出任何抗抑郁活性，因此在飞溅试验中没有发现任何影响是正常的。同样，我们也未能观察到地西泮的任何长期活性。
[0443]
因此，尽管应该重复这项研究，但rs可能会在注射后长达72小时内产生持续效应。
[0444]
讨论
[0445]
急性5-ht4r激活和快速抗焦虑样效应。
[0446]
我们的研究在balb/cjrj(一种具有高焦虑水平的小鼠品系)中提供了证据，表明5-ht4r刺激在三种不同的焦虑范例(即epm、nsf和of)中诱导了类似于地西泮的快速抗焦虑样效应。有趣的是，与rs67333不同，氟西汀的急性全身施用不会影响焦虑样行为，这证实了之前的观察结果(a30)。这些数据还表明，快速的抗焦虑样活性需要选择性激活一些关键的突触后受体如5-ht4r或5-ht
1a
r(a31)，而不是5-ht神经传递的整体增加。
[0447]
mpfc-drn回路参与5-ht4r激活介导的快速抗焦虑样活性。
[0448]
在人类和啮齿动物中，5-ht4r主要位于与精神障碍如焦虑症有关的边缘区域(a27,a32)。我们探讨了mpfc中表达的5-ht4r激活在快速抗焦虑样效应中的作用。事实上，5-ht4r在广泛性焦虑症患者的mpfc的兴奋性锥体神经元中表达，该区域显示谷氨酸失调(a33,a34)。有趣的是，通过在mpfc中急性输注这种5-ht4r激动剂，可重现rs67333急性全身施用后观察到的快速抗焦虑样效应。实际上，在双侧输注rs67333(类似于地西泮)后，在epm中在开发臂中花费的时间增加，并且在nsf中观察到摄食潜伏期减少。我们的结果与之前的结果一致，表明mpfc中的5-ht4r过表达产生了稳固的抗焦虑样行为表型(a7,a19)。
[0449]
解剖学研究表明，前缘/扣带回皮层也大量投射到drn 5-ht神经元(a35)。这种连接性作为参与调节应激和抑郁行为的潜在回路引起了极大的兴趣(a22)。例如，在啮齿动物中，应激源暴露于不可避免的电击会增加drn中部和尾部区域5-ht神经元中的cfos表达，表明在致焦虑情形下该结构的神经激活增加(a36)。还有证据表明，mpfc中的5-ht4r激活通过下行输入控制中脑血清素能神经元的放电率(a19,a29,a37)。观察到5-ht4r-null小鼠的drn中5-ht神经元自发活动的减少和5-ht含量的降低(a38)。相反，在不同时间点在大鼠中施用rs67333，驱动对drn 5-ht神经元活动的影响(a19,a29,a39)，并增加投射部位的5-ht释放(a40)。我们表明，rs67333的急性全身注射提高了小鼠中drn 5-ht神经元的放电率，这表明5-ht4r激动剂的快速抗焦虑样活性取决于该神经元群体的激活，尽管drn确实不表达5-ht4r(a27)。事实上，5-ht4r激动剂的快速起效可能是包括mpfc在内的投射区域的血清素能输出增加的结果(a19,a41)。这些结果得到以下事实的支持：通过全身p-cpa预处理，全脑5-ht含量的消耗阻止了rs67333诱导的抗焦虑样表型，而单独的p-cpa不会影响先前报道的行为(a42)。有趣的是，尽管药理学靶标不同，但5-ht4r激动剂和bzd具有共同的抗焦虑样活性，具有相似的效率，表明这两种药物激活了5-ht神经传递和可能的共同神经回路募集。在我们的实验条件下，mpfc内输注地西泮的抗焦虑样活性被p-cpa预处理阻断，表明5-ht系统参与该活动。
[0450]
知道drn中产生5-ht的神经元优先受来自mpfc的单突触谷氨酸能输入调节(a35)，我们使用camkii启动子来靶向谷氨酸能锥体神经元并评价这种参与快速抗焦虑样效应的神经元脑回路。投射到balb/cjrj小鼠drn的mpfc神经元的chr2表达末端的照明诱导了抗焦虑样效应，测量为在开放臂中花费的时间增加，这种效应类似于mpfc内rs67333和地西泮。这个结果强调了mpfc-脑干drn神经回路在快速抗焦虑样效应中的作用。多项研究表明mpfc-drn回路参与调节对厌恶挑战的行为反应。例如，慢性社交失败(sd)小鼠腹内侧pfc中的深脑刺激(dbs)恢复了社交互动(a43)。同时，原生小鼠的1小时dbs和慢性sd小鼠的慢性dbs分别增加了drn中的cfos免疫反应性并逆转了sd诱导的drn 5-ht神经元的低兴奋性(a43)。在sd小鼠中，mpfc锥体细胞的慢性光活化增加了epm中在开放臂中花费的时间(a23)，而刺激对非应激动物的焦虑相关行为没有影响(a23,a44)。相反，drn中的光沉默mpfc末端阻止了sd小鼠社交互动的减少，这表明在焦虑样行为中起作用(a24)。
[0451]
为了确保对局部5-ht4r激动剂输注的行为反应符合谷氨酸能mpfc锥体神经元是5-ht4r激动剂驱动的对drn 5-ht神经元活动影响的介体的观点，我们使drn中的传入皮层谷氨酸能末端光遗传学沉默。抑制这些投射逆转了mpfc内rs67333和地西泮施用诱导的抗焦虑样行为，证实皮层-中缝回路募集对于快速抗焦虑样活性至关重要(a7)。有趣的是，与我们的结果一致，最近的一项研究表明，挽救5-ht4r ko小鼠中的mpfc-5-ht4r表达部分降低
了应激水平(a28)。尽管这些结果对于5-ht4r激动剂并不令人惊讶，但对于地西泮却出乎意料。然而，已提出通过mpfc内蝇蕈醇输注(gabaa受体的直接激动剂)激活皮层gabaa受体可减弱成年wistar大鼠的焦虑相关行为(a45)。这些发现表明，尽管药理学靶标不同，但5-ht4r激动剂和bzd具有共同的机制，通过前额叶皮层-drn脑干神经回路募集诱导快速抗焦虑样效应。应该研究这些谷氨酸能投射是否也可能通过对局部中间神经元的影响来调节drn活动。使用病毒顺行追踪的解剖学研究揭示，drn中的5-ht神经元和gaba中间神经元从mpfc的前缘部分接收兴奋性输入，与gaba能神经元(a35)相比，drn 5-ht神经元的输入比例更大，这表明gaba中间神经元的影响可能是次要的(a37)。
[0452]
为了评价mpfc-drn回路募集在与5-ht4r激活相关的快速抗焦虑样活性中是否不仅必要而且足够，我们研究了地西泮和rs67333的急性全身施用后drn中mpfc末端的光遗传学抑制的后果。抑制drn中的皮层谷氨酸能末端会减弱但不会阻止由rs67333或地西泮急性全身施用引起的抗焦虑效应，这表明其他脑结构也可能参与bzd和5-ht4r激动剂的快速抗焦虑样活性。这些结果并不令人惊讶，因为其他回路也涉及焦虑相关的行为，例如腹侧海马体到前额叶皮层(46)、前额叶皮层到基底外侧杏仁核(a47)、基底外侧杏仁核到腹侧海马体(a48)或drn到纹终床核(31)输入(图10)。例如，将rs67333施用于基底外侧杏仁核、海马体或大细胞基底核也调节情绪记忆的形成和巩固(a49-a51)，表明5-ht4r激动剂的抗焦虑样效应可能取决于这些不同的边缘区域。
[0453]
有趣的是，我们发现使drn中的皮层谷氨酸能末端沉默也会减弱地西泮的抗焦虑样活性。许多其他结构表达gabaa受体和5-ht4r，但mpfc-drn回路对于地西泮和rs67333介导的快速抗焦虑样活性似乎是必要的但不足够。未来的研究应该检查也涉及焦虑表型的大脑结构如何与mpfc-drn回路相互作用以实现快速抗焦虑样活性，以及mpfc中的5-ht4r表达是否负责地西泮的快速抗焦虑样效应，因为已经显示了地西泮受到5-ht4r拮抗剂的剂量依赖性抑制(a16)。
[0454]
总之，我们的研究揭示了mpfc-drn回路在介导5-ht4r激动剂和bzd的快速抗焦虑样效应中的重要性。刺激mpfc中的5-ht4r或更普遍地刺激mpfc-脑干drn神经回路可促进抗焦虑效应，并且可能代表一种治疗焦虑症的创新且快速起效的治疗方法。然而，使用5-ht4r激动剂作为速效抗焦虑药可能会受到5-ht4r在中枢神经系统外部在心脏、胃肠道、肾上腺和膀胱中表达的阻碍(a52)。可能值得确定mpfc-drn回路的其他更具体且适合药物开发的组分。
[0455]
表3.总体统计结果
[0456]
[0457]
[0458]
[0459][0460]
表4.总体统计结果
[0461]
[0462][0463]
表5.总体统计结果
[0464]
[0465][0466]
表6.总体统计结果
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[0536]
本发明的范围不受本文描述的具体实施方案的限制。实际上，根据前面的描述和附图，除了本文描述的那些之外，对本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
[0537]
本技术通篇引用了专利、专利申请和出版物，其公开内容，特别是包括所有公开的化学结构，通过引用并入本文。引用上述出版物或文件并不意味着承认上述任何一者是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。本文引用的所有参考文献均通过引用并入，其程度就好像每个单独的出版物、专利申请或专利被具体地和单独地指示为通过引用并入一样。
[0538]
前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践本发明。除了本文中示出和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将根据前述描述变得显而易见并且落入所附权利要求的范围内。