新型膜过滤系统的制作方法

1.本实用新型涉及过滤装置，更具体地涉及一种新型膜过滤系统。


背景技术：

2.经过几十年发展，哺乳动物细胞培养已日渐成熟，成为生产大分子蛋白药物(特别是需要糖基化修饰的复杂蛋白)的主流技术。这些蛋白药物主要用于预防和治疗一些严重的人类疾病，例如癌症，遗传缺陷和其它免疫相关疾病。细胞培养模型主要有批次培养，补料批次流加培养和灌流培养(连续培养)三种，其中灌流培养因其蛋白收获的可连续性以及产物蛋白的稳定性和一致性受到更广泛的应用，其特点是可通过细胞截留装置及时置换出细胞产生的代谢废物和目标蛋白，并实时补入细胞培养所需的新鲜培养基以实现高密度连续培养和高产量收获，其中0.2μm的中空纤维柱是在灌流培养中被广泛应用的细胞截留装置。
3.微孔径的细胞截留装置的优点有二：一是使用的是交变切向流的细胞截留方式，能防止死端过滤引起的滤膜快速堵塞；二是0.2μm的微孔径能有效截留细胞和培养液中大颗粒的细胞碎片和杂质，无需深层过滤即可满足蛋白a亲和层析柱的上样标准，实现目的蛋白的连续表达和收获，减少传统细胞收获液深层过滤的工艺成本。
4.尽管如此，中空纤维柱也存在缺点，虽然交变切向流有助于污染物的去除，但随着培养时间延长，罐内污染物浓度上升，中空纤维柱膜一侧的浓差极化会导致透过端的流速降低，乃至堵塞，膜的堵塞会造成反应器内目标蛋白的截留，而蛋白长期滞留罐内也将存在一定程度的不稳定性。为有效收获连续培养过程中的目的蛋白，只有更换新的中空纤维柱，换柱操作对大规模生产意味着挑战，从成本角度考虑，中空纤维柱的更换除了会带来耗材和设备的物料成本的需求外，中空纤维柱的准备过程耗时且繁杂，对人力成本也有较大需求；最挑战的是，换柱操作存在较大的染菌风险和新中空纤维柱存在泄露的风险，一旦上述情况产生，带来的将是对项目乃至厂房更大程度的影响。虽然目前有文献报道，使用0.5μm或5μm的大孔径中空纤维柱可降低堵塞的情况，但实际研究中发现面对罐内高污染物浓度的情况，0.5μm中空纤维柱并不能缓解堵塞，而5μm的中空纤维柱虽可减缓堵柱，但收获液中大量污染物和杂质的也将为后续纯化工艺的去除带来挑战。
5.本领域仍需要寻找一种适用于不同规模和不同孔径的新型膜过滤系统，其可取代换柱操作，在堵塞到设定标准时进行清洗，以改善在长时间运行下的堵塞情况，提高目的蛋白的收获效率，规避由换柱操作产生的细胞泄露和染菌的风险，并节省相关的人力成本和物料成本。


技术实现要素：

6.本实用新型的目的是提供一种膜过滤系统，其可取代换柱操作，在堵塞到设定标准时进行清洗，提高目的蛋白的收获效率，规避由换柱操作产生的细胞泄露和染菌的风险，并节省相关的人力成本和物料成本。
7.因此，本实用新型涉及一种膜过滤系统，所述系统包括：
8.进料装置；
9.膜过滤装置，其出口包括第一出口和第二出口；
10.反应装置；
11.反冲装置；
12.洗涤装置，其出口包括第三出口和第四出口；
13.回收装置；和
14.收集装置，
15.其中所述反应装置的进口与所述进料装置的出口流体连通，所述反应装置的出口与所述膜过滤装置的进口流体连通，所述反冲装置的进口与所述进料装置的出口和所述第三出口流体连通，所述反冲装置的出口与所述第一出口流体连通，所述第四出口与所述膜过滤装置的进口流体连通，所述回收装置的进口与所述膜过滤装置的进口流体连通，并且所述第二出口与所述收集装置流体连通。
附图说明
16.下面结合附图更详细地说明本实用新型，附图中：
17.图1是根据本实用新型的一个实施方式的膜过滤系统的示意图；
18.图2是对照膜过滤系统的示意图；
19.图3是图1所示的膜过滤系统的预处理操作的示意图；
20.图4是图1所示的膜过滤系统的naoh处理中e-flow的工作模式时液体流动状态的示意图；
21.图5是图1所示的膜过滤系统的naoh处理中p-flow的工作模式时液体流动状态的示意图；
22.图6是图1所示的膜过滤系统的无菌水处理中e-flow的工作模式时液体流动状态的示意图；
23.图7是图1所示的膜过滤系统的无菌水处理中p-flow的工作模式时液体流动状态的示意图；
24.图8是图1所示的膜过滤系统的培养基润洗中液体流动状态的示意图；
25.图9是活细胞密度随时间变化曲线图；
26.图10是细胞活率随时间变化曲线图；
27.图11是葡萄糖浓度随时间变化曲线图；
28.图12是铵离子浓度随时间变化曲线图；
29.图13是渗透压随时间变化曲线图；
30.图14是蛋白总生产量随时间变化曲线图；
31.图15是蛋白总收获量随时间变化曲线图；
32.图16是蛋白截留率随时间变化曲线图。
具体实施方式
33.本实用新型涉及一种膜过滤系统，包括进料装置。进料装置可以是本领域已知的
任何合适的进料装置。在本实用新型的一个实施方式中，来自进料装置的液体包括培养基。
34.本实用新型的膜过滤系统包括膜过滤装置，其出口包括第一出口和第二出口。膜过滤装置可以是本领域已知的任何合适的膜过滤装置。在本实用新型的一个实施方式中，膜过滤装置包括中空纤维柱或中空纤维膜。在本实用新型的一个实施方式中，膜过滤装置是中空纤维柱。在本实用新型的一个实施方式中，膜过滤装置的孔径为0.05μm至10μm，优选0.1μm至1μm，更优选约0.2μm。在本实用新型的一个实施方式中，第一出口用于清洗液或培养基进料并且第二出口用于排出滤液。在本实用新型的一个实施方式中，膜过滤装置还包括流动控制器。流动控制器可以是本领域已知用于控制膜过滤装置内液体的流动方向的任何合适的流动控制器。在本实用新型的一个实施方式中，流动控制器包括交变切向流(atf)控制器和/或切向流(tff)控制器。在本实用新型的一个实施方式中，流动控制器是交变切向流(atf)控制器。在本实用新型的一个实施方式中，流动控制器包括控制部分和滤器部分，其中滤器部分可包括用于直接控制膜过滤装置内液体的流动方向的结构，例如，瓣膜。
35.本实用新型的膜过滤系统包括反应装置。反应装置可以是本领域已知用于灌流培养的任何合适的反应装置。在本实用新型的一个实施方式中，反应装置是细胞灌流培养罐。在本实用新型的一个实施方式中，来自反应装置的液体包括细胞发酵液。
36.本实用新型的膜过滤系统包括反冲装置。反冲装置可以是本领域已知用于反向冲洗膜过滤装置的任何合适的反冲装置。在本实用新型的一个实施方式中，反冲装置包括泵。泵可以是本领域已知用于泵送液体的任何合适的泵。在本实用新型的一个实施方式中，泵是蠕动泵。
37.本实用新型的膜过滤系统包括洗涤装置，其出口包括第三出口和第四出口。在本实用新型的一个实施方式中，洗涤装置包括洗涤液容器。在本实用新型的一个实施方式中，洗涤液容器包括来自所述洗涤装置的洗涤液。在本实用新型的一个实施方式中，来自所述洗涤装置的洗涤液包括碱液和水。在本实用新型的一个实施方式中，洗涤装置包括装有碱液的洗涤液容器和装有水的洗涤液容器。在本实用新型的一个实施方式中，碱液包括选自以下的溶液：氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾，优选氢氧化钠。在本实用新型的一个实施方式中，碱液浓度为0.05m至5m，优选0.1m至1m，更优选约0.5m。在本实用新型的一个实施方式中，洗涤液容器优选包括温控装置。在本实用新型的一个实施方式中，装有碱液的洗涤液容器包括温控装置。在本实用新型的一个实施方式中，碱液的温度为30-60℃，优选45-50℃。在本实用新型的一个实施方式中，洗涤装置还包括润洗容器，其进口与洗涤液容器的出口流体连通。在本实用新型的一个实施方式中，第四出口可以是润洗容器的出口。在本实用新型的一个实施方式中，第三出口可以是洗涤液容器的出口。在本实用新型的一个实施方式中，润洗容器的容器内进口管口高度高于出口管口高度，以避免液体从膜过滤装置倒流回洗涤液容器。在本实用新型的一个实施方式中，润洗容器包括温控装置。温控装置可以是本领域已知用于控制容器中液体温度的任何合适的装置。在本实用新型的一个实施方式中，温控装置包括加热毯。
38.本实用新型的膜过滤系统包括回收装置。回收装置可以是本领域已知用于回收来自膜过滤器的废液的任何合适的装置。在本实用新型的一个实施方式中，回收装置包括废液容器，其进口与膜过滤装置的进口流体连通。在本实用新型的一个实施方式中，废液容器的容器内进口管口高度高于出口管口高度，以避免液体倒流回膜过滤装置。
39.本实用新型的膜过滤系统包括收集装置。收集装置可以是本领域已知用于收集来自膜过滤器的滤液的任何合适的装置。
40.在本实用新型的膜过滤系统中，所述反应装置的进口与进料装置的出口流体连通，反应装置出口与膜过滤装置的进口流体连通，反冲装置的进口与进料装置的出口和第三出口流体连通，反冲装置的出口与第一出口流体连通，第四出口与膜过滤装置的进口流体连通，回收装置的进口与膜过滤装置的进口流体连通，并且第二出口与收集装置流体连通。在本实用新型的一个实施方式中，流体连通包括管路连接。在本实用新型的一个实施方式中，反应装置的进口和膜过滤装置的进口之间包括分叉接口，该分叉接口分别与反应装置的进口、膜过滤装置的进口、以及第四出口和/或回收装置的进口流体连通。在本实用新型的一个实施方式中，第四出口和回收装置的进口之间包括分叉接口，该分叉接口分别与第四出口、回收装置的进口、以及另一分叉接口或膜过滤装置的进口流体连通。在本实用新型的一个实施方式中，洗涤装置包括润洗容器和两个洗涤液容器，其分别装有碱液和水，并且两个洗涤液容器的出口之间包括分叉接口，其分别与两个洗涤液容器的出口和润洗容器的进口流体连通。在本实用新型的一个实施方式中，洗涤装置包括第三出口和第四出口，其分别是洗涤液容器的出口和润洗容器的出口，并且润洗容器的进口和第三出口之间包括分叉接口，其分别与第三出口、润洗容器的进口和反冲装置的进口流体连通。在本实用新型的一个实施方式中，反冲装置的进口和进料装置的出口之间包括分叉接口，该分叉接口分别与反冲装置的进口、进料装置的出口、以及第三出口流体连通。
41.本实用新型的膜过滤系统还包括各装置的进口和/或出口处的截止装置。截止装置可以是本领域已知用于控制流路开关的任何合适的截止装置。在本实用新型的一个实施方式中，截止装置包括夹或单向阀。在本实用新型的一个实施方式中，回收装置的出口处包括单向阀，以防止液体流出回收装置。在本实用新型的一个实施方式中，洗涤装置的出口处包括单向阀，以防止液体流入洗涤装置。
42.下面将结合附图对本技术的技术方案进行清楚、完整的表述，显然，所描述的实施例是本技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例都属于本技术保护的范围。
43.实施例
44.实验设备：
45.[0046][0047]
试验试剂：
[0048]
naoh：厂家：advantor，货号：5000-02
[0049]
无菌水：
[0050]
基础培养基：actipro
tm
，购自hyclone公司，货号sh31037。
[0051]
细胞：cho-k1(购自atcc(atcc ccl-61))
[0052]
待测蛋白：西妥昔单抗(cetuximab，商品名为爱必妥)。
[0053]
实施例1
[0054]
膜过滤系统的构建
[0055]
构建如图1所示的本实用新型的膜过滤系统，其包括进料装置，膜过滤装置(中空纤维柱)，反应装置(发酵罐)，包括泵的反冲装置，包括naoh瓶、无菌水瓶和润洗瓶的洗涤装置，包括废液瓶的回收装置，和收集装置，其中发酵罐的进口与进料装置的出口通过管路连接，发酵罐的出口与中空纤维柱的进口通过管路连接，泵的一端与进料装置的出口以及naoh瓶和无菌水瓶的出口通过管路连接，泵的另一端与中空纤维柱的第一出口通过管路连接，中空纤维柱的第二出口与收集装置通过管路连接，润洗瓶的出口与中空纤维柱的进口通过管路连接，废液瓶的进口与中空纤维柱的进口通过管路连接，中空纤维柱的底部装有atf控制器，naoh瓶和润洗瓶上包覆加热毯，润洗瓶的出口和废液瓶的进口处安装单向阀，并且其余管路上安装夹。a部分管路包括连接发酵罐的管路，b部分管路包括连接洗涤工作站和回收站的管路。
[0056]
构建如图2所示的对照膜过滤系统，其包括进料装置(未显示)，膜过滤装置(中空纤维柱)，反应装置(发酵罐)，和泵，其中发酵罐的进口与进料装置(未显示)的出口通过管路连接，发酵罐的出口与中空纤维柱的进口通过管路连接，泵的一端与中空纤维柱的第二出口通过管路连接，泵的另一端与收集装置通过管路连接，并且各管路上安装夹。
[0057]
实施例2
[0058]
膜过滤系统的运行
[0059]
(1)如实施例1所示的本实用新型的膜过滤系统的运行过程主要包括灌流培养模式、在线清洗模式切换、naoh处理、无菌水处理和培养基润洗：
[0060]
1在线清洗模式切换：
[0061]
1.1关闭b部分的管路和中空纤维柱的第二出口处的夹，从灌流培养模式切换为在线清洗模式。
[0062]
1.2预处理，包括用50ml注射器向atf控制器的滤器部分内注入气体，以确保瓣膜呈向上鼓起的状态，如图3所示。
[0063]
1.3关闭a部分的管路。
[0064]
1.4打开b部分管路，将中空纤维柱从培养模式切换为在线清洗模式。
[0065]
2naoh处理：
[0066]
2.1步骤1前，洗涤工作站内已预充入一定量的0.5m naoh，并将洗涤工作站和反冲工作站接入加热系统，通过加热毯对两个工作站内的液体进行加热，温度控制为50℃。
[0067]
2.2开启atf控制器，并同时通过泵以35ml/分钟的流速将加热的naoh溶液由反冲工作站通过中空纤维柱的第一出口注入中空纤维柱外腔。
[0068]
2.3当atf控制器处于e-flow的工作模式时，在中空纤维柱内形成负压，洗涤工作站内的加热的naoh溶液通过中空纤维柱的进口进入到中空纤维柱中，在这个过程中，反冲工作站将持续以35ml/分钟的流速将加热的naoh溶液由反冲工作站通过中空纤维柱的第一出口注入中空纤维柱外腔，此时膜过滤系统中液体流动状态如图4所示。
[0069]
2.4当atf控制器处于p-flow的工作模式时，将中空纤维柱内的液体经中空纤维柱的进口排出并流入回收站中，在这个过程中，反冲工作站将持续以35ml/分钟的流速将加热的naoh溶液由反冲工作站通过中空纤维柱的第一出口注入中空纤维柱外腔，此时膜过滤系统中液体流动状态如图5所示。
[0070]
2.5整个naoh处理的过程持续25分钟，完成后，在保证洗涤工作站内无碱液残留的前提下，进入下一步骤。
[0071]
3无菌水处理：
[0072]
3.1关闭连接反冲工作站和洗涤工作站的加热系统。
[0073]
3.2向反冲工作站和内循环工作站内注入无菌水。
[0074]
3.3开启atf控制器，并同时通过泵以35ml/分钟的流速将无菌水由反冲工作站通过中空纤维柱的第一出口注入中空纤维柱外腔。
[0075]
3.4当atf控制器处于e-flow的工作模式时，在中空纤维柱内形成负压，洗涤工作站内的无菌水通过中空纤维柱的进口进入到中空纤维柱中，在这个过程中，反冲工作站将持续以35ml/分钟的流速将无菌水由反冲工作站通过中空纤维柱的第一出口注入中空纤维柱外腔，此时膜过滤系统中液体流动状态如图6所示。
[0076]
3.5当atf控制器处于p-flow的工作模式时，将中空纤维柱内的液体经中空纤维柱的进口排出并流入回收站中，在这个过程中，反冲工作站将持续以35ml/分钟的流速将无菌水由反冲工作站通过中空纤维柱的第一出口注入中空纤维柱外腔，此时膜过滤系统中液体流动状态如图7所示。
[0077]
3.6整个无菌水处理的过程持续30分钟，完成后，进入下一步骤。
[0078]
4培养基润洗：
[0079]
4.1提前将废液瓶内废液排空。
[0080]
4.2将反冲工作站的进液管路切换为培养基润洗管路，以35ml/分钟的流速将反冲
工作站内的基础培养基溶液经中空纤维柱的第一出口从中空纤维柱外腔注入，此时膜过滤系统中液体流动状态如图8所示。
[0081]
4.3待回收站内实时取样的液体ph与基础培养基ph一致后，停止润洗流程。
[0082]
4.4关闭b部分的管路和中空纤维柱的第一出口处的夹，打开a部分的管路和中空纤维柱的第二出口处的夹。将中空纤维柱切换为灌流培养模式。
[0083]
(2)如实施例1所示的对照膜过滤系统的运行过程主要包括灌流培养模式和换柱操作模式，其中在换柱操作模式中，关闭中空纤维柱的进口和两个出口处的夹，断开中空纤维柱的进口和两个出口处的管路连接，并分别连接另一根中空纤维柱的进口和两个出口，然后打开中空纤维柱的进口和两个出口处的夹，切换为灌流培养模式。
[0084]
实施例3
[0085]
(1)实验方案
[0086]
当中空纤维柱的截留率低于60％时，如实施例2所述，对实施例1所示的本实用新型的膜过滤系统运行在线清洗模式切换、naoh处理、无菌水处理和培养基润洗，并且对实施例1所示的对照膜过滤系统运行换柱操作模式，结束后继续运行灌流培养模式，分别对中空纤维柱的截留情况和反应器内细胞生长代谢表现进行比较和评估。
[0087]
(2)测定方法
[0088]
蛋白量测定：使用cedex高通量生化分析仪检测蛋白质浓度(g/l)
[0089][0090]
ph测定：使用ph计测定实时ph值
[0091]
活细胞密度：通过vi-cell计数仪测定
[0092]
细胞活率：通过vi-cell计数仪测定
[0093]
葡萄糖浓度：使用cedex高通量生化分析仪
[0094]
铵离子浓度：使用cedex高通量生化分析仪
[0095]
渗透压：使用cedex高通量生化分析仪
[0096]
蛋白总生产量：通过罐内蛋白浓度*灌流换液体积计算而得
[0097]
蛋白总收获量：通过收获液蛋白浓度*收获液体积计算而得
[0098]
(3)实验结果
[0099]
实验中，两个膜过滤系统的平行度较高，培养过程中均出现了两次蛋白截留率低于60％的情况。
[0100]
活细胞密度随时间的变化如图9所示，细胞活率随时间的变化如图10所示。由此可见，在两次进行在线清洗或换柱操作后，从细胞生长和活率数据来看，重新恢复培养后，在线清洗与换柱操作基本一致。
[0101]
葡萄糖浓度随时间的变化如图11所示，铵离子浓度随时间的变化如图12所示，渗透压随时间的变化如图13所示。从代谢数据来看，两个膜过滤系统的表现基本一致，均在灌流培养的正常波动范围内。
[0102]
蛋白总生产量随时间的变化如图14所示，蛋白总收获量随时间的变化如图15所示。从发酵罐内蛋白表达产量和中空纤维柱收获蛋白量来看，经过在线清洗和换柱操作的总蛋白产量和收获的总蛋白量基本一致。
[0103]
蛋白截留率随时间的变化如图16所示。从蛋白截留率数据来看，第一次清洗可大幅降低蛋白截留率30％以上，在培养两天后与更换新中空纤维柱的截留率相同；两个系统同时进行第二次在线清洗和换柱操作，在线清洗对蛋白截留仍有超过10％的降低。
[0104]
综上所述，经过实验对比，在线清洗操作具有可重复性，且对细胞生长，代谢和蛋白收获量没有影响，可至少替代一次换柱操作。
[0105]
与现有技术相比，本实用新型的膜过滤系统及其清洗方法具有以下优点：
[0106]
(1)实现了在线清洗中空纤维柱，克服了当前灌流工艺一旦中空纤维柱堵塞，需要更换的缺陷。相比传统换柱操作的物料成本和操作风险，本实用新型的膜过滤系统可实现与换柱一致的效果，规避了换柱过程中的风险；
[0107]
(2)使用反向冲刷的设计，即从中空纤维柱的一端由外向内地以较快的流速反向注入清洗液体，并伴随交变切向流的纵向冲刷，达到快速分离污染物和高效清洗中空纤维柱的效果，且该设计并不影响中空纤维柱任何已有功能的实现；
[0108]
(3)在线清洗中空纤维柱的系统中，提供一种新的流路设计，可实现清洗流路和废液流路的独立运行，避免了液路的混杂，保证了中空纤维柱在线清洗的可行性。
[0109]
最后要说明的是，以上所描述的仅为本实用新型的优选实施例，但本实用新型的保护范围不局限于此，对于熟悉本领域的技术人员，依然可以对本实用新型中的技术方案和构思修改或同等替换，凡是在本实用新型的精神原则内所作的修改、替换和改进等，都应包含在本实用新型的保护范围之内。