一种纳米传感器及其制备、应用和测试方法与流程

1.本发明涉及植物分析技术领域，尤其涉及一种纳米传感器及其制备、应用和测试方法。


背景技术：

2.过氧化氢(h2o2)作为活性氧之一在生命活动中有着广泛的影响。植物在逆境或衰老时，由于体内活性氧代谢增强而导致组织内h2o2积累。h2o2会氧化植物细胞的多种组分，如核酸、蛋白质、细胞膜等，导致它们的损伤，加剧细胞的衰老及解体。因而，发展操作简单、灵敏度高、选择性好及成本低廉的h2o2检测方法，对于及时监测植物的健康状况具有重要意义。
3.传统的植物组织h2o2检测方法主要使用硫酸钛或高锰酸钾滴定法，即将植物组织匀浆后所得的提取液与硫酸钛或碘化钾与硫酸钾混合液充分反应后，测定反应物的紫外吸收变化。虽然被广泛使用，但是这些传统检测方法具有如下缺点，限制了它们在植物分析检测中的应用：
4.第一，它们需要破坏植物组织，无法实现植物局部位置h2o2的原位检测；
5.第二，它们需要繁琐耗时的提取步骤，无法实现h2o2的快速检测；
6.第三，它们需要特殊的检测仪器，如分光光度计，使得难以实现现场检测；
7.第四，它们的灵敏度较低，无法实现较低浓度h2o2的灵敏检测。因而，迫切需要新的检测工具用于原位检测植物组织中过氧化氢浓度的含量。
8.金属有机框架(metal-organicframework，mof)是一种新兴的纳米材料，主要由金属离子和有机配体小分子通过自组装反应形成。mof材料具有诸多特点，如大表面积、高孔隙率、结构可调、便于修饰组装等，因而在光化学、催化、气体吸附、药物包埋、生物传感等领域受到极大的关注。值得注意的是，由于mof具有独特的多孔性，多种生物分子，如核酸、蛋白质、多糖、有机小分子等，可以很方便地被包裹在mof之中，形成纳米杂化体系。mof还可以提供类似于外骨骼的作用，保护被其包裹的生物分子。例如，liang等人证明了用zif-8包裹辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，hrp)后，hrp能够抵御高温、碱液、有机溶剂等不利环境，而且还可以在室温下储存较长时间，使其摆脱冷链储存的束缚，极大地拓展了hrp的使用范围(nat.commun.2015,6,7240)。


技术实现要素：

9.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种。
10.一种纳米传感器的制备方法，包括如下步骤：将辣根过氧化物酶水溶液、2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐水溶液、醋酸锌水溶液和2-甲基咪唑水溶液混合得到混合溶液，合成得到纳米复合物；然后进行除杂处理，冷冻干燥获得纳米传感器。
11.优选地，辣根过氧化物酶水溶液的浓度为50-200μg/ml，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐水溶液的浓度为1.5-3mg/ml，醋酸锌水溶液的浓度为4.03-24.2mg/
ml，2-甲基咪唑水溶液的浓度为0.9-10.8mg/ml。
12.优选地，辣根过氧化物酶、2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、醋酸锌和2-甲基咪唑在混合溶液中的浓度比为1：15：10-120：4.5-54。
13.优选地，合成温度为室温，合成时间为5-20min。
14.优选地，除杂处理的具体操作如下：离心4-8min，离心转速为7000-9000转/min，去除上清液后再用纯水再次分散，重复3-4次。
15.一种纳米传感器，采用上述纳米传感器的制备方法制得。
16.上述纳米传感器进行体外性能测试：将上述纳米传感器和过氧化氢加入反应缓冲液中孵育，然后采用808nm激光器照射溶液，测定溶液温度变化以确定纳米传感器的检测性能。
17.优选地，过氧化氢浓度为0-100μmol/l，分别是0μmol/l、1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l。
18.优选地，反应缓冲液为ph＝6.0的醋酸缓冲液，其浓度为10mmol/l。
19.优选地，孵育时间为1-5min。
20.优选地，激光器的照射能量为1-3w/cm，照射时间为0.5-1.5min。
21.优选地，采用红外线热成像仪或红外线测温仪测定温度。
22.上述纳米传感器在原位检测植物组织过氧化氢含量中的应用。
23.上述纳米传感器在原位检测植物组织过氧化氢含量中的应用方法，包括如下步骤：将上述纳米传感器注射入植物，再立即在该植物的相同部位注射不同浓度的过氧化氢，待反应结束后采用808nm激光器照射植物并测定温度，得到该植物的标准曲线；后续使用过程中直接将纳米传感器打入相同植物体内，待反应结束后采用808nm激光器照射植物并测定温度，将获取的温度信号与标准曲线对照获得植物内部过氧化氢实际浓度。
24.优选地，所述纳米传感器的注射量为10-30μl，所述纳米传感器的注射浓度为10-50μg/ml。
25.优选地，过氧化氢注射量为10-20μl，过氧化氢注射浓度为0-100μmol/l，分别是0μmol/l、1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l。
26.优选地，注射完成后反应1-5min。
27.优选地，激光器的照射能量为1-10w/cm，照射时间为0.5-1.5min。
28.优选地，采用红外线热成像仪或红外线测温仪测定温度。
29.本发明的的原理在于：在h2o2的存在下，辣根过氧化物酶(hrp)催化h2o2的分解，并将2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(abts)转变为它的氧化物形式。由于abts的氧化物在808nm处有紫外吸收峰，其可以在808nm光源的照射下，迅速产生热量，提高溶液温度。同时由于植物本身在808nm处，无明显吸收峰，在对808nm激光的照射不会导致其温度上升。
30.因而，利用微量注射器将纳米传感器注射到植物的特定部位后，如果植物组织内存在过氧化氢，将导致abts氧化物的产生，即可通过后续温度变化，间接反映出组织内h2o2的浓度，实现植物体内h2o2的原位检测。
31.本发明的优势：
32.(1)纳米传感器的制备反应条件温和、迅速且易于大规模制备；
33.(2)纳米传感器经过冷冻干燥后，可以储存在常温下，无需冷藏，并长时间保存活性；
34.(3)纳米传感器通过将hrp催化反应产物的颜色变化转化为温度信号，无需大型检测仪器，实现h2o2的现场检测，同时该传感器具有较高的灵敏度和极佳的选择性；
35.(4)纳米传感器能够通过微量注射器直接注射到植物的特定位置，准确报告植物组织中h2o2的含量。
附图说明
36.图1为实施例3所得纳米传感器的电镜透射图谱，其中插图为包含纳米传感器的水溶液。
37.图2为实施例3所得纳米传感器进行体外性能测试中温度变化的结果图，其中插图为热成像仪所记录的溶液最终温度。
38.图3为实施例3所得纳米传感器注射入烟草叶片后温度随时间变化图；其中-h2o2表示未注射过氧化氢，作为对照组； h2o2表示人为注射过氧化氢，作为试验组。
39.图4为采用热成像仪记录在激光器照射下烟草叶片的温度随过氧化氢浓度变化图。
具体实施方式
40.下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
41.实施例1
42.一种纳米传感器的制备方法，包括如下步骤：
43.将浓度为50μg/ml的辣根过氧化物酶水溶液、浓度为1.5mg/ml的2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐水溶液、浓度为4.03mg/ml的醋酸锌水溶液和浓度为0.9mg/ml的2-甲基咪唑水溶液混合得到混合溶液；
44.辣根过氧化物酶、2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、醋酸锌和2-甲基咪唑在混合溶液中的浓度比为1：15：120：54；
45.室温合成20min，得到纳米复合物；
46.然后将纳米复合物离心4min，离心转速为9000转/min，去除上清液后再用纯水再次分散，重复3次，冷冻干燥获得纳米传感器。
47.实施例2
48.一种纳米传感器的制备方法，包括如下步骤：
49.将浓度为100μg/ml的辣根过氧化物酶水溶液、浓度为2mg/ml的2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐水溶液、浓度为24.2mg/ml的醋酸锌水溶液和浓度为10.8mg/ml的2-甲基咪唑水溶液混合得到混合溶液；
50.辣根过氧化物酶、2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、醋酸锌和2-甲基咪唑在混合溶液中的浓度比为1：15：10：4.5；
51.室温合成10min，得到纳米复合物；
52.然后将纳米复合物离心8min，离心转速为7000转/min，去除上清液后再用纯水再次分散，重复4次，冷冻干燥获得纳米传感器。
53.实施例3
54.一种纳米传感器的制备方法，包括如下步骤：
55.将浓度为0.2mg/ml的辣根过氧化物酶水溶液、浓度为3mg/ml的2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐水溶液、浓度为8.07mg/ml的醋酸锌水溶液和浓度为3.61mg/ml的2-甲基咪唑水溶液混合得到混合溶液；
56.辣根过氧化物酶、2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、醋酸锌和2-甲基咪唑在混合溶液中的浓度比为1：15：40：18；
57.室温合成5min，得到纳米复合物；
58.然后将纳米复合物离心5min，离心转速为8000转/min，去除上清液后再用纯水再次分散，重复3次，冷冻干燥获得纳米传感器。
59.将本实施例所得纳米传感器进行电镜透射，其结果如图1所示。
60.试验例1
61.将实施例3所得纳米传感器进行体外性能测试：
62.将实施例3所得纳米传感器和不同浓度(0μmol/l、1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l)的过氧化氢加入浓度为10mmol/l的醋酸缓冲液(ph＝6.0)中孵育1min，然后采用808nm激光器照射溶液0.5min，激光器的照射能量为2w/cm，采用红外线热成像仪测定溶液温度变化以确定纳米传感器的检测性能。
63.其结果如下图2所示，随着过氧化氢的浓度升高，红外线热成像仪所测得温度先猛然升高(过氧化氢浓度为0-10μmol/l)，再维持缓慢升高(过氧化氢浓度为10-100μmol/l)，证实实施例3所得纳米传感器在过氧化氢浓度为0-10μmol/l时具有较高的灵敏度。
64.试验例2
65.将实施例3所得纳米传感器在原位检测烟草叶片组织过氧化氢含量中的应用方法，包括如下步骤：
66.将20μl浓度为10-50μg/ml的实施例3所得纳米传感器注射入烟草叶片，再立即在该烟草叶片的相同部位注射20μl不同浓度(0μmol/l、1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l)的过氧化氢，反应2min后，采用808nm激光器照射烟草叶片1min，激光器的照射能量为5w/cm，采用红外线热成像仪或红外线测温仪测定温度，得到烟草叶片的标准曲线。
67.其结果如图3和图4所示。
68.图3为在该烟草叶片的相同部位注射20μl浓度为100μmol/l的过氧化氢后，试验组和对比组反应40s内温度变化图，证实：烟草叶片本身在808nm处无明显吸收峰，在808nm激光的照射下不会导致其温度上升。
69.图4为在该烟草叶片的相同部位注射20μl不同浓度的过氧化氢后，烟草叶片的温度变化图。通过图3和图4对比证实：实施例3所得纳米传感器注射入烟草叶片，可以清晰观察烟草叶片组织内h2o2的浓度，实现烟草叶片体内h2o2的原位检测。
70.后续使用过程中直接将纳米传感器打入相同烟草叶片体内，反应2min后，采用808nm激光器照射烟草叶片1min，激光器的照射能量为5w/cm，采用红外线热成像仪或红外线测温仪测定温度，将获取的温度信号与标准曲线对照即可获得烟草叶片内部过氧化氢实际浓度。
71.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。