一种铁载体根际促生菌的应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种铁载体根际促生菌的应用。


背景技术：

2.香樟(cinnamomum camphora linn.)为樟科樟属常绿乔木，是亚热带常绿阔叶林的代表树种，又是世界著名的五大树种之一。香樟树形整齐美观，具有较高的观赏价值，且具有抗风、耐烟尘、吸收各种有毒气体等功能，是我国重要的经济树种和园林绿化树种。在我国江苏及以南各省多有栽培。香樟属于缺铁敏感性植物，其缺铁性黄化病在栽培地区广有报道。
3.缺铁性黄化病是由于植物体内fe元素含量相对过低而导致的叶片黄化、植物生长势衰弱、甚至危害植物生存的一种生理性病害。国内外学者对植物缺铁性黄化病致病原因及相关机理进行了大量而深入的探讨。研究认为导致植物缺铁主要有两方面的原因：一是植物功能性吸收障碍，表现为环境中有铁而不能被吸收；二是土壤中植物有效铁(fe
2
)含量过低，表现为没有足够的铁被植物吸收与利用。铁在土壤中大量存在，居矿质元素第四位，但是多以植物无效态形式存在。ph值是影响土壤中植物铁有效性的主要因素之一，研究显示土壤ph值每升高1,有效铁含量降低两个数量级，碱性土壤环境条件下，由于其ph值过高(》7.0)，导致土壤中的铁多为植物不可利用的fe
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。据调查，世界范围内40％面积土地呈碱性，我国江苏、四川、河南、安徽、甘肃等省分布着大面积的碱性土壤，在这些地区，植物缺铁性黄化病也多被报道，尤其对缺铁敏感的植物，例如香樟、桉树、梨树、葡萄、柑橘等植物，缺铁导致叶片黄化，经济产量降低。
4.针对碱性土壤导致的缺铁性黄化病的致病原因，大量专家进行了相应防治措施的研究与实践，而研究显示这些方法与途径虽然能缓解植物缺铁，但都存在自身的弊端。施用铁肥是最直接简易的矫治措施，目前常见的铁肥种类有无机铁肥、螯合铁肥、有机铁肥、缓释铁肥，常用施用方式主要是以下几种：叶面喷施、土壤施用、树干注射。叶面喷施铁肥是一种矫治植物缺铁黄化的常用方法，对于一些价格比较昂贵的铁肥来说叶面喷施的方法可以节约成本，但同时也存在一些缺点，如铁肥不易附着于叶面、持效期短、常需要多次喷施、局部有效等。土壤施用铁肥是通过对缺铁土壤施用铁肥来改善植物缺铁黄化，一般施用无机铁肥即硫酸亚铁，但在碱性土壤上施用的无机铁肥由于氢化作用最终会转化为氢氧化铁，因此无机铁肥在碱性土壤中的效果很差，不仅用量大且持效短。树干注射是将铁肥直接注入香樟树干内，避免了铁的氧化及有效性短等问题，但树干注射也存在一些技术问题，如钻孔力度、钻孔深度把握不当等会影响液体流速，输液浓度控制不当将会导致香樟产生病害或死亡，同时该方式需要耗费一定的人力和物力，增加生产成本。
5.土壤施用有机肥不仅能增加土壤有机质含量，还能在一定程度上增加土壤有效铁含量，促进土壤养分的释放及有效性产生，有机肥肥效平稳且持久性强，但见效慢，是一个长期改良土壤的方法。
6.土壤局部酸化就是通过向土壤中施酸化剂来降低土壤ph值，从而增加土壤中有效
铁含量改善香樟黄化病，但使用酸化剂改良所需时间较长，且以传统的灌溉方式全田施用酸化剂会产生很大的成本，同时长期使用会造成土壤酸化或盐渍化。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种铁载体根际促生菌的应用，能有效防治香樟缺铁性黄化病，且具有工艺简单、环境安全、持效期长、成本低的优点。
8.为了实现上述目的，本发明提供了一种铁载体根际促生菌的应用，所述促生菌的应用为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus fusiformis)应用于预防和/或治疗香樟缺铁性黄化病。
9.进一步的，所述铁载体根际促生菌的发酵方法为：将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌转移至ph为8.0～10.0的lb液体培养基中，于26～30℃、140～160r/min条件下震荡培养至对数生长期得到种子菌液；将种子菌液按2％体积比例的接种量接种于ph为8.5～10.5的新鲜lb液体培养基中，于26～30℃、140～160r/min条件下振荡培养发酵40～48h得到发酵液。
10.进一步的，将发酵液通过平板计数的方式计算发酵液中的有效活菌数，然后将发酵液进行离心，弃去上清液，用水将发酵液稀释成活菌浓度为109cfu/ml的发酵稀释液，将发酵稀释液浇灌或喷施于种植有香樟的土壤中；每株园林绿地香樟树喷施2～4l，每年平均喷施1～2次。
11.优选的，园林绿地香樟树的胸径为20～30cm。
12.与现有技术相比，本发明通过筛选出碱性土壤条件下防治香樟缺铁性黄化病的高效铁载体细菌——纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，该菌剂接种后显著提高了香樟叶片中铁元素含量，提高叶片叶绿素含量与光合效应，提高株高、茎粗、鲜重、叶片数量、根长等，改善香樟根型，达到有效防治香樟缺铁性黄化病的效果，且工艺简单、环境安全、持效期长、降低了成本，防止了对土壤的酸化、盐渍化等影响。
附图说明
13.图1为本发明筛选菌种及其应用的流程图；
14.图2为本发明中接种菌种后对香樟根系状况的对比效果图。
具体实施方式
15.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
16.本发明所用原料及试剂除特殊说明外均可由市场购买得到。
17.本发明中使用到的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus fusiformis)可以通过市场购买得到，也可以通过本领域技术人员的常规筛选方法得到。
18.如图1所示，本实施例中使用到的铁载体根际促生菌是通过如下筛选方法得到的：
19.(1)香樟铁载体根际促生菌的分离与纯化
20.取碱性土壤条件下香樟树根际土壤10g，ph为8.3-8.7，放入100ml无菌水中充分混合后制作成为1：10的悬浊液，静止一段时间后等待土粒沉淀后取1ml样液上清液加入1l无菌水中制备10-4
的稀释液，以同样方法依次制备10-6
的稀释液和10-7
的稀释液。
21.将酵母粉5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g混合后，加去离子水定容1000ml制得lb培养
液；将制备好的lb培养液分装至100ml的锥形瓶中，分别加入3g琼脂至每个锥形瓶，包扎好放入高温120℃灭菌锅中灭菌20min。待溶液温度到80-85℃后取出放入超净台倒板，静置30min冷却。在超净台上用100ul移液器将稀释的菌液109cfu/ml转移至lb固体培养基平板上，用涂布器均匀涂布，用封口胶封好贴上标签放入生化培养箱中28℃培养，每日定时观察菌株生长状况，待到48h后，观察菌株外观形态。
22.采取平板划线纯化法对分离的菌株进行纯化，根据外观形态鉴别不同菌种，每种菌挑取3个单菌落划线。
23.(2)香樟铁载体根际促生菌的筛选
24.将分离纯化得到的不同类型菌株分别接种至cas固体培养基，配制材料为：络天青60.5mg、ctab 72.9mg、1mmol/l六水三氯化铁(溶于10mmol/l的氯化氢溶液中)10ml、0.1mol/l磷酸缓冲液50ml、去离子水940ml、琼脂含量为0.9％。每种细菌挑取3个单菌落(3次重复)，然后将接有菌株的平板倒置于28℃生化培养箱中培养，每日定时观察菌株生长状况，铁载体能与fe
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形成更稳定的螯合物，使其颜色从蓝色变为橙红色，观察菌株周围有无黄色圆晕以及圆晕大小，圆晕越大，产生铁载体的能力越强，对能产生铁载体的细菌进行划线纯化后保存备用。
25.将上述筛选出的菌株进行种属鉴定，鉴定结果为：该铁载体根际促生菌为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus fusiformis)，同源性达到98.80％。
26.实施例一：铁载体根际促生菌的发酵
27.铁载体根际促生菌的发酵方法为：将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌转移至ph为8.0～10.0的lb液体培养基中，于26～30℃、140～160r/min条件下震荡培养至对数生长期得到种子菌液；将种子菌液按2％体积比例的接种量接种于ph为8.5～10.5的新鲜lb液体培养基中，于26～30℃、140～160r/min条件下振荡培养发酵40～48h得到发酵液。
28.将发酵液通过平板计数的方式计算发酵液中的有效活菌数，然后将发酵液进行离心，弃去上清液，用水将发酵液稀释成活菌浓度为109cfu/ml的发酵稀释液，备用。
29.实施例二：盆栽香樟接种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌
30.香樟苗：香樟种子来自徐州种子有限公司，选用颗粒饱满的香樟种子，以70～80℃的热水浸泡，水与种子的体积比为2:1，充分搅拌至水温为50～60度之间，置于恒温28℃的生化培养箱里，自然冷却，24h后取出，清洗后取湿润毛巾包好继续置于培养箱内催芽，每日清洗1次，洗去种子表面的黏着物，待种子出苗后移植到盆中。
31.选取10盆香樟苗，其中5盆用于接种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，出苗2个月后浇灌一次活菌浓度为109cfu/ml的发酵稀释液50ml，另5盆未接种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(为ck对照组)，在同一时间浇灌一次自来水50ml作为对照，半个月后，收集植株，分别测定其各项生理指标，结果如图2、表1～3所示。
32.表1纺锤形赖氨酸芽杆菌接种对香樟苗生长状况影响结果
33.处理跟长(cm)株高(cm)茎粗(cm)鲜重(g)叶片数量(片)ck对照7.25
±
0.48b6.92
±
0.05b1.672
±
0.148b1.604
±
0.035b3.6
±
0.7a接种菌剂8.90
±
0.24a7.23
±
0.11a2.077
±
0.236a1.758
±
0.037a3.7
±
0.8a
34.注：不同字母表示处理间差异显著。
35.从图2和表1中可以看出，纺锤形赖氨酸芽孢杆菌接种处理有效增高株高、加粗茎
粗，有效增加香樟的鲜重、叶片数量、侧根数目以及生长点数量，同时增加香樟根长，从而增加根系吸收面积，有效促进植物对营养元素的吸收，利于香樟的生长发育，较好改善香樟的生长状况。
36.表2纺锤形赖氨酸芽孢杆菌接种对香樟苗光合效应的影响
[0037][0038]
注：不同字母表示处理间差异显著。
[0039]
从表2中可以看出，接种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌较对照组在一定程度上提高了香樟的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率，而胞间co2浓度含量降低。
[0040]
表3纺锤形赖氨酸芽孢杆菌接种对香樟叶绿素、铁元素含量、fcr活性的影响
[0041][0042]
注：不同字母表示处理间差异显著。
[0043]
从表3中可以看出，接种纺锤形赖氨酸芽杆菌较对照组提高了香樟叶片中叶绿体含量、总铁含量、根系三价铁螯合物还原酶(fcr)活性，有效提高了香樟对铁的吸收，改善香樟缺铁黄化的现象。
[0044]
实施例三：园林绿地香樟树接种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌
[0045]
将活菌浓度为109cfu/ml的发酵稀释液浇灌或喷施于种植有香樟树的园林绿地中；绿地土壤性质见表4，每株香樟树接种2l或4l，于春季接种，两次接种处理的相隔半个月进行第二次接种，第二次接种1个月后测定叶绿素及叶片中铁元素含量，统计香樟的黄化情况，首先观察植物整株情况，然后对香樟树冠上、中、下三层，每层东南西北各取一个枝条进行具体统计，整体与具体统计综合考虑，对植株的黄化级别进行分类，结果如表4所示。
[0046]
从表4中可以看出，接种菌剂2l或4l一个月后实验绿地香樟植株叶片开始逐渐变绿，与对照相比，第ⅰ级别，全绿的香樟植株在各处理当中基本很难见到，主要是因为香樟新抽生的枝条最先端叶片有少许黄化，尤其是树冠上层，属于正常的生长现象。第ⅳ、
ⅴ
级别各处理随着接种量及接种次数的增加，严重黄化与明显黄化比率逐渐减少，相对应的，第ⅱ、ⅲ级别随着接种量及接种次数的增加，不明显黄化及稍微黄化株数明显增加，说明接种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌香樟树严重缺铁黄化及明显黄化的株数转绿效果更明显，相对生长正常的植株明显增加；表5中实验数据显示叶绿素含量及叶片中铁元素含量明显增加，香樟缺铁性黄化症状明显改善，实践显示纺锤形赖氨酸芽孢杆菌剂接种能防治香樟缺铁性黄化病。
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表4园林绿地中接种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌香樟树不同级别黄化比率
[0048]
[0049][0050]
表5园林绿地中接种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌防治香樟树黄化效果
[0051]
处理叶绿素含量(mg/g)总铁含量(mg/kg)ck对照0.141～1.775304.641～503.876接种菌剂2l/1次0.274～3.411369.854～620.942接种菌剂2l/2次0.384～3.513414.641～643.876接种菌剂4l/1次0.474～3.614409.854～650.942接种菌剂4l/2次0.534～3.710400.854～665.942