柠檬烯制备植物诱抗剂的应用的制作方法

1.本发明属于植物及其应用领域，具体涉及柠檬烯制备植物诱抗剂的应用。


背景技术：

2.柠檬烯(limonene)是广泛存在于芸香科植物中的一种天然单萜烯，也往往是芸香科植物挥发油作用时的关键物质。因柠檬烯来源广泛，提取简单，应用面广、实用价值高，近年来对其研究逐渐增多和深入，应用场景逐渐扩大，涵盖了食品、医药、农业等方面。
3.柠檬烯又称苎烯、双戊烯等，学名为1
‑
甲基4
‑
异丙基环己烯，是一种天然的功能性单萜，常温下呈无色至淡黄色油状液体，具有怡人的柠檬味芳香，分子式为c
10
h
16
，分子量为136.23，易溶于乙醇和大部分非挥发性油，储存于2℃
‑
8℃干燥避光条件下，在光照条件下易发生氧化，也不宜储存过久以免其发生聚合。柠檬烯有三种存在形式，d
‑
柠檬烯、l
‑
柠檬烯、dl
‑
柠檬烯，广泛存在于植物精油中，其中主要存在于柑橘类植物中的d
‑
柠檬烯，且其挥发油中的d
‑
柠檬烯含量高达90％，有的甚至高达95％，因此对于柠檬烯的提取和应用主要是d
‑
柠檬烯。在农用方面，有文献报道柠檬烯对植物病原真菌等有一定的抑菌作用，对多种害虫有一定的杀虫活性，但其诱导植物抗病活性及诱导植物抗逆活性暂无相关研究报道，其在农业、园艺和林业领域上的应用有待于进一步开发。


技术实现要素：

4.本发明利用生物活性测定、生理生化测试等方法明确了柠檬烯的诱导植物抗病活性和诱导植物抗逆活性，并制备了以柠檬烯为活性成分的植物诱抗剂和生物刺激素，并在田间应用。
5.本发明公开了利用柠檬烯制备植物诱抗剂并在农业生产中应用。其应用范围包含诱导植物抗病活性和诱导植物抗逆活性。本发明提供的植物诱抗剂可以诱导提高植物对真菌病害、细菌病害、线虫病害、害虫、病毒病害以及高温、低温、干旱逆境的抗性。
6.本发明公开了利用柠檬烯制备生物刺激素并在农业生产中应用。
7.具体的：
8.柠檬烯用于制备植物诱抗剂的应用，所述的植物诱抗剂的应用范围包含诱导植物抗病或诱导植物抗逆。
9.可选的，所述的柠檬烯为d
‑
柠檬烯和l
‑
柠檬烯中的一种或其组合，其中d
‑
柠檬烯和l
‑
柠檬烯的结构如下所示：
[0010][0011]
一种植物诱抗剂，包含柠檬烯，按质量百分比计，柠檬烯的含量为1％～100％。
[0012]
可选的，按质量百分比计，柠檬烯的含量为0.1％～1％。
[0013]
可选的，按质量百分比计，柠檬烯的含量为30％。
[0014]
可选的，所述的柠檬烯为d
‑
柠檬烯和l
‑
柠檬烯中的一种或其组合，其中d
‑
柠檬烯和l
‑
柠檬烯的结构如下所示：
[0015][0016]
一种具有诱导植物抗性活性的组合物，所述组合物包含柠檬烯和另一种或两种以上商品化农药的混合物，按质量百分比计，其中柠檬烯的含量为0.1％～99％；所述商品化农药包括植物诱抗剂、杀真菌剂、杀细菌剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、杀螨剂及其组合。
[0017]
可选的，按质量百分比计，其中柠檬烯的含量为0.02％～0.08％。
[0018]
可选的，所述的柠檬烯为d
‑
柠檬烯和l
‑
柠檬烯中的一种或其组合，其中d
‑
柠檬烯和l
‑
柠檬烯的结构如下所示：
[0019][0020]
一种用于提高植物免疫能力的方法，所述方法包括以下步骤：将本发明所述的植物诱抗剂或本发明所述的具有诱导植物抗性活性的组合物施用于植物邻近的区域、适于支持植物生长的土壤、植物的根以及叶中的至少一种。
[0021]
本发明所提及的诱导植物抗病活性本质为提升植物自身的抗病能力，为广谱的抗病活性，可用于增强植物对细菌性、真菌性、病毒、卵菌及线虫侵染的抗病能力。本发明所提及的诱导植物抗逆活性本质为诱发植物的抗逆潜能，可用于增强植物在受病虫害、杂草等生物因素以及温度、水分、盐碱、化学因素和天气等理化因素的胁迫时的抗旱、抗寒、抗盐分、抗病等能力。本发明所述的植物诱抗剂为农药的一种，也可称为植物免疫激活剂等，其没有直接杀菌活性，但可通过诱导植物产生抗病活性或抗逆活性达到控制和预防植物上真菌、细菌、病毒以及线虫、昆虫等有害生物侵袭，具有病原菌不易产生抗性、防治谱相对较广、可与化学药剂混用等优势，是一种符合绿色防控要求的农药。本发明所提及的生物刺激素，其既不是农药，更不是传统肥料。生物刺激素的靶标是农作物本身，它可以改善植物的生理生化状态，提高农药效果和肥料的利用率，改善农作物抵抗逆境的水平，也改善农作物的最终产量和农产品品质。
附图说明
[0022]
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具
体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
[0023]
附图1是烟草叶片喷施柠檬烯后体内pod的活力变化；
[0024]
附图2是烟草叶片喷施柠檬烯后体内pal的活力变化；
[0025]
附图3是烟草叶片喷施柠檬烯后体内h2o2含量的变化；
[0026]
附图4是烟草叶片喷施柠檬烯后体内抗病基因表达量的变化。
具体实施方式
[0027]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0028]
本公开的化合物柠檬烯可以通过多种技术获得，如化学合成方法；又如从含柠檬烯植物中提取、制备获得，提取、制备方法可以通过多种已知技术中的任一种，如：压榨法、超临界流体萃取、溶剂(乙醇、甲醇、丙酮等)热回流提取、溶剂(乙醇、甲醇、丙酮等)渗滤法等。可用于提取柠檬烯的植物材料包括但不局限于橙树果皮及叶、柑橘果皮及叶果皮、桔果皮及叶、柚果皮及叶等。在本公开中所用柠檬烯为购买自化学试剂平台。
[0029]
本发明的实施例中生物活性测定结果和生理生化实验结果证明，柠檬烯具有诱导植物抗病和诱导植物抗逆。实例1证明柠檬烯对烟草花叶病毒具有显著抗病毒作用，并且d
‑
柠檬烯和l
‑
柠檬烯活性相当，主要作用方式为保护；实例2证明柠檬烯对烟草花叶病毒具有显著诱导抗病活性，局部使用柠檬烯可以诱导烟草未施药部位产生抗病性；实例3、4、5、6证明柠檬烯处理后使烟草体内相关防御酶活性、过氧化氢含量以及抗病基因表达水平均有所提高，说明柠檬烯处理诱导烟草体内发生了抗病防御行为；实例7、8、9证明柠檬烯对烟草花叶病毒、草莓灰霉病、黄瓜白粉病均具有良好预防保护效果，表明柠檬烯对病毒病以及真菌性病害具备广谱性；实例10、11证明柠檬烯处理后显著提高辣椒叶片叶绿素含量，并使叶片电导率下降，说明柠檬烯具有诱导植物抗逆活性；实例12证明柠檬烯与多种杀菌剂复配表现出增效作用。本领域技术人员将理解，生物活性测定结果和生理生化实验结果确立了柠檬烯作为诱抗剂的一般效用。
[0030]
本公开的柠檬烯可以通过多种已知技术中的任一种，作为包含所述柠檬烯的配置品来施用。例如，例如，可以在不损害植物的商业价值的情况下将化合物施用于植物的根或叶以诱导植物抗性或促进植物生长。可以以任何通常使用的配制品类型的形式来施用柠檬烯，例如作为溶液、粉剂、悬浮液、可湿性粉剂、可溶性液剂、可流动浓缩物或可乳化浓缩物，具体包括但不局限于：种子处理乳剂、水乳剂、大粒剂、微乳剂、水溶性乳剂、可溶性乳剂、水分散性粒剂、毒谷、气雾剂、块状毒饵、缓释块、浓毒饵、胶囊粒剂、微胶囊悬浮剂、干拌种粉剂、乳油、静电喷雾剂、油包水乳剂、水包油乳剂、烟雾罐、细粒剂、烟雾烛、烟雾筒、烟雾棒、种子处理悬浮剂、烟雾片、烟雾丸、粒状毒饵、热雾剂、药漆、微粒剂、油悬剂、油分散性粉剂、片状毒饵、浓胶剂、泼浇剂、种衣剂、涂抹剂、悬浮乳剂、成膜油剂、可溶性粉剂、种子处理水溶性粉剂、超低容量悬浮剂、追踪粉剂、超低容量液剂、湿拌种水分散性粉剂中的任意一种。
[0031]
优选地，本公开的柠檬烯以配置品的形式施用，所述配置品包含柠檬烯与植物学上可接受的载体。浓缩的配置品可以分散在水或其它液体中以用于施用，或者配制体可以
是尘装或颗粒状。可以根据农业化学领域中常规的程序来制备配制品。本公开设想了可以通过其来配制包含柠檬烯用于递送并用作诱抗剂的所有媒介物，包括所有植物学上可以接受的惰性载体、表面活性剂、乳化剂、有机溶剂或水等。
[0032]
所述配制品可以任选的包括含有其它杀有害生物或其它具有诱抗活性化合物的组合。此类另外的杀有害生物化合物或其它具有诱抗活性化合物可以是在选择用于施用的介质中与柠檬烯相容并不拮抗的杀真菌剂、杀虫剂、除草剂、杀线虫剂、杀螨剂、杀节肢动物剂、杀细菌剂、植物诱抗剂或其组合。因此，在这样的实施例中，另一种杀有害生物化合物或诱抗活性化合物被用作补充药剂。组合中柠檬烯和另一种化合物通常可以以1：100至100：1的重量比存在。
[0033]
本发明另一个实施例是利用柠檬烯制备生物刺激素及其农业生产中应用。其本质也在于利用柠檬烯的诱抗活性。
[0034]
本发明的另一个实施例是施用柠檬烯用于提高植物免疫能力并保护植物免受有害生物的侵染的方法，包括将柠檬烯施用于植物、植物邻近的区域、适于支持植物的生长的土壤、植物的根、以及叶中的至少一种。
[0035]
为了更好的理解发明的实质，下面用实施例来详细说明发明的技术内容，但发明并不局限于这些实施例。
[0036]
实施例1：柠檬烯抗tmv活性测定
[0037]
(1)保护活性
[0038]
配制浓度为0.02mg/ml、0.1mg/ml和0.5mg/ml柠檬烯溶液，选取长势一致、健康的5～6叶期心叶烟，在喷洒药剂48h后接种稀释2000倍的tmv溶液，空白对照为清水处理，阳性对照为0.1mg/ml的壳寡糖。每个处理接种3片叶子，重复3次，3d后统计枯斑数，计算抑制率。
[0039]
(2)离体钝化活性
[0040]
配制浓度为0.02mg/ml、0.1mg/ml和0.5mg/ml柠檬烯溶液，与稀释1000倍的tmv溶液等体积混合。室温放置1h后接种于长势一致、健康的5～6叶期心叶烟。空白对照为清水处理，阳性对照为0.1mg/ml的壳寡糖。每个处理接种3片叶子，重复3次，3d后统计枯斑数，计算抑制率。
[0041]
(3)治疗活性
[0042]
配制备浓度为0.02mg/ml、0.1mg/ml和0.5mg/ml柠檬烯溶液，选取长势一致、健康的5～6叶期心叶烟，在接种稀释2000倍的tmv溶液48h后喷洒药剂处理。空白对照为清水处理，阳性对照为0.1mg/ml的壳寡糖。每个处理接种3片叶子，重复3次，3d后统计枯斑数，计算抑制率。
[0043]
抑制率(％)＝(对照枯斑数
‑
处理枯斑数)/对照枯斑数
×
100
[0044]
结果见表1。
[0045]
表1：柠檬烯对tmv的保护、钝化和治疗效果
[0046][0047]
注：数据为平均值
±
标准误，3种活性之间的显著性差异通过spss软件中duncan多重范围检验(dmrt)，不同的字母表示数据之间在0.05水平上存在显著差异性。
[0048]
由表1可知，d
‑
柠檬烯和l
‑
柠檬烯对tmv侵染植物具有良好的保护作用，说明提前施药可以使烟草具有一定的抗病效果。而柠檬烯对tmv的钝化作用一般，说明柠檬烯没有对tmv粒体造成直接损害或者损伤效果较弱，不及提前施药引起的抗病作用。
[0049]
实施例2：柠檬烯诱导烟草抗tmv活性测定
[0050]
选取心叶烟进行诱导抗病活性测试，心叶烟可以形成病毒枯斑，普通烟上的症状是花叶，不同的症状用不同的方法统计抗病情况。将0.02mg/ml、0.1mg/ml和0.5mg/ml柠檬烯喷洒到长势一致的6～7叶期的烟草下部三片叶片。在48h后接种tmv至未喷药的上部叶片。空白对照为清水处理，阳性对照为壳寡糖溶液。每株接种2～3个叶片，每个处理包括10株烟草，整个试验重复3次。3d后统计心叶烟枯斑数的病情指数，计算抑制率公式如上，计算防治效果公式如下。
[0051]
病情指数＝∑(病级数
×
病株数)/(最高病级
×
各处理总株数)
×
100；
[0052]
防治效果＝(对照病指—处理病指)/对照病指
×
100％；
[0053]
结果见表2。
[0054]
表2：柠檬烯对tmv的诱导抗病效果
[0055][0056]
注：数据为平均值
±
标准误，3种活性之间的显著性差异通过spss软件中duncan多
重范围检验(dmrt)，不同的字母表示数据之间在0.05水平上存在显著差异性。
[0057]
由表2可知，在心叶烟上，d
‑
柠檬烯和l
‑
柠檬烯展示了显著的诱导植物抵抗tmv的效果，说明局部使用柠檬烯可以诱导烟草未施药部位产生抗病性。
[0058]
实施例3：柠檬烯引起烟草防御酶pod的活性变化
[0059]
将0.02mg/ml、0.1mg/ml和0.5mg/mld
‑
柠檬烯和l
‑
柠檬烯喷洒到叶片后分别在第1，3，5，7，9，11天取叶片，检测防御酶pal、pod的活性变化。称取植物叶片5g，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂、分2～3次加入总量为5ml的0.1mol/l，ph5.5的乙酸
‑
乙酸钠缓冲液。研磨成匀浆后于4℃，12,000r/min离心15min，上清液即为粗酶提取液。取试管加入3ml 25mmol/l创愈木酚和5ml酶提取液，再加入200μl，5mol/l h2o2溶液迅速混合启动反应。以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在波长470nm处的值，每隔1min记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。试验重复三次。酶活性计算公式如下：od
470
＝od
470f
—od
470i
/tp～ti，式中od
470f
‑
反应液终止值；od
470i
‑
反应液初始值；tp
‑
反应终止时间，min；ti
‑
反应起始时间，min。以每克样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个过氧化物酶活性单位，单位是δod
470
/min
·
g。计算公式如下：u(δa
470
·
g
‑1min
‑1)＝[δa
470
×
酶提取液总量]/[样品鲜重
×
测定时酶液量]
[0060]
结果如附图1所示。
[0061]
实施例4：柠檬烯引起烟草防御酶pal的活性变化
[0062]
取烟草叶片1.25g，加入5ml酶提取液(0.1mol/l ph8.8 tris
‑
h2so4缓冲液)和5g聚乙烯吡咯烷(pvp)，用研钵或者组织捣碎机匀浆。过滤后滤液在4℃低温下10,000g离心30min，取上清液测量体积。取1ml 0.1mol/l苯丙氨酸溶液和2ml 0.1mol/l tris
‑
h2so4缓冲液(ph 8.8)(对照管不加底物苯丙氨酸，直接取3ml的缓冲液)置试管中，用30℃水浴保温3min。在各只试管中加入5ml待测酶液，空白管不加酶液，摇匀后立即在209nm波长下测定起始值，用空白管调零.并精确计时。将各支试管放到30℃水浴保温反应30min，再次测定a
209
。以每小时在290nm处光密度增加0.01所需酶量为1单位u(g
·
fw
·
h)。u＝(δa
×
提取液总体积)/(0.01
×
t
×
w
×
测定酶液用量)，式中δa为前后2次测定的吸光度差值；w为样品鲜重(g)；t为反应时间(30min)。
[0063]
d
‑
柠檬烯和l
‑
柠檬烯引起烟草叶片内防御酶的活性发生明显变化(见附图2)。pod的活性在1～3天时保持稳定或缓慢增加，在第5天时达到峰值。据报道pod可以消除植物体内的过氧化物，说明pod在5天以后开始大量发挥活性，消解过多的h2o2和其他活性氧，避免对植物造成活性氧损伤。pal是防御作用中的关键酶，据报道其对抗病的产生有关键作用。pal在0～5天之内呈现快速的、明显的增加趋势，在第5天达到最高值，引起植物体内的抗病反应及其他抗病信号的产生和传递。
[0064]
实施例5：柠檬烯引起烟草h2o2的含量变化
[0065]
取叶片5g，加入3ml预冷的丙酮和少许石英砂，在冰浴上研磨成浆，12,000g条件下4℃离心20min。取上清液1ml，按照下表4依次加入试剂，得到的沉淀用预冷的丙酮反复洗涤离心2～3次(3000g，每次10min，弃上清液保留沉淀)，直到沉淀没有光合色素的颜色。再向沉淀中加入3ml硫酸溶解沉淀进行比色测定。建立标准曲线计算叶片中h2o2的量，计算公式如下：
[0066]
h2o2(nmol/g
·
fw)＝(n
×
v)/(v
×
m)
[0067]
式中，n为根据标准曲线计算的h2o2的量(nmol)；v为样品上清液体积(ml)；v为用于显色的样品上清液的体积(ml)，本实验中为1ml；m为样品鲜重(g)。
[0068]
制作标准曲线：取6支试管，编号，在通风橱中按照表3加入各个试剂，混匀，反应5min后12,000g离心力下4℃离心15min，留沉淀。加入盐酸3ml，摇动使得沉淀溶解。以0号管为对照调零，在波长412nm处比色测定溶液的吸光度。以h2o2的量(nmol)为横坐标，od值为纵坐标制作标准曲线。
[0069]
表3：制作h2o2含量测定的标准曲线
[0070][0071]
结果如附图3所示，柠檬烯可以引起烟草植株体内h2o2含量发生明显变化。在施药后3d后，h2o2含量快速增加，达到峰值，5d之后含量逐渐减少。
[0072]
实施例6：柠檬烯引起烟草抗病基因表达量的变化
[0073]
将4～6叶期烟草喷洒柠檬烯溶液，并在处理后1～10天内，每隔一天采集样品。用液氮法提取烟草的总rna，并通过实时荧光定量pcr，测定抗病相关基因npr1，pr1和pr2基因的表达量变化。
[0074]
结果如附图4所示，d
‑
柠檬烯和l
‑
柠檬烯可以引起抗病相关基因pr蛋白的转录水平发生明显变化。(其中，npr1，pr1，pr2的表达量相对于对照组分别增加了8.3倍，3.2倍和3.5倍。说明d
‑
柠檬烯和l
‑
柠檬烯诱导烟草体内发生了抗病防御行为。
[0075]
实施例7：柠檬烯制剂对烟草花叶病毒的田间小区防效
[0076]
小区试验为随机排列，重复3次，小区面积等于60
㎡
，试验地选择要求肥力均匀、作物种植和管理水平一致，各处理间及试验区周围要设保护行。叶面常量喷雾，以阿泰灵500倍液为对照药剂进行叶面常量喷雾作为阳性药剂对照，并设清水对照。所有供试药剂必须进行二次稀释。自心叶烟4～5叶期喷药，后每隔4d喷1次，共3次。最后一次喷药2d后取顶部整叶摩擦接种tmv，每株接种3叶，每处理10株，重复三次，接病毒10d后调查各处理病情指数，计算防效。
[0077]
病害分级标准按照中华人民共和国烟草行业标准一烟草花叶病毒严重度分级调查方法(yc/t 39—1996)：
[0078]
0级：全株无病；
[0079]
1级：心叶脉明或轻微花叶，或者上部1/3叶片花叶但不变形，植株无明显矮化；
[0080]
2级：1/3至1/2叶片花叶，或者少数叶片变形；或者主脉变黑，植株矮化正常株高的2/3以上；
[0081]
3级：1/2至2/3花时，或者变形或主侧脉变黑，植株矮化为正常株高1/2至2/3；
[0082]
4级：全株叶片花叶，严重畸形或坏死，病株矮化为正常植株高度l/3至1/2。为细化
调查结果，在以上严重度的分级基础上，对分级标准进行细化，在1、2级之间增加l 级，在2、3级之间加2 级，在3、4加之间增加3 级，级别记为1.5、2.5、3.5：
[0083]
1 级：心叶脉明或轻微花叶，或上部1/3叶片花叶至轻微皱缩，植株无明显矮缩化；
[0084]
2 级：l/3至1/2叶片花叶、叶片变形，或主脉变黑，植株矮化为正常植株的2/3以上；
[0085]
3 级：1/2至2/3叶片花叶、或变形或主侧脉坏死，或植株矮化为正常株高的1/2。
[0086]
根据严重度计算病情指数，以防治效果为衡量不同处理的效果。
[0087]
病情指数＝∑[(感病植株数
×
严重度分级代表值)/(总调查株数
×
严重度最高级代表值)]
×
100％
[0088]
防效％＝((对照平均病情指数
‑
处理平均病情指数)/对照平均病情指数)
×
100％
[0089]
结果见表4。
[0090]
表4：柠檬烯制剂防治烟草病毒病田间小区药效试验
[0091][0092][0093]
从上表可知，柠檬烯制剂对烟草花叶病毒具有良好的防控效果。
[0094]
实施例8：柠檬烯制剂对草莓灰霉病的田间小区药效试验
[0095]
选取大棚草莓进行小区试验。大棚试验地一般肥力均匀，种植水平一致，病情发生及危害程度比较均匀，便于控制管理。各处理间及试验区周围要设保护行，小区面60
㎡
，试验重复3次。用液量为10kg/60m2。以清水和阿泰灵500倍液分别为阴性和阳性对照进行叶面喷雾。所有供试药剂必须进行二次稀释。自草莓长至2月龄期，封棚后第1天开始喷药，后每隔5d喷1次，共3次。最后一次喷药后15d调查病叶发病率和统计病情指数，计算防效。病情分级标准如下：
[0096]
0级：无病斑；
[0097]
1级：病斑面积5％以下；
[0098]
3级：病斑面积6％～10％；
[0099]
5级：病斑面积11％～20％；
[0100]
7级：病斑面积21％～50％；
[0101]
9级：病斑面积50％以上。
[0102]
病情指数及防治效果用以下公式计算。
[0103]
病情指数＝∑[(每级病叶数
×
相对级数)/(总调查株数
×
9)]
×
100％
[0104]
防效％＝[(对照平均病情指数
‑
处理平均病情指数)/对照平均病情指数]
×
100％
[0105]
结果见表5。
[0106]
表5：柠檬烯制剂及含柠檬烯的精油和提取物的制剂防治草莓灰霉病田间药效试验
[0107]
[0108][0109]
从上表可知，柠檬烯制剂对草莓灰霉病具有良好的预防保护效果。
[0110]
实施例9：柠檬烯制剂对黄瓜白粉病的田间小区药效试验
[0111]
小区试验为随机排列，重复3次，小区面积等于60
㎡
，试验地选择要求肥力均匀、作物种植和管理水平一致，各处理间及试验区周围要设保护行。叶面常量喷雾，以清水和阿泰灵500倍液分别为阴性和阳性对照进行叶面喷雾。所有供试药剂必须进行二次稀释。黄瓜定植后5～6片真叶时喷药，喷液量以均匀喷湿叶面，药液开始下滴为止。每隔7d喷1次，共3次。最后一次喷药15d后调查病情指数，计算防效。每小区随机取5点调查，每点调查5株，，每株按上、中、下部分别调查5片叶片。病情分级标准如下：
[0112]
0级：无病斑；
[0113]
1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；
[0114]
3级：病斑面积占整个叶面积的6％～10％；
[0115]
5级：病斑面积占整个叶面积的11％～25％；
[0116]
7级：病斑面积占整个叶面积的26％～50％；
[0117]
9级：病斑面积占整个叶面积的50％以上。
[0118]
病情指数＝∑[(每级病叶数
×
相对级数)/(总调查株数
×
9)]
×
100％
[0119]
防效％＝((对照平均病情指数
‑
处理平均病情指数)/对照平均病情指数)
×
100％
[0120]
结果见表6。
[0121]
表6：柠檬烯制剂防治黄瓜白粉的田间防效
[0122][0123]
从上表可知，柠檬烯制剂对黄瓜白粉病具有良好的预防效果。
[0124]
实施例10：柠檬烯处理对辣椒叶绿素含量的影响
[0125]
每小区随机挑选生长势一致的10株辣椒，摘取上部的功能叶片用于测定，每处理重复三次。取新鲜擦净的辣椒叶片，去掉中脉剪碎并混匀用于测定。根据公式计算出辣椒叶片的叶绿素a、b的浓度，换算成叶片中总叶绿素质量。
[0126]
c
a b
＝c
a
c
b
＝8.05od
663
20.29od
645
[0127]
结果见表7。
[0128]
表7：柠檬烯处理对叶绿素含量的影响
[0129][0130]
从上表可知，不同浓度的d
‑
柠檬烯和l
‑
柠檬烯处理对叶绿素含量有一定的影响，其中，100％含量的d
‑
柠檬烯和l
‑
柠檬烯可溶液剂在稀释倍数为200倍、400倍和800倍处理下叶绿素含量较空白对照分别提高了25.52％和25.59％、9.77％和10.6％、4.17％和5.10％。可见，柠檬烯处理可显著提高辣椒叶片中叶绿素含量。
[0131]
实施例11：柠檬烯提高辣椒抗逆活性
[0132]
通过测定叶片细胞膜通透性，来间接反映药剂处理后植株的抗逆活性。将叶片清洗干净，打孔器打孔。称取0.3g打孔叶片放入干净100ml烧杯中，用去离子水80ml淋洗3次后，加入去离子水50ml，静置3h，用电导仪测定电导率。测定后沸水浴15min，冷却后立即测定其电导率。计算如下：电导率(％)＝(处理电导率/煮沸电导率)
×
100
[0133]
结果见表8。
[0134]
表8：柠檬烯处理对辣椒叶片电导率的影响
[0135]
[0136][0137]
由上述可知，d
‑
柠檬烯和l
‑
柠檬烯处理后的叶片电导率随浓度的升高有所下降。柠檬烯对植株中抗逆相关指标具有诱导作用，具体表现为保护酶活性增强，膜间通透性下降，所以柠檬烯处理激活了植株的抗氧化系统，使植株叶片抗氧化酶活性提高，使植株对环境的适应能力随之提高。
[0138]
实施例12：柠檬烯对商品化杀菌剂田间防效的增效作用
[0139]
小区试验为随机排列，重复3次，小区面积等于60
㎡
，试验地选择要求肥力均匀、作物种植和管理水平一致，各处理间及试验区周围要设保护行，小区面60
㎡
，试验重复3次。用液量为10kg/60m2。以50％多菌灵可湿性粉剂、80％代森锰锌可湿性粉剂、50％福美双可湿性粉剂稀释1000倍后添加不同浓度的柠檬烯进行叶面喷雾，阿泰灵稀释500倍后分别添加不同浓度的柠檬烯进行叶面喷雾。所有供试药剂必须进行二次稀释。病情统计调查同实例7、8、9。病情分级标准如下：
[0140]
0级：无病斑；
[0141]
1级：病斑面积5％以下；
[0142]
3级：病斑面积6％～10％；
[0143]
5级：病斑面积11％～20％；
[0144]
7级：病斑面积21％～50％；
[0145]
9级：病斑面积50％以上。
[0146]
病情指数及防治效果用以下公式计算。
[0147]
病情指数＝∑[(每级病叶数
×
相对级数)/(总调查株数
×
9)]
×
100％
[0148]
防效％＝[(对照平均病情指数
‑
处理平均病情指数)/对照平均病情指数]
×
100％
[0149]
结果见表9。
[0150]
表9：柠檬烯提高杀菌剂田间药效
[0151][0152]
从上表可知，添加d
‑
柠檬烯可显著提升多菌灵等杀菌剂对草莓灰霉病、黄瓜白粉病的防治效果；提升阿泰灵对烟草花叶病毒病、草莓灰霉病、黄瓜白粉病的防治效果。
[0153]
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简
单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
[0154]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0155]
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。