重组人半乳糖凝集素1抑制剂的制药用途的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及重组人半乳糖凝集素1抑制剂的制药用途。


背景技术：

2.胃癌(gastric cancer，gc)是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，2020年全球新增病例超过100万，导致约76.9万患者死亡，其中60％以上的病例发生于东亚人群，我国的胃癌发病率及死亡率均居世界前位。由于胃癌起病隐匿、胃镜筛查尚未普及，约80％的中国胃癌患者确诊时已出现远处转移，无法进行根治性手术，患者经化疗及靶向治疗后五年生存率不足20％。其中化疗耐药是导致患者预后较差的重要原因。
3.紫杉醇是一种二萜类化合物，主要通过抑制微管蛋白解聚，阻止有丝分裂，使细胞停留在g2/m期，最终诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。由于紫杉醇不溶于水，须使用乙醇、蓖麻油等溶剂进行溶解，易引起过敏及周围神经病等副反应，极大限制了紫杉醇的临床应用。白蛋白结合型紫杉醇(nab
‑
ptx)是使用纳米技术使疏水性紫杉醇与白蛋白结合，是一种无溶剂的紫杉醇配方，在提高紫杉醇疗效的同时减轻了毒性。白蛋白结合型紫杉醇的抗肿瘤作用已在多种实体瘤中得到证实，目前已获批应用于乳腺癌、非小细胞肺癌、食管癌的一线治疗及胃癌的二线治疗。然而，临床上白蛋白结合型紫杉醇的反应率仅有35％，因此，探索白蛋白结合型紫杉醇的耐药机制对提高胃癌患者的预后至关重要。
4.重组人半乳糖凝集素1(lgals1)是半乳糖凝集素家族的成员，该类蛋白与半乳糖苷透过酶结合，调节细胞
‑
细胞和细胞
‑
基质相互作用，诱导细胞凋亡、增殖和分化。目前尚未有lgals1抑制剂克服白蛋白结合型紫杉醇的耐药性的报道。
5.因此，我们亟需在临床上获得胃癌的白蛋白结合型紫杉醇耐药标志物，并且开发一种药物能够克服白蛋白结合型紫杉醇的耐药性，进而提高胃癌患者的治疗效果。


技术实现要素：

6.为克服现有技术中的缺陷，本发明通过如下技术方案实现：
7.本发明第一方面提供了一种lgals1抑制剂在制备抗白蛋白结合型紫杉醇耐药性药物中的用途；
8.本发明第二方面提供了一种lgals1抑制剂在制备抗肿瘤药物的用途；
9.进一步的，所述抗肿瘤药物具有治疗胃癌作用；
10.进一步的，所述抗肿瘤药物中还含有白蛋白结合型紫杉醇；
11.进一步的，所述lgals1抑制剂为otx008，其结构如式i所示：
12.附图说明
13.图1：图1a为接受白蛋白结合型紫杉醇治疗的患者胃癌及癌旁组织差异表达基因的热图；图1b为对白蛋白结合型紫杉醇治疗敏感的患者与不敏感患者胃癌组织差异表达基因的热图；图1c为对白蛋白结合型紫杉醇治疗敏感的患者与不敏感患者胃癌组织中zfp64蛋白水平检测图；
14.图2：图2a为两条shrna分别敲低zfp64,检测其对胃癌细胞白蛋白结合型紫杉醇敏感性的影响；图2b为在胃癌mgc803细胞中过表达zfp64，检测其对白蛋白结合型紫杉醇的敏感性；图2c为在胃癌hgc27细胞中过表达 zfp64，检测其对白蛋白结合型紫杉醇的敏感性；
15.图3为敲低或过表达zfp64后，胃癌细胞系对白蛋白结合型紫杉醇诱导的凋亡的改变；
16.图4：图4a为在zfp64过表达或对照细胞中分别敲减lgals1,zfp64及 lgals1蛋白表达检测图；图4b为上述各组细胞对白蛋白结合型紫杉醇处理下细胞凋亡的检测；图4c为上述各组细胞对白蛋白结合型紫杉醇处理下细胞克隆形成的检测；
17.图5：图5a为lgals1抑制剂otx008与白蛋白结合型紫杉醇联用对胃癌细胞系增殖的影响；图5b为 lgals1抑制剂otx008与白蛋白结合型紫杉醇联用对小鼠体内皮下肿瘤的抑制效果；图5c为上述各组小鼠肿瘤体积测量图；图5d 为上述各组小鼠肿瘤重量测量图。
18.有益效果
19.本发明通过实验证明：
20.(1)本发明通过分子水平上的实验证明zfp64在胃癌组织尤其是对白蛋白结合型紫杉醇治疗不敏感的胃癌组织中高表达，该基因的高表达引起胃癌细胞发生干性表型的转化，导致胃癌细胞增殖侵袭等能力的增强及对化疗药物敏感性降低；
21.(2)本发明通过探索zfp64的分子机制，通过实验证明lgals1是zfp64 下游的靶基因，是导致胃癌细胞表型改变的关键基因；
22.(3)本发明进一步通过实验加以证明lgals1抑制剂otx008具有抵抗白蛋白结合型
紫杉醇的耐药作用，otx008能够增强白蛋白结合型紫杉醇的抗肿瘤作用，该药物和白蛋白结合型紫杉醇联用具有协同抗肿瘤作用。
具体实施方式
23.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
24.otx008，为新一代的lgals1选择性小分子抑制剂，具有特异性高、毒性小等特点，已被证实可特异性抑制galectin
‑
1蛋白表达，并具有下调肿瘤细胞迁移、侵袭和肿瘤新生血管形成等作用。其化学式为：2,2',2”,2”'
‑
[五环[19,3,1,13, 7,19,13,115,19]二十八烷基
‑
1(25),3,5,7(28),9,11,13(27),15,17,19(26), 21,23
‑
十二烯
‑
25,26,27,28
‑
四烷基四氧基四[n
‑
[2
‑
二甲氨基)乙基]
‑
乙酰胺(即 2,2',2”,2”'
‑
[pentacyclo[19,3,1,13,7,19,13,115,19]octacosa
‑
1(25),3,5,7(28),9, 11,13(27),15,17 19(26),21,23
‑
dodecaene
‑
25,26,27, 28
‑
tetraylterakis(oxy)tetrakis[n
‑
[2
‑
dimethylamino)ethyl]
‑
acetamide)；分子量为 937.2，分子式为c
52
h
72
n8o8，cas登记号为：286936
‑
40
‑
1，结构如式i所示：
[0025][0026]
以下实施例中，涉及的胃癌组织及其癌旁组织是由复旦大学附属中山医院肿瘤内科提供的，已通过医院伦理委员会批准。裸鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供；otx008购自mce公司，zfp64和gapdh抗体购自abcam 公司；胃癌ags、hgc27和mgc803细胞购自上海中科院细胞库；其余常规试剂均为市售。
[0027]
实施例1zfp64基因表达影响胃癌细胞对白蛋白结合型紫杉醇的敏感性
[0028]
(1)将对2例白蛋白结合型紫杉醇耐药以及2例对白蛋白结合型紫杉醇敏感的胃癌组织及其癌旁组织进行转录组学测序，并使用deseq2 r包进行差异表达基因分析，结果如图1a、1b所示，zfp64基因的mrna水平在耐药的胃癌组织中更高。
[0029]
(2)将对2例白蛋白结合型紫杉醇耐药以及2例对白蛋白结合型紫杉醇敏感的胃癌组织样本分别进行研磨，提取蛋白样本，通过sds
‑
page电泳进行蛋白质凝胶分离，浓缩胶电压为80v，分离胶电压为120v。将蛋白凝胶转印至甲醇预处理后的pvdf膜上，转印条件为恒
流300ma，90min。pvdf膜在5％的脱脂牛奶中封闭1小时，然后在对应的一抗中4℃孵育过夜。1
×
tbst洗3次后，用对应二抗孵育1小时，最后通过凝胶成像系统显像。结果见图1c，耐药胃癌组织中zfp64的蛋白表达水平高于敏感胃癌组织。
[0030]
实施例2白蛋白结合型紫杉醇的药物敏感性检测
[0031]
(1)在hgc27和mgc803细胞中分别过表达对照空载和zfp64质粒，使用 5nm白蛋白结合型紫杉醇处理12h，24h，48h，72h，通过cck8的方法检测不同时间点的细胞活力。结果见图2a，zfp64蛋白的过表达促进了胃癌细胞对白蛋白结合型紫杉醇的耐药性。
[0032]
(2)通过shrna慢病毒(5
’‑
ctatccaggttgccagttcaa
‑3’
)敲减 ags细胞株中zfp64表达水平，将稳定敲低zfp64的ags细胞和对照细胞按每孔1500个接种至96孔板里，同时用5nm白蛋白结合型紫杉醇处理12h，24h， 48h，72h，通过cck8的方法检测不同时间点的细胞活力。结果见图2b，zfp64 的敲低增加了ags细胞对白蛋白结合型紫杉醇的敏感性。
[0033]
实施例3白蛋白结合型紫杉醇处理后的细胞凋亡检测
[0034]
(1)将稳定敲低zfp64的ags细胞和对照细胞接种在6孔板中，并用15nm 白蛋白结合型紫杉醇或pbs进行处理48h，流式细胞仪检测处理前后细胞凋亡的情况，并用flowjo软件进行数据分析；
[0035]
(2)将稳定过表达zfp64的hgc27、mgc803细胞和其对照细胞接种在6 孔板中，并用5nm白蛋白结合型紫杉醇或pbs进行处理48h，流式细胞仪检测处理前后细胞凋亡的情况，并用flowjo软件进行数据分析。
[0036]
对(1)和(2)结果分析表明，zfp64阻止了白蛋白结合型紫杉醇诱导的细胞凋亡，如图3所示。
[0037]
实施例4zfp64诱导白蛋白结合型紫杉醇耐药依赖于lgals1
[0038]
我们通过敲低和过表达zfp64，正反向证明了zfp64蛋白在胃癌白蛋白结合型紫杉醇耐药中的重要作用，鉴于zfp64是一个转录因子，我们推测zfp64 是通过调控下游靶基因lgals1的转录，发挥其促癌作用的。
[0039]
(1)在稳定过表达zfp64的hgc27和mgc803细胞及其对照细胞中转染敲低lgals1的慢病毒shlgals1(5
’‑
gcaaagacagcaacaaccutt
‑3’
) 及对照慢病毒，如图4a所示；
[0040]
(2)将转染了shlgals1及其对照慢病毒的hgc27、mgc803细胞种于6 孔板内，并用5nm白蛋白结合型紫杉醇处理48h，流式细胞仪检测细胞凋亡的情况，并用flowjo软件进行数据分析。如图4b所示，lgals1的敲减逆转了 zfp64过表达细胞对白蛋白结合型紫杉醇诱导凋亡的抵抗；
[0041]
(3)将转染了shlgals1及其对照慢病毒的hgc27、mgc803细胞用5nm 白蛋白结合型紫杉醇处理24h，接着按每孔1000个接种6孔板内，14天后弃去培养液，加入200μl 4％多聚甲醛固定细胞，然后弃去液体，用0.1％结晶紫染液对细胞进行染色30min，最后用pbs洗去未结合的结晶紫，对染色的细胞进行拍照和计数，结果见图4c，lgals1的敲减逆转了zfp64过表达细胞对白蛋白结合型紫杉醇诱导的生长抑制的抵抗。
[0042]
实施例5lgals1抑制剂otx008和白蛋白结合型紫杉醇对小鼠皮下肿瘤的联合治疗
[0043]
(1)hgc27、mgc803、ags细胞接种至96孔板，分别与白蛋白结合型紫杉醇、lgals1抑制剂otx008以及二者的联合用药进行处理，48小时后进行 cck8检测。结果如图5a，相比于单独使用一种药物，lgals1抑制剂和白蛋白结合型紫杉醇的联合使用对于胃癌细胞具有更
显著的抑制作用。
[0044]
(2)对于小鼠体内实验，将1
×
106个的zfp64稳定过表达的hgc27细胞接种裸鼠腋窝皮下，20天左右选取肿瘤大小接近的20只小鼠进行药物联合治疗。使用剂量为白蛋白结合型紫杉醇(10mg/kg)、lgals1抑制剂otx008(5mg/kg)，每周2次通过尾静脉给药。给药21天后，对小鼠的肿瘤大小和重量进行记录。结果见图5b、5c、5d，相比于单独使用一种药物，白蛋白结合型紫杉醇和 lgals1抑制剂的联合使用对于小鼠皮下白蛋白结合型紫杉醇不敏感的肿瘤具有更显著的抑制作用。
[0045]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。