编辑核苷酸序列的方法和组合物与流程

技术特征：
1.用于引导编辑(prime editing)的复合物，其包含：(i)融合蛋白，所述融合蛋白包含核酸可编程dna结合蛋白(napdnabp)和包含rna依赖性dna聚合酶活性的结构域；和(ii)引导编辑向导rna(pegrna)。2.如权利要求1所述的复合物，其中所述融合蛋白能够在所述引导编辑向导rna(pegrna)存在下进行引导编辑以在靶序列中安装期望的核苷酸变化。3.如权利要求11所述的复合物，其中所述napdnabp具有切口酶活性。4.如权利要求1所述的复合物，其中所述napdnabp是cas9蛋白或其变体。5.如权利要求1所述的复合物，其中所述napdnabp是核酸酶活性cas9、无核酸酶活性cas9(dcas9)、或cas9切口酶(ncas9)。6.如权利要求1所述的复合物，其中所述napdnabp是cas9切口酶(ncas9)。7.如权利要求1所述的复合物，其中所述napdnabp选自下组：cas9、cas12e、cas12d、cas12a、cas12b1、cas13a、cas12c和argonaute蛋白，并且任选地具有切口酶活性。8.如权利要求1所述的复合物，其中所述包含rna依赖性dna聚合酶活性的结构域是逆转录酶，所述逆转录酶包含seq id no:89
‑
100、105
‑
122、128
‑
129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701
‑
716、739
‑
741和766中的任一氨基酸序列。9.如权利要求1所述的复合物，其中所述包含rna依赖性dna聚合酶活性的结构域是逆转录酶，所述逆转录酶包含与seq id no:89
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100、105
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122、128
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129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701
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716、739
‑
741和766中的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。10.如权利要求1所述的复合物，其中所述包含rna依赖性dna聚合酶活性的结构域是来自逆转录病毒或逆转录转座子的天然存在的逆转录酶。11.如权利要求1所述的复合物，其中所述融合蛋白与pegrna复合时能够结合靶dna序列。12.如权利要求1所述的复合物，其中所述pegrna包含向导rna和包含dna合成模板的至少一个核酸延伸臂。13.如权利要求12所述的复合物，其中所述核酸延伸臂位于所述向导rna的3'或5'末端处、或所述向导rna中的分子内位置处，并且其中所述核酸延伸臂是dna或rna。14.如权利要求12所述的复合物，其中所述pegrna能够结合napdnabp并将所述napdnabp引导至靶dna序列。15.如权利要求14所述的复合物，其中所述靶dna序列包含靶链和互补的非靶链。16.如权利要求12所述的复合物，其中所述向导rna与所述靶链杂交形成rna
‑
dna杂合体和r
‑
环。17.如权利要求12所述的复合物，其中所述至少一个核酸延伸臂还包含引物结合位点。18.如权利要求12所述的复合物，其中所述核酸延伸臂为至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、至少23个核苷酸、至少24个核苷酸、至少25个核苷酸、至少26个核苷酸、至少27个
核苷酸、至少28个核苷酸、至少29个核苷酸、至少30个核苷酸、至少31个核苷酸、至少32个核苷酸、至少33个核苷酸、至少34个核苷酸、至少35个核苷酸、至少36个核苷酸、至少37个核苷酸、至少38个核苷酸、至少39个核苷酸、至少40个核苷酸、至少41个核苷酸、至少42个核苷酸、至少43个核苷酸、至少44个核苷酸、至少45个核苷酸、至少46个核苷酸、至少47个核苷酸、至少48个核苷酸、至少49个核苷酸、或至少50个核苷酸。19.如权利要求12所述的复合物，其中所述dna合成模板的长度为至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、或至少15个核苷酸。20.如权利要求17所述的复合物，其中所述引物结合位点的长度为至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、或至少15个核苷酸。21.如权利要求12所述的复合物，其中所述pegrna还包含至少一个选自下组的另外的结构：接头、茎环、发夹、趾环(toeloop)、适体或rna
‑
蛋白募集结构域。22.如权利要求12所述的复合物，其中所述dna合成模板编码与邻近切口位点的内源性dna序列互补的单链dna瓣(flap)，其中所述单链dna瓣包含期望的核苷酸变化。23.如权利要求22所述的复合物，其中所述单链dna瓣置换已产生切口的靶dna序列中具有5'末端的内源性单链dna，并且其中所述内源性单链dna在所述切口位点的紧邻下游。24.如权利要求23所述的复合物，其中细胞切除所述具有游离5'末端的内源性单链dna。25.如权利要求23所述的复合物，其中所述单链dna瓣的细胞修复导致安装所述期望的核苷酸变化，从而形成期望的产物。26.如权利要求12所述的复合物，其中所述pegrna包含seq id no:18
‑
36的核苷酸序列，或与seq id no:101
‑
104、181
‑
183、223
‑
244、277、325
‑
334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、499
‑
505、735
‑
761、776
‑
777中的任一项具有至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％序列同一性的核苷酸序列。27.如权利要求12所述的复合物，其中所述dna合成模板包含与所述内源性dna靶标至少80％、或85％、或90％、或95％、或99％相同的核苷酸序列。28.如权利要求17所述的复合物，其中所述引物结合位点与切割dna的游离3'末端杂交。29.如权利要求21所述的复合物，其中所述至少一个另外的结构位于所述pegrna的3'或5'末端。30.如权利要求29所述的复合物，其中所述接头包含选自seq id no:127、165
‑
176、446、453和767
‑
769的核苷酸序列。31.如权利要求29所述的复合物，其中所述茎环包含选自本文所述茎环的核苷酸序列。32.如权利要求29所述的复合物，其中所述发夹包含选自本文所述发夹的核苷酸序列。33.如权利要求29所述的复合物，其中所述趾环包含选自本文所述趾环的核苷酸序列。
34.如权利要求29所述的复合物，其中所述适体包含选自本文所述适体的核苷酸序列。35.如权利要求29所述的复合物，其中所述rna
‑
蛋白募集结构域包含选自本文所述rna
‑
蛋白募集结构域的核苷酸序列。36.如权利要求1所述的复合物，其中所述靶dna序列包含靶链和互补的非靶链。37.如权利要求36所述的复合物，其中所述r
‑
环包含(i)包含所述pegrna和所述靶链的rna
‑
dna杂合体，和(ii)所述互补的非靶链。38.如权利要求37所述的复合物，其中对所述靶链或所述互补的非靶链产生切口以形成具有游离3'末端的引发序列。39.如权利要求38所述的复合物，其中所述切口位点在所述靶链上的pam序列的上游。40.如权利要求38所述的复合物，其中所述切口位点在所述非靶链上的pam序列的上游。41.如权利要求38所述的复合物，其中所述切口位点相对于所述pam序列的5'末端位于
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1、
‑
2、
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3、
‑
4、
‑
5、
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6、
‑
7、
‑
8或
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9。42.如权利要求22所述的复合物，其中所述单链dna瓣与邻近所述切口位点的内源性dna序列杂交，从而在所述靶链中安装所述期望的核苷酸变化。43.如权利要求22所述的复合物，其中所述单链dna瓣置换邻近所述切口位点且具有游离5'末端的内源性dna序列。44.如权利要求22所述的复合物，其中细胞切除所述具有5'末端的内源性dna序列。45.如权利要求44所述的复合物，其中瓣核酸内切酶(flap endonuclease)切除所述具有5'末端的内源性dna序列。46.如权利要求43所述的复合物，其中所述单链dna瓣的细胞修复在所述非靶链中掺入所述期望的核苷酸变化，从而形成期望的产物。47.如权利要求46所述的复合物，其中所述期望的核苷酸变化安装在所述pam序列的约
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4至 10之间、或所述pam序列的约
‑
10至 20之间、或所述pam序列的约
‑
20至 40之间，或所述pam序列的约
‑
30至 100之间的编辑窗口中。48.如权利要求47所述的复合物，其中所述期望的核苷酸变化安装在所述切口位点下游至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、76、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、21、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸处。49.前述权利要求中任一项所述的复合物，其中所述融合蛋白包含结构nh2‑
[napdnabp]
‑
[包含rna依赖性dna聚合酶活性的结构域]
‑
cooh；或nh2‑
[包含rna依赖性dna聚合酶活性的结构域]
‑
[napdnabp]
‑
cooh，其中每个“]
‑
[”情况表示存在任选的接头序列。50.如权利要求49所述的复合物，其中所述接头序列包含seq id no:127、165
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176、446、453和767
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769的氨基酸序列。51.如权利要求1所述的复合物，其中所述融合蛋白还包含连接所述napdnabp和所述包含rna依赖性dna聚合酶活性的结构域的接头。52.如权利要求51所述的复合物，其中所述接头序列包含seq id no:3887(1x sggs)、3888(2x sggs)、3889(3x sggs)、3890(1x xten)、3891(1x eaaak)、3892(2x eaaak)和3893
(3x eaaak)的氨基酸序列。

技术总结
本公开提供了用于对靶DNA分子(如，基因组)进行引导编辑的组合物和方法，所述引导编辑使得能够掺入核苷酸变化和/或靶向诱变。核苷酸变化可包括单核苷酸变化(如，任何转换或任何颠换)、一个或多个核苷酸插入或者一个或多个核苷酸缺失。更具体地，本公开提供了包含核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)和聚合酶(如，逆转录酶)的融合蛋白，其由经修饰的向导RNA(被称为PEgRNA)引导至特定DNA序列。PEgRNA(相对于标准向导RNA)已改变为包含延伸部分，该延伸部分提供编码单链DNA瓣的DNA合成模板序列，其与待编辑的靶向内源性DNA序列的链同源但包含期望的一个或多个核苷酸变化，并且在被聚合酶(如，逆转录酶)合成之后掺入靶DNA分子中。本文还公开了利用引导编辑的各种方法，包括治疗三核苷酸重复缩减疾病、安装靶向肽标签、通过安装保护突变来治疗朊病毒病、操纵RNA编码基因以安装用于控制RNA功能和表达的RNA标签，使用引导编辑构建复杂的基因文库，使用引导编辑将免疫表位插入蛋白，使用引导编辑将可诱导的二聚化结构域插入蛋白靶标，以及递送方法等。方法等。方法等。


技术研发人员：D.R.刘 A.V.安扎隆 P.伦道夫 J.尼尔森
受保护的技术使用者：哈佛大学的校长及成员们
技术研发日：2020.03.19
技术公布日：2022/1/4