一种小续命汤基准样品的指纹图谱的测定方法与流程

1.本发明涉及中药分析技术领域，具体涉及到一种小续命汤基准样品的指纹图谱的测定方法。


背景技术：

2.小续命汤来源于唐代医家孙思邈的《备急千金要方》，该方由麻黄、防己、人参、黄芩、桂心、甘草、芍药、川芎、杏仁各一两，附子一枚，防风一两半，生姜五两组成，治卒中风欲死，身体缓急，口目不正，舌强不能语，奄奄忽忽，神情闷乱，诸风服之皆验，不令人虚方。现代药理研究表明，小续命汤具有抗缺血性脑损伤、降血脂、抗氧化等药理作用，现代临床主要用于治疗中风及中风后遗症、类风湿性关节炎、糖尿病周围神经性病变等疾病。
[0003]“基准样品”是按照国家发布的古代经典名方关键信息及古籍记载研究、制备的样品，除成型工艺外，其余制备方法应当与国家发布的古代经典名方关键信息和古代医籍记载基本一致。成型工艺一般采用冷冻干燥、喷雾干燥等不破坏物质的方式。基准样品包含对应实物(如冻干粉)、制备工艺及质量标准，对于质量标准，倡导整体性和全面性，应当包含特征图谱和指纹图谱。
[0004]
中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。它是一种综合可量化的鉴定手段，能有效地体现中药成分的整体性和综合作用，以其快速、准确等特点被广泛运用于中药分析鉴定和质量控制等方面。
[0005]
小续命汤处方药材较多(由12味药材组成)，成分非常复杂。目前关于小续命汤的研究尚处在初级阶段，尚未见到有关小续命汤质量研究方面的系统报道。因此，开发建立一种简便易行，准确性高，重复性良好且能尽可能多地反映小续命汤所含成分的指纹图谱检测方法对于其质量控制和评价非常必要。


技术实现要素：

[0006]
针对上述不足，本发明的目的是提供一种小续命汤基准样品的指纹图谱的测定方法，该测定方法具有操作简便、稳定、精密度高和重现性好的特点，能有效地控制基准样品的质量，保证冻干粉与汤剂的物质一致性以及冻干粉的批间一致性。
[0007]
为达上述目的，本发明采取如下的技术方案：
[0008]
本发明提供一种小续命汤基准样品的指纹图谱的测定方法，包括如下步骤：
[0009]
步骤(1)：供试品溶液的制备；
[0010]
步骤(2)：采用高效液相色谱法对步骤(1)所得的供试品溶液进行测定，然后用色谱指纹图谱软件对所测得的色谱数据进行处理，即得小续命汤基准样品指纹图谱；
[0011]
其中，高效液相色谱法的色谱条件包括：
[0012]
流动相：流动相a为体积分数0.05％～0.2％磷酸水溶液，优选为体积分数0.1％磷酸水溶液；流动相b为乙腈；
[0013]
洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱的洗脱程序如下所示：
[0014]
0min时，流动相a的体积分数为95％～99％，流动相b的体积分数为1％～5％；
[0015]
55min时，流动相a的体积分数为85％～88％，流动相b的体积分数为12％～15％；
[0016]
70min时，流动相a的体积分数为85％～88％，流动相b的体积分数为12％～15％；
[0017]
75min时，流动相a的体积分数为82％～84％，流动相b的体积分数为16％～18％；
[0018]
95min时，流动相a的体积分数为78％～81％，流动相b的体积分数为19％～22％；
[0019]
110min时，流动相a的体积分数为78％～81％，流动相b的体积分数为19％～22％；
[0020]
120min时，流动相a的体积分数为72％～76％，流动相b的体积分数为24％～28％；
[0021]
140min时，流动相a的体积分数为58％～62％，流动相b的体积分数为38％～42％；
[0022]
170min时，流动相a的体积分数为38％～42％，流动相b的体积分数为58％～62％。
[0023]
进一步地，步骤(1)中供试品溶液的制备，包括以下过程：取小续命汤基准样品粉末，加入甲醇水溶液，超声提取，过滤，即得。
[0024]
进一步地，小续命汤基准样品的制备方法，包括以下步骤：
[0025]
步骤(1)：称取麻黄、防己、人参、黄芩、肉桂、甘草、白芍、川芎和燀苦杏仁各1～15g，白附片1～20g，防风5～30g，生姜15～75g，然后各自破碎为粒径1～10mm的颗粒；
[0026]
步骤(2)：先将步骤(1)中所得的麻黄颗粒置于陶瓷煎药壶中，加入1800～3000ml水，武火煎煮至沸腾，然后放入其余药材，武火煎煮至沸腾后，改用文火保持沸腾，至煎液体积为400～800ml，趁热过滤，冷却至室温，采用冷冻干燥方式，即得小续命汤基准样品。
[0027]
进一步地，步骤(1)供试品溶液的制备中甲醇水溶液的体积浓度为10％～100％。
[0028]
进一步地，步骤(1)供试品溶液的制备中超声的参数为：功率为200～400w，频率为30～50khz，时间为20～60min。
[0029]
进一步地，步骤(2)中梯度洗脱的洗脱程序如下所示：
[0030]
0min时，流动相a的体积分数为98％，流动相b的体积分数为2％；
[0031]
55min时，流动相a的体积分数为85％，流动相b的体积分数为15％；
[0032]
70min时，流动相a的体积分数为85％，流动相b的体积分数为15％；
[0033]
75min时，流动相a的体积分数为83％，流动相b的体积分数为17％；
[0034]
95min时，流动相a的体积分数为80％，流动相b的体积分数为20％；
[0035]
110min时，流动相a的体积分数为80％，流动相b的体积分数为20％；
[0036]
120min时，流动相a的体积分数为75％，流动相b的体积分数为25％；
[0037]
140min时，流动相a的体积分数为60％，流动相b的体积分数为40％；
[0038]
170min时，流动相a的体积分数为40％，流动相b的体积分数为60％。
[0039]
进一步地，步骤(2)中高效液相色谱法的色谱条件还包括：
[0040]
填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；
[0041]
色谱柱：c
18
色谱柱；优选为agilent c
18
柱，其规格为250
×
4.6mm，5μm；
[0042]
检测波长：190nm～330nm；优选为203nm；
[0043]
流速：0.6～1.2ml/min；优选为1.0ml/min；
[0044]
柱温：20～35℃；优选为25℃；
[0045]
进样量：5～20μl；优选为10ul。
[0046]
进一步地，上述小续命汤基准样品的指纹图谱的测定方法中最佳色谱检测条件
为：色谱柱为agilent c
18
柱(规格为250
×
4.6mm，5μm)；0.1％磷酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b；流速为1.0ml/min；柱温25℃；进样量10μl；检测波长为203nm；按如下梯度条件进行洗脱：
[0047][0048]
进一步地，上述小续命汤基准样品的指纹图谱的测定方法还包括：混合对照品溶液的制备，具体包括以下过程：取盐酸伪麻黄碱、芍药苷、升麻素苷、甘草苷、5
‑
o
‑
甲基维斯阿米醇苷、防己诺林碱、粉防己碱、黄芩苷和6
‑
姜辣素对照品溶于甲醇中，得到混合对照品溶液。
[0049]
进一步地，上述小续命汤基准样品的指纹图谱的测定方法还包括：采用与供试品溶液相同的高效液相色谱条件对混合对照品溶液进行检测，得到混合对照品溶液的色谱图；将混合对照品溶液的色谱图与小续命汤指纹图谱进行对比，用于指认小续命汤基准样品指纹图谱中的色谱峰。
[0050]
进一步地，上述小续命汤基准样品的指纹图谱的测定方法在上述最佳色谱检测条件所测得的小续命汤基准样品指纹图谱，以黄芩苷色谱峰为参照，小续命汤基准样品的指纹图谱包括29个共有峰，具体如下：
[0051]
1号峰，相对保留时间0.090；2号峰，相对保留时间0.135；
[0052]
3号峰，相对保留时间0.154；4号峰，相对保留时间0.186；
[0053]
5号峰，相对保留时间0.200；6号峰，相对保留时间0.267；
[0054]
7号峰，相对保留时间0.309；8号峰，相对保留时间0.336；
[0055]
9号峰，相对保留时间0.340；10号峰，相对保留时间0.444；
[0056]
11号峰，相对保留时间0.481；12号峰，相对保留时间0.527；
[0057]
13号峰，相对保留时间0.569；14号峰，相对保留时间0.608；
[0058]
15号峰，相对保留时间0.627；16号峰，相对保留时间0.766；
[0059]
17号峰，相对保留时间0.789；18号峰，相对保留时间0.889；
[0060]
19号峰，相对保留时间1.000；20号峰，相对保留时间1.132；
[0061]
21号峰，相对保留时间1.147；22号峰，相对保留时间1.172；
[0062]
23号峰，相对保留时间1.178；24号峰，相对保留时间1.206；
[0063]
25号峰，相对保留时间1.396；26号峰，相对保留时间1.407；
[0064]
27号峰，相对保留时间1.433；28号峰，相对保留时间1.526；
[0065]
29号峰，相对保留时间1.546；
[0066]
其中，5号峰为盐酸伪麻黄碱；11号峰为芍药苷；12号峰为升麻素苷；14号峰为甘草
苷；16号峰为5
‑
o
‑
甲基维斯阿米醇苷；17号峰为防己诺林碱；18号峰为粉防己碱；19号峰为黄芩苷；25号峰为6
‑
姜辣素。
[0067]
综上所述，本发明具有以下优点：
[0068]
1、本发明提供了一种小续命汤基准样品的指纹图谱的测定方法，其精密度试验、稳定性试验、重复性试验的结果表明该方法准确度高、稳定性高、重复性好。
[0069]
2、本发明建立的小续命汤基准样品的指纹图谱，克服了单一成分含量测定难以反映整体质量的缺陷，可以从整体上更全面的控制小续命汤基准样品的内在质量。
[0070]
3、采用本发明所提供的方法所建立的小续命汤基准样品的指纹图谱，具有29个有效分离的共有峰，因此，获得的指纹图谱能有效地表征小续命汤基准样品的质量。通过对15个批次的基准样品进行系统分析，能更加全面、科学评价小续命汤基准样品的质量，从而使其质量和疗效得到保证。
附图说明
[0071]
图1为本发明中不同波长色谱图；
[0072]
图2为本发明中不同洗脱系统色谱图；
[0073]
图3为本发明中不同柱温色谱图；
[0074]
图4为本发明中不同流速色谱图；
[0075]
图5为本发明中不同色谱柱色谱图；
[0076]
图6为本发明中不同提取溶剂色谱图；
[0077]
图7为本发明中混合对照品溶液色谱图；
[0078]
图8为本发明中15批小续命汤基准样品叠加色谱图；
[0079]
图9为本发明中各共有峰归属色谱图。
具体实施方式
[0080]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0081]
因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0082]
本发明实施例中，使用的仪器、试剂如下：
[0083]
仪器设备：agilent 1260高效液相色谱仪，配置四元泵、vwd检测器(美国agilent公司)；jy5002电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)；kq
‑
300b型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
[0084]
对照品、供试品及试剂：
[0085]
对照品：盐酸伪麻黄碱(171237
‑
201510，纯度99.8％)、芍药苷(110736
‑
202043，纯度95.1％)、升麻素苷(111522
‑
201913，纯度94.6％)、甘草苷(111610
‑
201908，纯度95.0％)、5
‑
o
‑
甲基维斯阿米醇苷(111523
‑
201811，纯度97.4％)、防己诺林碱(110793
‑
201807，纯度98.3％)、粉防己碱(110711
‑
201810，纯度99.6％)、黄芩苷(110715
‑
201821，纯
度95.4％)、6
‑
姜辣素(111833
‑
201806，纯度99.9％)，以上对照品均购于中国食品药品检定研究院。
[0086]
供试品：本发明用小续命汤基准样品的编号和批号分别为：s1(20210108)，s2(20210310)，s3(20210318)，s4(20210422)，s5(20210429)，s6(20210308)，s7(20210514)，s8(20210601)，s9(20210601)，s10(20210604)，s11(20210702)，s12(20210616)，s13(20210616)，s14(2021702)，s15(20210701)，均为自制。
[0087]
上述批号供试品的制备方法相同，均为：按处方量称取麻黄、防己、人参、黄芩、肉桂、甘草、白芍、川芎、燀苦杏仁各13.8g，白附片6.9g，防风20.7g，生姜69.0g，破碎为粒径约5～6mm的颗粒，先将麻黄置于陶瓷煎药壶中，加入2400ml水，武火煎煮至沸腾，将水上的细沫去掉后，放入其余11味药材，武火煎煮至沸腾后，改用文火保持微沸，至煎液体积为600ml，趁热用200目尼龙布过滤，冷却至室温，采用冷冻干燥方式，即得小续命汤基准样品。
[0088]
试剂：乙腈(色谱纯，tedia公司)，水为纯水，其余试剂均为分析纯。
[0089]
色谱指纹图谱软件处理：根据《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012a版》，由得到的色谱数据生成小续命汤基准样品指纹图谱。
[0090]
实施例1小续命汤基准样品指纹图谱条件优化
[0091]
1.色谱条件的优化
[0092]
1.1检测波长的选择
[0093]
除检测波长条件外，其它与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。通过比较不同波长下(203、210、230、254、280、290、321nm)样品的色谱图，依据色谱峰的数量、色谱峰响应值、基线是否稳定等原则，最终选择203nm作为小续命汤基准样品的指纹图谱的检测波长，结果见图1。
[0094]
1.2洗脱系统的选择
[0095]
除洗脱系统外，其它与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。分别按照以下洗脱系统进行洗脱：乙腈
‑
水、乙腈
‑
0.05％磷酸水溶液、乙腈
‑
0.1％磷酸水溶液、乙腈
‑
0.2％磷酸水溶液系统。通过比较四种洗脱系统，发现乙腈
‑
0.1％磷酸水溶液系统的各成分的分离度最理想，色谱峰最多，因此选用乙腈
‑
0.1％磷酸水溶液作为流动相洗脱系统，结果见图2。
[0096]
1.3柱温的考察
[0097]
考察柱温为25℃，30℃，35℃时对色谱行为的影响，其余条件均保持不变，结果见图3。从图3可看出，柱温为25℃时，主要色谱峰峰形较好，分离度良好。随着柱温的升高，部分色谱峰消失。综上，选择液相条件柱温为25℃时，可以获得满意的色谱峰分离效果及峰形。
[0098]
1.4流速的考察
[0099]
考察流速分别为0.8min/l，0.9min/l，1min/l，1.1min/l对色谱行为的影响，当流速为1.1min/l，色谱峰分离效果较差，而以0.8min/l，0.9min/l，1min/l为检测条件时，色谱图几乎无差异，因此选择流速1min/l为小续命汤基准样品的指纹图谱的检测条件，结果见图4。
[0100]
1.5不同色谱柱的考察
[0101]
分别考察不同色谱柱，
①
phenomenex(250
×
4.6mm，sn：413362
‑
8)
②
diamonsil(250
×
4.6mm，sn：6009150)
③
agilent(250
×
4.6mm，sn：usnh063849)，考察其对指纹图谱主
要色谱峰的分离情况，结果综合考虑，agilent色谱柱对主要色谱峰分离效果较好，结果见图5。
[0102]
综上所述，最终确立的最佳检测条件为：色谱柱为agilent c
18
柱(规格为250
×
4.6mm，5μm)；0.1％磷酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b；流速为1.0ml/min；柱温25℃；进样量10μl；检测波长为203nm；按表1梯度条件进行洗脱。
[0103]
表1梯度洗脱程序
[0104][0105]
2.供试品提取溶剂的选择
[0106]
除供试品提取溶剂不同外外，其它与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。分别用30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇、50％乙醇提取样品，通过比较不同的提取溶剂，发现50％甲醇所提取的样品所得色谱图的基线平稳，峰最多，因此选择50％甲醇为提取溶剂，结果见图6。
[0107]
实施例2小续命汤基准样品指纹图谱方法学验证
[0108]
1.精密度试验
[0109]
取s1(20210108)，称取小续命汤基准样品粉末约1.5g，加入50％甲醇25ml，在功率300w，频率40khz下超声20min溶解，冷却，摇匀，滤过，滤液过0.45um的微孔滤膜，即得供试品溶液。按实施例1中的色谱条件连续进样6针，以黄芩苷色谱峰为参照，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，并计算rsd值，结果见表2和表3。
[0110]
表2小续命汤基准样品指纹图谱精密度试验考察结果(各共有峰相对峰面积)
[0111]
[0112][0113]
表3小续命汤基准样品指纹图谱精密度试验考察结果(各共有峰相对保留时间)
[0114]
[0115][0116]
由表2和表3可知，各共有色谱峰的相对峰面积rsd％＜5％、相对保留时间rsd％＜5％，说明该方法精密度良好。
[0117]
2.稳定性试验
[0118]
取s1(20210108)，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按实施例1中的色谱条件，分别于0h、3h、6h、9h、12h、24h进样，以黄芩苷色谱峰为参照，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，并计算rsd值，结果见表4和表5。
[0119]
表4小续命汤基准样品指纹图谱稳定性试验考察结果(各共有峰相对峰面积)
[0120][0121][0122]
表5小续命汤基准样品指纹图谱稳定性试验考察结果(各共有峰相对保留时间)
[0123][0124]
由表4和表5可知，各共有色谱峰的相对峰面积rsd％＜5％、相对保留时间rsd％＜5％，说明供试品溶液在24h内基本稳定。
[0125]
3.重复性试验
[0126]
取s1(20210108)，平行称取6份，按上述供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，按实施例1中色谱条件分别进样，以黄芩苷色谱峰为参照，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，并计算rsd值，结果见表6和表7。
[0127]
表6小续命汤基准样品指纹图谱重复性试验考察结果(各共有峰相对峰面积)
[0128][0129]
表7小续命汤基准样品指纹图谱重复性试验考察结果(各共有峰相对保留时间)
[0130]
[0131][0132]
由表5和表6可知，各共有色谱峰的相对峰面积rsd％＜5％、相对保留时间rsd％＜5％，说明该方法重复性良好。
[0133]
实施例3小续命汤基准样品指纹图谱的建立
[0134]
1.供试品溶液的制备
[0135]
取15个批次的小续命汤基准样品，分别编号为s1，s2，s3，s4，s5，s6，s7，s8，s9，s10，s11，s12，s13，s14，s15，分别称取基准样品粉末1.5g，加入50％甲醇25ml，在功率300w，频率40khz下超声20min溶解，冷却，摇匀，滤过，滤液过0.45μm的微孔滤膜，即得15个批次的小续命汤基准样品供试品溶液。
[0136]
2.混合对照品溶液的制备
[0137]
精密称取盐酸伪麻黄碱、芍药苷、升麻素苷、甘草苷、5
‑
o
‑
甲基维斯阿米醇苷、防己诺林碱、粉防己碱、黄芩苷、6
‑
姜辣素标准对照品适量置于10ml容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度线，得盐酸伪麻黄碱、芍药苷、升麻素苷、甘草苷、5
‑
o
‑
甲基维斯阿米醇苷、防己诺林碱、粉防己碱、黄芩苷、6
‑
姜辣素对照品浓度分别为133.3μg/ml、191.3μg/ml、140.9μg/ml、76.16μg/ml、72.08μg/ml、66.08μg/ml、43.20μg/ml、185.8μg/ml、140.2μg/ml的混合对照品溶液。
[0138]
3.高效液相色谱条件
[0139]
色谱柱：agilent c
18
柱(规格为250
×
4.6mm，5μm)；
[0140]
检测波长：203nm；
[0141]
流速：1.0ml/min；
[0142]
柱温：25℃；
[0143]
进样量：10μl；
[0144]
流动相：0.1％磷酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b；
[0145]
洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱方式如表1所示。
[0146]
4.检测结果与分析
[0147]
分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各10ul，采用上述高效液相色谱条件
进行测试，分别得到供试品溶液和混合对照品溶液的液相色谱图。混合对照品溶液的液相色谱图如图7所示，图7中1号峰盐酸伪麻黄碱，2号峰为芍药苷，3号峰为升麻素苷，4号峰为甘草苷，5号峰为5
‑
o
‑
甲基维斯阿米醇苷，6号峰为防己诺林碱、7号峰为粉防己碱、8号峰为黄芩苷、9号峰为6
‑
姜辣素。
[0148]
将供试品溶液的液相色谱图导入指纹图谱相似度评价软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012a版》分析，以s8供试品作为对照图谱，选择“时间窗宽度”为0.5min，采用平均数法计算生成叠加色谱图，如图8所示；将15批基准样品的指纹图谱与生成的对照图谱进行相似度分析，结果如表8所示。不同批次之间的小续命汤基准样品指纹图谱与对照图谱的相似度大于0.99，说明不同批次的药材成分基本一致，且该制备工艺下制备的15批小续命汤基准样品质量稳定。
[0149]
表8 15批小续命汤基准样品指纹图谱相似度
[0150][0151]
实施例4小续命汤基准样品共有峰与药材的相关性研究
[0152]
按实施例1方法测定小续命汤中麻黄、防己、人参、黄芩、肉桂、甘草、白芍、川芎、燀苦杏仁、白附片、防风、生姜的阳性对照色谱图及阴性对照色谱图，通过vwd检测器对小续命汤指纹图谱与各药材阳性对照色谱图及阴性对照色谱图中色谱峰的紫外吸收进行分析，比较色谱峰的保留时间，最终确认小续命汤指纹图谱中共有色谱峰在药材图谱上的归属峰，见表9。
[0153]
表9共有峰在药材图谱上的归属峰
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[0155][0156]
由上述结果可知，小续命汤处方药材的主要成分基本上在本专利技术得到的指纹图谱中得到了整体表征，图9中色谱峰经对照品指认，归属为：5号峰为盐酸伪麻黄碱；11号峰为芍药苷；12号峰为升麻素苷；14号峰为甘草苷；16号峰为5
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o
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甲基维斯阿米醇苷；17号峰为防己诺林碱；18号峰为粉防己碱；19号峰为黄芩苷；25号峰为6
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姜辣素。
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显然，小续命汤基准样品指纹图谱中的29个共有峰，在麻黄、防己、人参、黄芩、肉桂、甘草、白芍、川芎、燀苦杏仁、防风、生姜11味药材阳性对照色谱图中基本找到明确归属。由此可见，小续命汤基准样品的指纹图谱基本能代表小续命汤基准样品的整体和内在质量。
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以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本领域的技术人员不经创造性劳动即对所描述的具体实施例做的修改或补充或采用类似的方式替代仍属本专利的保护范围。