一种肺纤维化恒河猴模型的建立方法与流程

1.本发明属于动物模型领域，具体涉及一种肺纤维化恒河猴模型的建立方法。


背景技术：

2.肺纤维化一般指在毒物、自发免疫反应、药物副反应、感染、严重外伤等不同因素刺激下引起肺部炎症反应，以肺泡表面上皮细胞损伤，炎性细胞累积，成纤维细胞增生，细胞外基质沉积和疤痕形成为主要特征，最终导致正常肺组织结构改变、功能丧失的一类疾病。肺纤维化通常分为两种，一种为特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，ipf)，ipf是病因不明的纤维化，其发病过程表现出进行性与不可逆性，最终导致患者呼吸系统衰竭而死亡；另一种是继发性肺纤维化(secondary pulmonary fibrosis，spf)，spf的常见病因为干燥综合征、多发性肌炎、类风湿性关节炎和系统性硬化症等。由于肺纤维化发病率升高，发病机制不明确，缺乏有效的药物，病死率高，因此建立稳定而可靠的肺纤维化动物模型是探索其发病机制和开发有效治疗药物的重要保障。
3.小鼠气管滴注单次剂量的博莱霉素诱发肺纤维化(single bleomycin，sblm)是目前最常见的制备肺纤维化模型的实验方法，虽然这个方法具有成模率高、操作简单等优势，但是存在明显的局限性。该模型的疾病发展时间与ipf患者不同，并且sblm模型在21天后，小鼠的肺纤维化表型就会开始逐渐减弱，不符合临床表现。对比sblm模型，多次博莱霉素滴注诱导的小鼠肺纤维化模型(multiple bleomycin，mblm)采用低剂量反复损伤的形式来进行造模，但是模型的稳定性受限，药物分布不均匀，病变主要分布在肺门和支气管周围，模型的使用受限。此外，由于啮齿类在进化关系上与人类相距甚远，以其为研究对象所获得的实验数据对临床指导意义不大。
4.与啮齿类动物不同，恒河猴的解剖特点、各系统生理功能及对疾病和治疗药物的反应性与人类极为相近，是进行免疫学相关治疗和干细胞移植临床前有效性和安全性评价的敏感动物。申请号为201710714062.2的中国专利申请公开了一种恒河猴肺纤维化模型的造模方法，包括如下步骤：s1、向恒河猴皮下注射百草枯溶液，并向恒河猴气管滴注博来霉素溶液；s2、生成恒河猴肺纤维化模型，其中百草枯注射剂量为10mg/kg/次，每周1次，共注射2次；博来霉素的使用剂量为1mg/kg/次，每周1次，共使用2次。该方同时采用了百草枯和博来霉素两种药物进行建模，给药次数较多，造模方法复杂，且气管给药会造成局部损伤，和患者临床表现不一致，无法用于肺纤维化治疗药物的疗效和安全性评价。因此，提供一种各项生化指标以及疾病过程和转归与人高度类似的肺纤维化动物模型对肺纤维化治疗药物的疗效和安全性评价具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种肺纤维化恒河猴模型的建立方法。
6.本发明提供了一种建立肺纤维化动物模型的方法，所述方法包括以下步骤：对动物施用百草枯，施用剂量为20
‑
35mg/kg；所述动物为非人灵长类动物。
7.进一步地，所述施用剂量为25mg/kg。
8.进一步地，所述施用方式为口服。
9.进一步地，所述口服为一次口服。
10.进一步地，所述非人灵长类动物为恒河猴。
11.进一步地，所述肺纤维化为继发性肺纤维化。
12.进一步地，所述方法包括以下步骤：动物禁食一天后，对动物施用百草枯，然后正常饲喂4周以上，得到肺纤维化动物模型。
13.进一步地，所述正常饲喂的时间为4～12周。
14.本发明还提供了上述方法构建的肺纤维化动物模型在评价预防和/或治疗肺纤维化的药物的疗效和/或安全性中的用途。
15.进一步地，所述药物为干细胞制剂。
[0016]“正常饲喂”指按需喂食动物不含药物的食物，并让其按需自由饮水。
[0017]
百草枯(1,1'
‑
二甲基
‑
4,4
’‑
二氯二吡啶，paraquat，简称pq)是一种季胺类高效能除草剂。pq经消化道、皮肤黏膜及呼吸道等途径进入体内，可特异性的富集到肺，避免气管给药导致的额外的损伤，且病变区域均匀分布，不会与博莱霉素诱发肺纤维化一样，造成肺损伤分布不均而导致模型的不稳定。
[0018]
本发明通过研究发现，对恒河猴施用百草枯很难制备得到继发性肺纤维化模型，当施用剂量过低(<25mg/kg)，则最终使恒河猴肺部出现炎症浸润而非继发性肺纤维化；当剂量过高(40
‑
80mg)，则令恒河猴出现急性肺损伤的症状，不符合建模要求。
[0019]
本发明通过特定的百草枯口服剂量，成功构建得到了继发性肺纤维化恒河猴模型，恒河猴在给药后4周出现典型的继发性肺纤维化症状，例如ct纹理紊乱，左胸膜下改变，肺叶间裂增厚，肺纤维化，胸膜下渗出等。
[0020]
利用本发明的方法构建的继发性肺纤维化动物模型具有制作简单、单次给药、给药方式不会造成局部损伤、肺纤维化明显等优点，动物模型各项生化指标以及疾病过程和转归高度类似人继发性肺纤维化的相应改变。动物模型在此期间存活，提供了足够长的治疗空窗期，可用于啮齿类动物模型无法完成的各种继发性肺纤维化治疗药物的疗效和安全性评价，应用前景广阔。
[0021]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0022]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0023]
图1.pq诱导恒河猴继发性纤维化过程中血液中pq浓度，氧饱和，血钾浓度和白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数量。
[0024]
图2.pq诱导恒河猴继发性纤维化过程中肝功、肾功以及心肌酶谱的变化。
[0025]
图3.pq诱导恒河猴继发性纤维化过程中肺穿刺组织的he、masson、天狼星红染色以及cd68、f4/80和mac387免疫组化检测。
[0026]
图4.模型早期纤支镜灌洗液中白细胞、中性粒细胞以及淋巴细胞数量和肝功、肾功以及心肌酶谱的变化。
[0027]
图5.模型早期纤支镜取检组织的he、masson、天狼星红染色以及cd68、f4/80和mac387免疫组化检测。
[0028]
图6.各时间点恒河猴的肺ct扫描结果。
具体实施方式
[0029]
实施例1继发性肺纤维化动物模型的制备方法
[0030]
1、材料与方法：
[0031]
1.1实验材料
[0032]
3～4岁雌性和雄性恒河猴3只，无b疱疹病毒、猴逆转录病毒、猴白血病病毒和免疫缺陷病毒感染；购自成都平安动物繁育基地。
[0033]
1.2主要试剂
[0034]
百草枯(简称pq)，购自上海农药研究所；
[0035]
其他药品和耗材均购自华西医院利康药房。
[0036]
1.3主要溶液的配制
[0037]
溶液的配制：
[0038]
取原装1g/支百草枯粉剂，加入1ml生理盐水溶解，作为储存液，4℃短期存放。根据猴体重，按照25mg/kg体重，将pq溶液掺入猴的食物中。
[0039]
1.4主要仪器
[0040]
1)全自动生化分析仪。
[0041]
2)ct：philips brilliance 64排/16排。
[0042]
3)石蜡切片机：leica。
[0043]
1.5实验方法
[0044]
1.5.1恒河猴肝功能、肾功能生化指标，心肌酶谱，血淀粉酶指标测定
[0045]
通过测定上述指标，评价肝、肾、心及胰腺是否存在预存病变，并获得试验前动物基础值。
[0046]
1)动物禁食10
‑
12h，不禁水；
[0047]
2)根据动物实际体重，恒河猴通过肌肉内施用zoletil 50(10mg/kg体重，virbac，france)麻醉；
[0048]
3)待动物麻醉后，准确称量体重，并记录；
[0049]
4)将恒河猴上下肢固定于手术台上，下肢小腿后侧备皮暴露大隐静脉，碘氟消毒；
[0050]
5)静脉采血针采集全血3ml(分别做肝功能、肾功能、血常规、心肌酶谱、血糖和胰淀粉酶测定，并标记为0h)。股动脉采血检测氧饱和度。
[0051]
1.5.2恒河猴胸腔、腹腔主要脏器影像学参数
[0052]
通过ct、经纤支镜肺泡灌洗诊疗术，评价心、肺、肝、肾、胰腺等主要脏器是否有预存病变，并获得试验前动物基础值。
[0053]
1)动物麻醉操作同上。
[0054]
2)腹部备皮。
[0055]
3)分别采用philips brilliance 64排/16排ct进行全身扫描，获取全身主要脏器影像学参数。
[0056]
4)图像采集完毕，待动物完全苏醒，送回笼内。
[0057]
1.5.3恒河猴肺部穿刺活检
[0058]
1)动物麻醉操作同上。
[0059]
2)上腹部以艾力克纱布对以进针点为中心向周围至少15cm皮肤无遗漏地涂擦。待艾力克涂液自然干燥后，再用70％酒精棉球将艾力克擦去。铺巾。
[0060]
3)标记体表最佳穿刺点，作局部浸润麻醉。注意麻醉应达胸膜层。
[0061]
4)用粗针头破皮，选用特制不带针芯细针，连接30ml特制注射器，在ct引导下迅速刺达病灶。迅即负压抽吸下将穿刺针在病灶内旋转或作来回0.5～1cm刺戳提插动作，以期松动组织取得更多标本，负压抽吸后减压拔针。以注射器针筒内没有血液为好。收集标本，以备后续使用。
[0062]
5)妥善处理创口。再次ct扫描，确定无明显胸腔积气或积液。
[0063]
6)分别对获取的肺组织部分进行石蜡包埋切片。石蜡包埋切片用于he染色，获取组织学参数。
[0064]
7)活检完毕，待动物完全苏醒，送回笼内。
[0065]
1.5.4百草枯喂食恒河猴过程
[0066]
1)按照25mg/kg的给药剂量，将pq溶液掺入猴的食物中制作成喂养恒河猴的食物，双锁双人保管，存放于4℃。
[0067]
2)提前一天将恒河猴禁食，自由饮水。
[0068]
3)实验当天早上8：00，恒河猴喂食含药物pq的食物。此过程应全程观测，确定含药食物全部摄入。之后恒河猴按需喂食不含药物的食物，并按需自由饮水。
[0069]
4)密切观察动物生命体征。
[0070]
1.5.5恒河猴ipf过程的动态观测
[0071]
1)分别于给药后每12h进行静脉采血，检测血液细胞分类指标。
[0072]
2)观察恒河猴生命体征、行为异常表现。
[0073]
3)动物染毒后0h、12h、36h、60h、1w、2w、3w、4w、8w、12w等时间点进行ct扫描并在ct引导下进行肺组织穿刺活检。h表示小时，w表示周。
[0074]
2、实验结果
[0075]
2.1百草枯导致炎症细胞渗出从而诱导ipf的发生
[0076]
口服25mg/kg的恒河猴出现精神萎靡、活动力下降、呕吐、胃胀气等生理现象。血液中pq的浓度在12h最高(170.83ng/ml)，并逐渐降低，48h后血液中检测不到pq的具体浓度。氧饱和在60h时偏离正常值后恢复，血钾仅有轻微的升高(图1)。血液分类检测显示喂食百草枯后，白细胞和中性粒细胞在3w内出现明显的升高，淋巴细胞降低。4w后基本恢复正常(图2)。肝功和心肌酶谱有异常升高的现象，肾功未出现较大波动。在建模过程中血压无明显变化(图2)。
[0077]
2.2肺穿刺组织样本病理染色结果
[0078]
如图3所示，在口服pq后的1w内的肺穿刺组织he染色显示有肺泡细胞轻微肿胀，细胞层数增加；masson及天狼星红染色显示12
‑
36h时大量胶原纤维出现，随后被吸收，在4w后
纤维化稳定出现；cd68、f4/80、mac387是炎症细胞指标，免疫组化结果显示12h
‑
36h有明显的炎症细胞浸润，急性期结束后，4w再次出现明显的炎症浸润。
[0079]
2.3经纤支镜取活检检测早期局部肺损伤情况
[0080]
检测肺泡灌洗液中pq浓度在12h也是最高，36h后无法检测。血液分类检测显示白细胞和中性粒细胞在12内出现明显的升高，淋巴细胞降低。肝功、心肌酶谱和肾功在36h最高(图4)。如图5所示，36
‑
60h肺泡细胞轻微肿胀，胶原渗出，肺部炎症浸润严重。
[0081]
2.4恒河猴影像学检查结果
[0082]
如图6所示，12h出现上腹部膨隆，ct扫描出现右侧气胸，纵隔气肿，双肺渗出性改变。纤支镜下可看到明显的黄痰，灌洗液浑浊。36h后出现左上肺渗出，充盈尿液，右肺不张，肺血迹，胃胀气，右下叶背端有痰。4w后肺部纹理紊乱，左胸膜下改变，肺叶间裂增厚，出现明显的纤维化。在后期的随访中持续出现纤维化的表现。
[0083]
根据上述结果可以看出，在给药后4w后ct和病理等结果显示恒河猴持续出现肺部纹理紊乱，胸膜下改变，肺叶间裂增厚，masson及天狼星红染色确定胶原沉积，这些表现均是继发性肺纤维化的典型症状，表明给药4w后，成功制备了继发性肺纤维化恒河猴模型。在给药后1
‑
4w区间内，ct未出现明显纤维化，是可进行治疗的窗口期。
[0084]
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
[0085]
实验例1构建继发性肺纤维化动物模型的剂量筛选实验
[0086]
1、按照实施例1的模型构建方法，区别仅在于将“1.5.4百草枯喂食恒河猴过程”中的给药剂量由25mg/kg升高至40
‑
80mg/kg。发现最终令恒河猴出现急性肺损伤的症状，不符合建模要求。
[0087]
也就是说，利用实施例1的建模方法，当口服给药剂量升高至40
‑
80mg/kg时无法成功建立继发性肺纤维化恒河猴模型。
[0088]
2、按照实施例1的模型构建方法，区别仅在于将“1.5.4百草枯喂食恒河猴过程”中的给药剂量由25mg/kg降低至10mg/kg，发现最终使恒河猴肺部出现炎症浸润而非继发性肺纤维化，不符合建模要求。
[0089]
结合实施例1实验结果表明，本发明通过特定的百草枯施用剂量，成功构建了继发性肺纤维化恒河猴模型。
[0090]
综上，本发明提供了一种构建继发性肺纤维化动物模型的方法。本发明构建的继发性肺纤维化动物模型具有制作简单、单次给药、给药方式不会造成局部损伤、肺纤维化明显等优点，模型各项生化指标以及疾病过程和转归高度类似人继发性肺纤维化的相应改变。从给药到动物死亡具有足够长的治疗空窗期，可以用于啮齿类动物模型无法完成的生物技术新药(包括干细胞制剂)的疗效和安全性评价。