紫云英苷在肌肉氧化损伤修复中的应用的制作方法

1.本发明属于肌肉修复技术领域，具体涉及一种紫云英苷在肌肉氧化损伤修复中的应用，即紫云英苷在50
‑
200mg/kg范围内可修复急性力竭运动造成的小鼠肌肉损伤。


背景技术：

2.紫云英苷(ag)又被称作黄芪苷，是一种重要的黄酮类物质，是百蕊草、杜仲、荷叶等植物中草药的有效成分，可通过乙醇提取法、化学方法等从百蕊草和商洛连翘果实中提取出紫云英苷
[1][2]
。研究结果表明，紫云英苷具有抗炎、抗氧化、抗过敏性皮炎、调节机体免疫力、保护神经和心脏等多种药理作用
[4]
。
[0003]
规律的进行适度的体育锻炼对身体健康有诸多好处，例如减少心血管疾病的发生，降低患上癌症和糖尿病的风险
[23]
。但是，剧烈运动会引起肌肉组织损伤
[24]
，是由于细胞产生的活性氧(ros)超出了机体自身抗氧化系统的清除能力，导致机体内氧化与抗氧化作用失衡。ros的存在能够导致细胞发生氧化应激反应(os)，包括与dna、脂类和蛋白质全部都能发生反应
[24]
。力竭运动引起的组织损伤或炎症可称为短期氧化应激，但抗氧化剂反应不足可能无法逆转过度产生的自由基的毒性作用
[25]
。在体育锻炼过程中，肌肉系统的能量需求使氧气消耗量增加到其余系统所需氧气消耗量的10
‑
20倍
[26]
，这会导致ros在肌肉纤维中的积累量大量增加。此外，研究显示由于乳酸的存在而导致体温升高和血液中ph值降低，这一系列相关物质的存在会加速ros的产生，从而增加os
[27]
。另外，有人提出，在训练过程中源自与高铁血红蛋白和过氧化物相互作用的受损肌肉纤维的肌红蛋白的增加也参与了ros的产生
[26]
。当清除不彻底时，会诱导酶促内源性抗氧化系统的激活，该酶调节gpx、gr和cat等酶以及非酶促(eas)，包括gsh和α硫辛酸等。急性训练以及慢性训练显示出对os的不同反应。研究表明单剂量的抗氧化补充剂可以提高训练有素的运动员的耐力
[27]
。因此，食用抗氧化剂对于运动员和未经训练的个人都是重要的，以防止运动引起的氧化应激，组织损伤和运动能力的极限下降。
[0004]
定期且适当的进行一些适度的体育锻炼对人们的身体健康有很多好处，例如减少心血管疾病的发生，患上癌症和糖尿病的风险。但是，剧烈运动会引起肌肉和组织损伤，其中细胞中的ros产生量超过了内源性抗氧化剂防御系统的能力。力竭运动引起的组织损伤或炎症可称为短期氧化应激，但抗氧化剂反应不足可能无法逆转过度产生的自由基的毒性作用。紫云英苷又被称作为百蕊草素ii，具有多种有效的作用，可以作为药物投入使用，目前已成为研究热点，但是对于肌细胞氧化损伤修复作用尚未有人研究。


技术实现要素：

[0005]
针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种紫云英苷在肌肉氧化损伤修复中的应用。紫云英苷是一种天然存在的具有多种生物活性的黄酮类化合物，具体以急性运动造成肌肉损伤的小鼠为研究对象，探讨紫云英苷对肌肉损伤小鼠氧化损伤的修复作用，进一步研究紫云英苷在肌肉氧化损伤的修复及调控机制。
[0006]
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
[0007]
本发明的目的之一，提供了紫云英苷在肌肉氧化损伤修复中的应用。
[0008]
进一步地，50
‑
200mg/kg紫云英苷未对肝脏造成损伤，且能增强力竭运动后小鼠肌肉组织抗氧化功能。
[0009]
本发明的目的之二，提供了紫云英苷在降低力竭运动对肝脏损伤中的应用。
[0010]
进一步地，紫云英苷降低谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)和碱性磷酸酶(akp)的活性。
[0011]
本发明的目的之三，提供了紫云英苷在增强力竭运动对抗氧化功能中的应用。
[0012]
进一步地，紫云英苷增强羟基自由基的清除能力、超氧阴离子的清除能力。
[0013]
进一步地，紫云英苷提高gsh
‑
px活性、gr酶活性、sod酶活性、gsh酶活性。
[0014]
本发明的目的之四，提供了紫云英苷在上调nrf2及其下游基因mrna表达中的应用。
[0015]
本发明的目的之五，提供了紫云英苷在上调nrf2及其下游基因蛋白表达中的应用。
[0016]
进一步地，下游基因选自gclc、gclm、ho
‑
1、nqo
‑
1、sod1和sod2中的一种以上。
[0017]
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
[0018]
本发明的紫云英苷可降低力竭运动引起的机体肝损伤，并可增强机体的抗氧化能力。灌胃紫云英苷后nrf2 mrna和蛋白的表达水平均升高，因此紫云英苷通过nrf2调控肌肉收缩过程中的氧化应激水平，即采用紫云英苷，可促进nrf2调控gclm、gclc、nqo
‑
1、ho
‑
1、sod1和sod2基因的表达来上调机体的抗氧化能力。故本发明的紫云英苷具有抗氧化活性且可部分修复小鼠力竭运动后的氧化损伤。
附图说明
[0019]
图1为本发明的紫云英苷对小鼠肝损伤的影响示意图。
[0020]
图2为本发明的不同运动时间对小鼠体内产生超氧阴离子含量的影响图。
[0021]
图3为本发明小鼠运动前后形态变化图(图a：ex前；图b：ex后)。
[0022]
图4为本发明紫云英苷减轻小鼠运动损伤后肝脏的损伤图。
[0023]
图5为本发明紫云英苷对运动损伤后小鼠肌肉内
·
oh清除能力的影响图。
[0024]
图6为本发明紫云英苷对运动损伤后小鼠肌肉内o2‑
清除能力的影响图。
[0025]
图7为本发明紫云英苷对运动损伤后小鼠肌肉内gsh
‑
px酶活力的影响图。
[0026]
图8为本发明紫云英苷对运动损伤后小鼠肌肉内gr酶活力的影响图。
[0027]
图9为本发明紫云英苷对运动损伤后小鼠肌肉内gsh含量的影响图。
[0028]
图10为本发明紫云英苷对运动损伤后小鼠肌肉内sod酶活力的影响图。
[0029]
图11为本发明检测不同处理组小鼠肌肉nrf2及下游基因基因mrna表达图。
[0030]
图12为本发明检测不同处理组小鼠肌肉nrf2及下游基因蛋白表达图。
[0031]
图13为本发明紫云英苷修复机体受氧化损伤的途径示意图。
具体实施方式
[0032]
本发明提供了一种紫云英苷在肌肉氧化损伤修复中的应用。本发明通过力竭运动
制备小鼠肌肉损伤模型，酶化学法检测不同运动时间导致小鼠体内超氧阴离子(o2‑
)的含量，灌胃紫云英苷后检测是否出现肝损伤，通过酶化学法检测肌肉组织中
·
oh、o2‑
、gsh的含量，sod、gsh
‑
px和gr的酶活性，综合分析紫云英苷对肌肉组织氧化损伤的修复作用。
[0033]
紫云英苷，又称为山奈酚
‑3‑
o
‑
葡萄糖苷，相对分子质量为mr.448.38，分子式为c
21
h
20
o
11
，分子结构式如下所示。常温下呈现黄色针晶状，熔点在218
‑
220℃之间，沸点为823.2℃，不溶于水，易溶于有机溶剂中，如二甲亚砜(dmso)、甲醇和乙醇等。
[0034][0035]
1.紫云英苷药理作用
[0036]
(1)紫云英苷的抗氧化作用
[0037]
自由基的过量产生可能会影响人体中抗氧化剂和抗氧化剂系统的平衡，从而导致各种病理状况，如动脉高血压、风湿病、炎症、糖尿病、癌症、神经退行性疾病和基因突变。然而抗氧化剂可以充当生物系统中的自由基清除剂和螯合剂
[6]
。目前，具有抗氧化特性的天然植物已被认为具有巨大的潜力，不仅可以减少疾病的发生，还能起到保护机体的作用。因此，具有抗氧化特性的天然植物中成分的开发和利用已成为研究的热点。
[0038]
迄今为止黄酮类化合物被作为抗氧化剂广泛地应用在生物体上，它能够非常有效地清除机体内的活性氧自由基，并且和过氧自由基协同作用来终止不饱和脂肪酸自氧化过程中的自由基链反应
[7]
，从而能够保护细胞膜不受损害。紫云英苷是一种黄酮类物质，通过高效液相色谱紫外检测(hplc
‑
uv)发现紫云英苷与dna结合是通过与g
‑
c碱基对的相互作用发生的，可能是通过氢键形成稳定的嵌入作用
[8]
。同时紫云英苷对ccl4引起的抗溶血作用和肝毒作用具有抵抗力
[9]
。由水过氧自由基aaph诱导的正常人红细胞氧化溶血作用能够被紫云英苷通过延长时间和增加剂量互相依赖的方式抑制其氧化溶血作用。紫云英苷还可防止红细胞中囊溶胶型抗氧化剂谷胱甘肽的耗竭
[3]
。对红细胞中胞浆抗氧化剂谷胱甘肽(gsh)的消耗起保护作用
[5]
。对h2o2诱导的活性氧产生抑制作用，显著降低了h2o2诱导的hek
‑
293细胞中的活性氧产生
[10]
。紫云英苷被证明对sprague dawley大鼠急性i/r损伤有效，可通过减少细胞内的氧化应激和凋亡发挥其作用。表现为mda、tnf
‑
α、il
‑
6、ros和bax的表达降低，以及gsh/gssg的比例增加
[11]
。
[0039]
(2)紫云英苷的抗炎作用
[0040]
炎症是身体对由病原体和有毒刺激(例如物理或化学损伤)引起的组织损伤的直接反应。尽管炎症反应是一种防御机制，但如果持续存在，则会导致多种病理学疾病，例如
癌症、过敏、动脉粥样硬化和自身免疫性疾病
[12]
。研究表明紫云英苷具有抗炎活性，可通过降低过氧化物酶和脂联素的活性，减轻脂多糖(lps)诱导的乳腺炎小鼠模型和肺损伤模型的炎症。也能通过抑制lps诱导的nf
‑
κb活化而减轻ik
‑
bα的恶化并限制nf
‑
κb的核易位，从而进一步发挥紫云英苷的抗炎作用
[13]
。另一项相关的研究结果显示，巨噬细胞被lps刺激后，可以通过紫云英苷抑制nf
‑
κb信号通路的活化从而去抑制细胞中一些相关促炎性介质的表达
[4]
。同时，在小鼠钩端螺旋体诱导的子宫和上皮炎症中，紫云英苷可以阻止mapk和nf
‑
κb通路
[14,15]
。在牙周病原体诱导的牙周炎中，具有抑制前列腺素e2(pge2)产生的能力
[16]
。可以有效降低肺组织中的嗜酸性粒细胞数量，并可抑制卵清蛋白诱导的嗜酸性粒细胞增多
[17]
。可抑制lps刺激的raw 264.7细胞中pge2的活性，并下调细胞亚硝酸盐和il
‑
6的产生
[18]
。在卵清蛋白诱导的炎性小鼠模型中，紫云英苷治疗可抑制肺泡破坏，变应性炎症和气道增厚
[17]
。
[0041]
(3)紫云英苷的免疫调节作用
[0042]
紫云英苷是一种治疗身体疾病的有效成分，能够增强机体的免疫能力。对人外周血nk细胞添加适当浓度的紫云英苷(5μg
‑
0.05μg/ml)发现对其活性具有显著的促进作用，它的作用强度与人体的免疫水平有关
[19]
。而且能够减少末梢血液中由对抗环磷酰胺、60coγ射线引起的白细胞增多，同时还可抑制小鼠外周血淋巴细胞增多和显著提高小鼠遭受如高温、寒冷时的外界刺激时的忍受力
[20]
；并且能够清楚地表现出抑制因为缺氧引起的肺动脉平滑肌细胞的增殖和胶原蛋白的产生和释放
[21]
；并能够提高巨噬细胞的吞噬能力
[22]
。
[0043]
2.抗氧化酶系
[0044]
机体能够发挥正常作用至关重要的因素是由于ros的稳态，目前研究已知多种类型具有重大影响的抗氧化系统存在机体内。一类是抗氧化酶类，包括sod、cat、gpx、甘肽还原酶gr以及还原型辅酶ii nadph等。其中过氧化氢酶cat在保护细胞免受过氧化氢的毒性作用中起关键作用。细胞合成重要的还原剂谷胱甘肽(gsh)以及硫氧还原蛋白thioredoxin(txn)均离不开nadph
[28]
，研究发现nadph的合成受到干扰将会影响到细胞分裂和线粒体膜的通透性，增强细胞对氧化应激反应的敏感性并可引起细胞凋亡
[29]
。超氧化物歧化酶sod是一种普遍存在的抗氧化酶，可将超氧化物自由基歧化为过氧化氢(h2o2)
[30]
。gsh
‑
px是存在细胞内的分解酶，属于抗氧化酶系的其中之一，能够加快h2o2与gsh反应生成h2o和氧化性的gssg的速率，紧接着谷胱甘肽(gr)将gssg转换回gsh。谷胱甘肽
‑
s转移酶通过巯基催化gsh与各种底物的亲电子结合，从而降低了过氧化物的含量
[31]
。细胞、组织和细胞外基质暴露在有害的反应性物种会导致反应级联，并诱发多种内部防御机制(酶促或非酶促)的激活，从而可去除反应性物质及其衍生物。非酶抗氧化剂以迅速使自由基和氧化剂失活的能力为特征的分子代表。这些非酶类的抗氧化剂对维持细胞内部的氧化还原平衡也发挥极其重要的作用
[32]
。例如内源性非酶抗氧化剂包括金属结合蛋白(mbps)、谷胱甘肽(gsh)、尿酸(ua)、胆红素(bil)和多胺(pas)。抗氧化分子gsh是存在机体内最充足的一类非酶类物质，其存在对于维持机体的氧化还原平衡反应至关重要
[33]
。还原型gsh是细胞内主要的低分子量硫醇，gsh在氧化组织损伤时充当亲核清除剂和酶催化的抗氧化剂。因此，gsh作为生物结构和功能的保护者具有重要作用
[34]
。机体内还存在很多能够调控细胞内氧化还原反应之间动态平衡的调控因子，包括nrf2、p53等在内的多种调控因子均能调控细胞的氧化还原平衡
[35]
。在这些调节因子中，氧化应激反应中nrf2是其中功能最强的
[36]
，nrf2对机体中许多
重要的抗氧化途径具有调节作用。
[0045]
3.nrf2活性在氧化还原平衡调控中的作用机制
[0046]
核因子e2相关因子2(nrf2)是一种强大的核转录因子，可协调因os的增加而刺激的抗氧化剂细胞保护系统复合物。nrf2可促进gclm(modified subunit)与gclc(catalytic subunit)在细胞内的表达，nrf2可以直接控制gsh合成的原因是因为gcl是催化谷氨酸与半胱氨酸反应生成gsh的限速酶
[37]
。同时，nrf2也能间接控制细胞内gsh的合成，gsh由抗氧化酶催化合成gssg并降低细胞内ros水平，但gssg又可由nadph催化合成为gsh。因此，nrf2可以通过干预nadph的生产水平来间接调节gsh的产生。“芬顿反应”是有机体内清除ros的重要化学反应，fe
2
参与细胞内重要的“芬顿反应”：fe
2
h2o2→
fe
3

‑
oh ho
·
。nrf2的存在可以加快hmox1基因表达的速率
[38]
，因此nrf2不仅能控制血红素分解产生fe
2
，而且能够间接促进细胞发生“芬顿反应”，同时又能够将fe
3
大量积累起来，因此能够具有更高的效率可以清除细胞内过量的ros。所以nrf2在集体的氧化还原反应平衡中是最重要的调节因子。
[0047]
因此，本发明以力竭运动小鼠为研究对象，探讨紫云英苷对力竭运动小鼠肌肉损伤的修复作用，分析其作用机制，为紫云英苷的开发应用奠定基础。
[0048]
力竭运动可引起组织损伤或炎症，产生过度的自由基，从而导致一定的毒性作用，自由基的攻击会对细胞造成持续的损伤，从而导致身体开始产生氧化应激。研究表明，紫云英苷具有多种药性功能，能治疗身体产生的一些疾病，如机体在发生氧化应激反应时协同机体内的氧化应激信号通路来发挥抗氧化作用和调节机体细胞免疫功能。本发明研究紫云英苷对力竭运动后小鼠体内的氧化损伤的修复作用。
[0049]
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明。下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0050]
实施例1：
[0051]
实验材料
[0052]
1.实验动物
[0053]
spf级c57bl/6j(9周龄)雄性小鼠购自长春生物技术有限公司。
[0054]
2.实验试剂胎牛血清购自biological industries公司，dmem干粉购自gibco公司，维生素e购自北京索莱宝科技有限公司，sod、gsh、gr、gsh
‑
px、ncr
‑
细胞色素c还原酶、羟基自由基和超氧阴离子检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，mtt法细胞活力检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所，紫云英苷购自上海源叶生物科技有限公司。
[0055]
紫云英苷母液配制
[0056]
取10μl的dmso溶解在10ml生理盐水中，然后取500μl、0.1％dmso溶解50mg紫云英苷制成浓度为5mg/ml的悬液，用于灌胃小鼠。
[0057]
3.实验仪器
[0058]
spark 10m酶标仪(瑞士帝肯)，倒置荧光显微镜(日本olympus)，二氧化碳培养箱(美国thermo electron)，荧光定量pcr仪(美国eppendorf)，odyssey双红外激光成像系统(美国li
‑
cor)。
[0059]
4.实验方法
[0060]
实验组小鼠运动方案
[0061]
将六只spf级c57bl/6j(9周龄)雄性小鼠放在一个笼子中(27
×
17
×
13cm)，实验程序遵循齐齐哈尔大学科技伦理委员会的《动物实验福利伦理审查指南》。随后，将小鼠随机分为4组：dmso组，运动(ex)，ex ag 50mg/kg组和ex ag 100mg/kg(n＝6)。所有小鼠在实验前一周都熟悉了游泳运动训练。ag和ex ag组的小鼠在力竭运动后灌胃ag(100mg/kg和50mg/kg体重)，作用1h后处死小鼠，以便有足够的时间在药物半衰期结束前出现潜在的效应。dmso和ex组的小鼠在与其他组相同的时间喂水，ex和ex ag组的小鼠在游泳过程直至筋疲力尽后补充ag或补充水1h后，腹动脉采集血样，4℃、5000r/min离心5min获得血清，同时迅速切除肝脏和腓肠肌并在液氮中冷冻。所有组织和血浆样品均在
‑
80℃下保存直至分析。
[0062]
实施例2：
[0063]
紫云英苷对小鼠肝功能的影响
[0064]
1.谷丙转氨酶(alt)的测定
[0065]
(1)灌胃紫云英苷1h后，处死小鼠，腹动脉取血，置于冰上；
[0066]
(2)如表1设置实验体系。
[0067]
表1 alt实验体系
[0068][0069]
将96孔板混匀细胞，室温静置培养15min，使用酶标仪波长为510nm处测定各孔的od值，绝对od值＝测定孔的od值
‑
对照孔od值，根据标准曲线求得该样品的ast单位活力。
[0070]
2.谷草转氨酶(ast)的测定
[0071]
(1)灌胃紫云英苷1h后，处死小鼠，腹动脉取血，置于冰上；
[0072]
(2)如表2设置实验体系。
[0073]
表2 ast实验体系
[0074]
[0075][0076]
3.碱性磷酸酶(akp)的测定
[0077]
(1)灌胃紫云英苷1h后，处死小鼠，腹动脉取血，置于冰上；
[0078]
(2)如表3设置实验体系。
[0079]
表3 akp实验体系
[0080][0081]
将96孔板混匀以画八字的形式，波长520nm，酶标仪测定各孔吸光度od值。
[0082]
实施例3：
[0083]
紫云英苷对小鼠抗氧化功能的影响
[0084]
1.羟基自由基(
·
oh)的测定
[0085]
(1)10％匀浆液的制备：
[0086]
根据重量与体积为1：9的比例将该组织进行准确称取，加入9倍生理盐水，制备成组织匀浆，离心2500r/min、10min，吸上清，弃沉淀，待测。
[0087]
(2)如表4设置实验体系
[0088]
表4 ·
oh实验体系
[0089][0090]
混匀后，室温静置20min，波长为550nm，1cm光径，蒸馏水调零，测定各管吸光度值。
[0091]
(3)计算公式：
[0092][0093]
2.超氧阴离子(o2‑
)的测定
[0094]
(1)10％匀浆液的制备同1的
·
oh的测定；
[0095]
(2)如表5设置实验体系。
[0096]
表5 o2‑
实验体系
[0097][0098]
混匀后，室温静置10min，波长为550nm，1cm光径，蒸馏水调零，测定各管吸光度值。
[0099]
(3)计算公式：
[0100][0101]
3.超氧化物歧化酶(sod)的测定
[0102]
(1)10％匀浆液的制备同1的
·
oh的测定；
[0103]
(2)如表6设置实验体系。
[0104]
表6 sod实验体系
[0105][0106]
每孔240μl转移至96孔板中，37℃、20min，波长为450nm，酶标仪测定od值。
[0107]
(3)计算公式：
[0108][0109][0110]
4.谷胱甘肽过氧化物酶(gsh
‑
px)的测定
[0111]
(1)10％匀浆液的制备同1的
·
oh的测定；
[0112]
(2)如表7设置实验体系。
[0113]
表7 gsh
‑
px实验体系
[0114][0115]
混匀后，4000r/min，离心10min，离心结束后，取1ml上清作后续的显色反应。
[0116]
(3)如表8设置显色反应体系
[0117]
表8 gsh
‑
px显色反应体系
[0118][0119]
混匀后，每孔2.3ml总体积转移至6孔板中，波长412nm，酶标仪测定各孔od值。
[0120]
(4)计算公式：
[0121][0122]
5.谷胱甘肽(gsh)含量的测定
[0123]
(1)10％匀浆液的制备同1的
·
oh的测定；
[0124]
(2)如表9设置实验体系。
[0125]
表9 gsh实验体系
[0126][0127]
静置5min，波长为405nm，酶标仪测定各孔od值。
[0128]
(3)计算公式：
[0129][0130]
6.谷胱甘肽还原酶(gr)的测定
[0131]
(1)10％匀浆液的制备同1的
·
oh的测定；
[0132]
(2)如表10设置实验体系。
[0133]
表10 gr实验体系
[0134][0135]
(3)紫外分光光度计，340nm处30s时读取吸光度值a1。再置37℃准确水浴2min，150s时读取吸光度值a2。
[0136]
(4)计算公式：
[0137][0138]
*6.22为1mm nadph在340nm波长1cm光径的消光系数。
[0139]
实施例4：
[0140]
紫云英苷对小鼠肌肉中nrf2及下游基因mrna表达的影响
[0141]
1.总rna提取
[0142]
(1)将dmso组，运动(ex)，ex ag 50mg/kg组和ex ag 100mg/kg组小鼠肌肉组织从
‑
80℃中取出，放入经depc处理的研钵中，液氮研磨成细粉状，之后加入1ml trizol reagent(invitrogen，美国)，混匀，冰上裂解30min。
[0143]
(2)加入200μl氯仿，冰上孵育15min，12000r/min，4℃，离心15min。
[0144]
(3)在新的1.5ml离心管中加入上层清液，加500μl异丙醇，混匀，冰上孵育15min。
[0145]
(4)4℃条件下，12000r/min，离心10min。
[0146]
(5)弃上清，用75％乙醇洗涤2次，4℃，12000r/min，离心5min。
[0147]
(6)待乙醇彻底挥发完全后，加20μl depc
‑
ddh2o，测定rna浓度。
[0148]
2.反转录
[0149]
以提取的dmso组，运动(ex)，ex ag 50mg/kg组和ex ag 100mg/kg组小鼠肌肉组织的rna为模板，进行反转录得到cdna，详细步骤如下：
[0150]
将提取的rna在65℃条件下热变性5min后，立即置于冰上冷却。第一次使用时向4x dn master mix(440μl)中添加8.8μl的gdna remover，然后在冰上配制反应液，包括2μl的4x dn master mix、0.5μg的rna template加入nuclease
‑
free water将总体积补齐到8μl，混匀后37℃孵育5min，结束后立即置于冰上然后加入2μl的5x rt master mix ii然后进行37℃反应15min后98℃反应5min最后4℃保存。
[0151]
3.qrt
‑
pcr检测：
[0152]
以反转录得到的dmso组，运动(ex)，ex ag 50mg/kg组和ex ag 100mg/kg组小鼠肌肉组织的crna为模板，进行pcr扩增，检测nrf2及其下游抗氧化相关基因mrna的表达，详细步骤如下：
[0153]
将反转录产物cdna按照1：2加ddh2o稀释，然后按照表11进行qrt
‑
pcr。
[0154]
表11 qrt
‑
pcr反应体系
[0155][0156]
反应条件：95℃，2min；40
×
(95℃，15s；60℃，40s)，95℃，15s；60℃，1min；该循环结束后再加入溶解曲线。
[0157]
表12实时荧光定量引物序列
[0158][0159][0160]
实施例5：
[0161]
紫云英苷对小鼠肌肉中nrf2及下游基因蛋白表达的影响
[0162]
1.组织全蛋白提取
[0163]
(1)将组织样品用液氮充分研磨，加入蛋白裂解液。放置于摇床上，4℃裂解30min，13000r/min，离心10min，取上清，
‑
80℃保存备用。
[0164]
2.蛋白浓度测定：
[0165]
(1)蛋白浓度测定标准品制备如表13所示。
[0166]
(2)取洁净的1.5ml的ep管，分别加入待测样品10μl和40μl的ddh2o，混合均匀。
[0167]
(3)取96孔板，每孔加入25μl混合后的样品到和200μl混合液(a液：b液＝50:1)。
[0168]
(4)37℃培养箱孵育30min，酶标仪测定562nm处od值。
[0169]
(5)绘制标准曲线，根据标准曲线调平蛋白浓度。
[0170]
表13蛋白浓度测定标准品配置
[0171][0172]
3.sds
‑
page电泳
[0173]
(1)配制分离胶，用异丙醇封层。
[0174]
(2)待胶凝后，弃上层异丙醇，配置浓缩胶，插入胶孔梳。
[0175]
(3)等胶凝后倒入电泳液，然后将插入的梳子拔出，随后点入蛋白样品，30μl/孔。
[0176]
(4)接通电源，调节电压至80v，恒压跑胶。溴酚蓝到底端时，按停开关，停止跑胶。
[0177]
表14分离胶配方
[0178][0179]
表15浓缩胶配方
[0180][0181][0182]
4.转膜
[0183]
(1)根据检测抗体条带大小，切胶。
[0184]
(2)按海绵、滤纸(4层)、胶、pvdf膜、滤纸、海绵的顺序安放于转膜夹中。
[0185]
(3)将组装好的转膜夹，按照红对红，黑对黑的顺序安装于转印槽中，倒入转膜液。
[0186]
(4)通电，横流300ma，时间为90min。
[0187]
5.western杂交
[0188]
(1)封闭液(含5％脱脂奶粉)孵育1h。
[0189]
(2)加入一抗4℃孵育过夜。
[0190]
(3)0.2％tbs
‑
tween洗膜3次，15min/次。
[0191]
(4)二抗4℃孵育1h。
[0192]
(5)0.2％tbs
‑
tween洗膜3次，每次15min。
[0193]
(6)odyssey红外荧光扫仪检测条带，并进行灰度扫描。
[0194]
统计学分析
[0195]
实验数据以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示，用spss statistics 22.0软件分析，p<0.05认为差异具有统计学意义，用graphpad prism 5.0软件作图。
[0196]
实验结果
[0197]
1.紫云英苷对小鼠肝损伤检测
[0198]
为了检测紫云英苷对小鼠是否有损伤，灌胃不同浓度紫云英苷后通过酶化学法检测小鼠血清中alt、ast和akp的活性，结果如图1所示，与50％乙醇对照组相比，灌胃50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg不同浓度的紫云英苷均未对小鼠肝脏造成损伤，证明紫云英苷对小鼠身体没有毒性作用。
[0199]
2.小鼠运动损伤模型制备
[0200]
制备小鼠急性力竭运动损伤模型，通过酶化学检测不同运动时间对小鼠血清中产生超氧阴离子的影响见图2，结果表明，在2
‑
4h运动时间范围内，随着小鼠运动时间的延长，小鼠体内血清中产生超氧阴离子的含量也随之增加(p<0.01)，呈时间依赖性产生。
[0201]
3.小鼠运动前后形态变化
[0202]
运动前后小鼠形态变化见图3，运动前，各组小鼠饮食饮水均呈现正常现象；实验期间各组小鼠活动正常，没有出现食欲减退，焦躁不安等现象；运动后小鼠触背疲软无力，不再运动；解剖小鼠身体后发现，心、肺、肝、肾等器官均未观察到异常变化，证明紫云英苷使用安全。
[0203]
4.紫云英苷可降低力竭运动对小鼠肝损伤的影响
[0204]
紫云英苷对小鼠运动后肝损伤的影响如图4所示，与对照组相比，力竭运动后小鼠体内alt和ast活性显著升高(p<0.01)；与力竭运动处理组相比，灌胃紫云英苷后alt和ast活性显著降低(p<0.01)。结果说明力竭运动对小鼠肝脏造成损伤，紫云英苷可降低力竭运动造成的肝损伤。
[0205]
5.紫云英苷对小鼠抗氧化功能的影响
[0206]
5.1紫云英苷对小鼠肌肉羟基自由基(
·
oh)清除能力的影响
[0207]
紫云英苷对小鼠力竭运动后肌肉羟基自由基清除能力的影响见图5，与dmso组相比，力竭运动组肌肉羟基自由基的清除能力显著降低(p<0.01)；与力竭运动对照组相比，灌胃紫云英苷能显著增强小鼠力竭运动后肌肉羟基自由基的清除能力(p<0.01)。
[0208]
5.2紫云英苷对小鼠肌肉超氧阴离子(o2‑
)清除能力的影响
[0209]
紫云英苷对小鼠力竭运动后肌肉超氧阴离子清除能力的影响见图6，与dmso对照
组相比，力竭运动组肌肉o2‑
清除能力显著降低(p<0.01)；与力竭运动对照组相比，灌胃紫云英苷能显著增强小鼠力竭运动后肌肉o2‑
的清除能力(p<0.01)。
[0210]
5.3紫云英苷对小鼠肌肉gsh
‑
px、gr活性的影响
[0211]
紫云英苷对小鼠力竭运动后肌肉gsh
‑
px酶活力的影响如图7所示，与dmso对照组相比，力竭运动组的小鼠肌肉中gsh
‑
px活性显著降低(p<0.01)；与力竭运动处理组相比，灌胃紫云英苷可使小鼠肌肉gsh
‑
px活性表达明显升高(p<0.01)。
[0212]
紫云英苷对小鼠运动后肌肉gr活性的影响如图8所示，与dmso对照组相比，力竭运动处理组小鼠体内gr活性显著降低(p<0.05)；与力竭运动处理组相比，灌胃紫云英苷可使运动后的小鼠肌肉gr酶活性升高(p<0.01)。
[0213]
5.4紫云英苷对小鼠肌肉gsh含量影响
[0214]
紫云英苷对小鼠力竭运动后肌肉gsh含量的影响如图9所示，与dmso对照组相比，力竭运动处理组小鼠肌肉gsh含量明显降低(p<0.05)；与力竭运动处理组相比，灌胃紫云英苷可使运动后的小鼠肌肉gsh含量显著升高(p<0.05)。
[0215]
5.5紫云英苷对小鼠肌肉sod活性的影响
[0216]
紫云英苷对小鼠运动后肌肉sod酶活力的影响如图10所示，与dmso对照组相比，力竭运动处理组小鼠肌肉组织中sod活性降低，与力竭运动处理组相比，灌胃50mg/kg紫云英苷可使小鼠肌肉sod酶活力升高(p<0.05)。
[0217]
6.紫云英苷对小鼠肌肉nrf2及下游基因mrna表达的影响
[0218]
紫云英苷对小鼠肌肉抗氧化基因nrf2、gclc、gclm、ho
‑
1、nqo1、sod1和sod2mrna表达的影响见图11，由图可知，与dmso对照组相比，力竭运动后肌肉中抗氧化基因nrf2、gclc、gclm、ho
‑
1、nqo1、sod1和sod2 mrna表达显著降低(p<0.05)；与力竭运动处理组相比，灌胃紫云英苷后nrf2及其下游基因mrna表达显著升高(p<0.01)。
[0219]
7.紫云英苷对小鼠肌肉nrf2及下游基因蛋白表达的影响
[0220]
紫云英苷对小鼠肌肉抗氧化基因nrf2及下游基因蛋白表达的影响见图12，由图可知，与对照组相比，力竭运动后肌肉抗氧化nrf2、gclc、gclm、ho
‑
1、nqo1、sod1和sod2基因蛋白表达显著降低(p<0.05)；与力竭运动处理组相比，灌胃紫云英苷后nrf2、gclc、gclm、ho
‑
1、nqo1、sod1和sod2蛋白表达显著升高(p<0.01)。
[0221]
综上，制备小鼠运动损伤模型，通过酶化学法检测不同运动时间小鼠血清中产生o2‑
含量，运动损伤时间为4h时，小鼠血清中o2‑
含量最高，确定运动损伤时间为4h。运动前，各组小鼠活动正常，没有出现食欲减退，焦躁不安等现象，力竭运动后小鼠触背疲软无力，不再运动。灌胃不同浓度紫云英苷后检测紫云英苷对小鼠血清中alt、ast和akp的活性影响，与50％乙醇阳性对照组相比，50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg紫云英苷均未对小鼠肝脏造成损伤，证明紫云英苷对小鼠身体没有毒性作用；通过酶化学法检测力竭运动后，肌肉组织
·
oh和o2‑
清除能力均降低，gsh含量降低，gsh
‑
px、sod和gr酶活均降低；力竭运动后灌胃50mg/kg和100mg/kg紫云英苷后
·
oh和o2‑
清除能力均增强，gsh含量升高，gsh
‑
px、sod和gr酶活均升高；与力竭运动处理组相比，灌胃紫云英苷后，qrt
‑
pcr和western blot结果显示肝脏和肌肉中nrf2依赖性抗氧化基因nqo1、ho
‑
1、gclc、gclm、sod1和sod2基因mrna和蛋白表达水平均上调。
[0222]
综上所述，如图13所示，h2o2损伤机体后，添加紫云英苷作用，可促进nrf2调控
gclm、gclc、nqo
‑
1、ho
‑
1、sod1和sod2基因的表达来上调机体的抗氧化能力。
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62.
[0263]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变
化囊括在本发明内。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。