莲子心新碱在制备治疗白血病药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及一种化合物的用途，具体为莲子心新碱及其药学上可接受的盐在制备治疗白血病药物中的应用。


背景技术：

2.莲子心为常用中药，又名莲薏、苦薏、薏，来源于睡莲科莲属植物莲nelumbonuciferagaertn干燥种子的幼叶及胚根。传统中医药理论认为，莲子心具有清心、去热、止血、涩精的功效，主治心烦、口渴、吐血、遗精、目赤肿痛、高血压等症。中药莲子心也用于白血病治疗。一种抗白血病及逆转耐药的中药制剂由莲子心与黄芪组方而成，具有抗白血病及逆转耐药和增强免疫提高抗肿瘤的效应[谢兆霞.抗白血病及逆转耐药的中药制剂：cn99115402.9.1999.06.02.]。莲子心所含生物碱主要为异喹啉类化合物[张弦，潘扬.植物莲中生物碱类成分的研究概况.南京中医药大学学报(自然科学版)，2002，18(6)：382
‑
384；杨光明，潘扬.莲异喹啉生物碱及其松弛平滑肌作用的研究进展.中国中药杂志，2019,44(18)：3924
‑
3934.]，目前只有甲基莲心碱(neferine)在白血病治疗上被发现具有抗人慢性粒细胞白血病的作用[zhang yl，xiao yh，dong qx，ouyang wj，qin q.neferine in the lotusplumule potentiates the antitumor effect of imatinib in primary chronic myeloid leukemia cells in vitro.journal of food science，2019,84(4)：904
‑
910.]。
[0003]
张婉婷等研究发现莲子心中含有三苄基异喹啉苯醚类新结构类型化合物莲子心新碱(英文名：neoliensinine，缩写：neol)，并在前期证明了莲子心新碱具有抑制非小细胞肺癌侵袭转移的作用[张婉婷，王歆竹，米玉辉，杨光明，潘扬.莲子心新碱对转化生长因子β1诱导的h1299细胞侵袭和迁移的抑制作用及其机制.中药新药与临床药理，2021,32(10)：1459
‑
1467.]。yang gm等发现莲子心新碱对肠系膜血管平滑肌的舒张作用[yang gm，sun j，pan y，zhangjl，xiao m，zhu ms.isolation and identification of a tribenzylisoquinoline alkaloid from nelumbonucifera gaertn，a novel potential smooth muscle relaxant.fitoterapia，2018，124：58
‑
65.]。张军利等对莲子心新碱对肠系膜血管平滑肌收缩的抑制作用及分子机制进行了研究[张军利，肖敏，王鹏，张弦，潘扬，杨光明.莲子心新碱对肠系膜血管平滑肌收缩的抑制作用及分子机制.南京中医药大学学报(自然科学版)，2019,35(3)：313
‑
318.]。


技术实现要素：

[0004]
发明目的：本发明的目的在于提供莲子心新碱或药学上可接受的盐在制备治疗白血病药物中的应用。
[0005]
技术方案：本发明所述的莲子心新碱及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗白血病药物中的应用。
[0006]
所述的应用，莲子心新碱结构如式(1)所示：
[0007][0008]
所述的应用，所述白血病包括急性髓系白血病、慢性粒细胞白血病、t细胞恶性肿瘤和弥漫大b细胞淋巴瘤。
[0009]
所述的应用，通过对人aml细胞、人cml细胞、人t细胞恶性肿瘤和人dlbcl细胞的活力抑制和凋亡诱导预防和/或治疗白血病。
[0010]
莲子心新碱及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗急性髓系白血病药物中的应用。
[0011]
莲子心新碱及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
[0012]
莲子心新碱及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗t细胞恶性肿瘤药物中的应用。
[0013]
莲子心新碱及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗弥漫大b细胞淋巴瘤药物中的应用。
[0014]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：本研究通过mtt细胞活力检测实验和annexin v
‑
fitc/pi细胞凋亡检测实验，发现莲子心中三苄基异喹啉苯醚类新结构类型化合物莲子心新碱具有抑制人aml细胞、人cml细胞、人t细胞恶性肿瘤和人dlbcl细胞活力及诱导其凋亡的能力，验证了莲子心新碱具有抗白血病的作用，显示了莲子心新碱在制备治疗白血病的应用前景。
附图说明
[0015]
图1是0～32μm莲子心新碱在6h和12h下对aml细胞系thp1细胞的活力水平影响；
[0016]
图2是0～32μm莲子心新碱在6h和12h下对aml细胞系mv411细胞的活力水平影响；
[0017]
图3是0～32μm莲子心新碱在6h和12h下对t细胞恶性肿瘤细胞系jurkat细胞的活力水平影响；
[0018]
图4是0～32μm莲子心新碱在6h和12h下对t细胞恶性肿瘤细胞系molt4细胞的活力水平影响；
[0019]
图5是0～32μm莲子心新碱在6h和12h下对t细胞恶性肿瘤细胞系hut102细胞的活力水平影响；
[0020]
图6是0～32μm莲子心新碱在6h下对cml细胞系k562细胞的活力水平影响；
[0021]
图7是0～32μm莲子心新碱在6h和12h下对dlbcl细胞系ocily3细胞的活力水平影响；
[0022]
图8是0～32μm莲子心新碱在6h和12h下对dlbcl细胞系r1.1细胞的活力水平影响；
[0023]
图9是0～32μm莲子心新碱在6h和12h下对dlbcl细胞系sudhl4细胞的活力水平影响；
[0024]
图10是0～32μm莲子心新碱在6h和12h下对dlbcl细胞系sudhl8细胞的活力水平影响；
[0025]
图11是8μm莲子心新碱在12h下对aml细胞系thp1、mv411、u937和me1细胞的凋亡诱导能力的检测；
[0026]
图12是8μm莲子心新碱在4h下对cml细胞系k562细胞的凋亡诱导能力的检测；
[0027]
图13是8μm莲子心新碱在12h下对t细胞恶性肿瘤细胞系jurkat、hut102和molt4细胞的凋亡诱导能力的检测；
[0028]
图14是8μm莲子心新碱在12h下对dlbcl细胞系sudhl8、sudhl4、r1.1和ocily3细胞的凋亡诱导能力的检测。
具体实施方式
[0029]
实施例1
[0030]
莲子心新碱对人白血病细胞系细胞活力的影响
[0031]
1.1、实验材料
[0032]
1.1.1试剂与材料
[0033]
①
化合物
[0034]
莲子心新碱(c
63
h
69
n3o
10
，分子量：1027.49)由南京中医药大学药用菌与中药生物技术研究所提供，淡黄色粉末，纯度＞90％。使用前用二甲基亚砜将化合物粉末配置成浓度为0.01m储备液，置于
‑
80℃保存。使用时采用细胞培养相应培养基稀释到所需浓度。
[0035]
②
细胞系
[0036]
人aml细胞系包括thp1和mv411细胞，人cml细胞系包括k562细胞，人t细胞恶性肿瘤细胞包括jurkat、hut102和molt4细胞，人dlbcl细胞包括sudhl4、sudhl8、r1.1和ocily3细胞，均购自上海中国科学院细胞所。
[0037]
③
细胞培养试剂
[0038]
rpmi
‑
1640培养基(gibco，carlsbad，ca，usa)：取5.2g rpmi
‑
1640粉末和1.0g nahco3共同溶于0.5l ddh2o中。用无菌圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4℃保存。使用前加入100u/ml青霉素(辰欣药业股份有限公司，济宁，中国)和100mg/l链霉素(辰欣药业股份有限公司)。
[0039]
胎牛血清(gibco)保存于
‑
20℃，使用前于56℃水浴灭活35min后分装保存于4℃，一周内使用。使用时将胎牛血清与培养基按1∶10混合。
[0040]
④
相关指标检测试剂盒
[0041]
mtt溶液：避光操作，0.05g mtt(翌圣生物科技，上海，中国)粉末溶于10ml pbs缓冲液中，超声20min，配制成浓度为5mg/ml溶液。采用0.22μm无菌滤头过滤，分装，置于
‑
80℃
保存。使用时提前于室温溶解。
[0042]
1.1.2实验仪器
[0043]
yj
‑
875型医用净化工作台(净化设备厂，苏州，中国)；3111型水套式co2培养箱(thermofisher scientific，waltham，ma，usa)；702型超低温冰箱(thermofisher scientific)；电子天平(赛多利斯仪器系统有限公司，北京，中国)；qiujing血细胞计数板(求精生化试剂仪器有限公司，上海，中国)；ld4
‑
2普通离心机(医用离心机厂，上海，中国)；5417r型台式冷冻高速离心机(eppendorf ag，hamburg，germany)；research型单道可调移液器(eppendorf ag)；thz
‑
312型台式恒温振荡器(精宏试验设备有限公司，上海，中国)；varioskan全波长酶标仪(thermofisher scientific)。
[0044]
1.2、实验方法
[0045]
①
细胞活力检测
[0046]
原理：mtt可以被细胞内线粒体脱氢酶还原生成蓝紫色结晶甲臌(formazan)，在570nm波长处检测光密度(optical density，od)值并比较，可以反映细胞活力相对水平。操作流程：100μl细胞(5000个/孔)均匀培养在96孔板内，加入100μl一定浓度的莲子心新碱，细胞在37℃、5％co2培养箱中培养；药物作用结束后，每孔加入15μl mtt溶液。培养箱中孵育3h后，使用酶标仪测定570nm下od值。抑制率％＝(1
‑
给药组细胞平均吸光值/对照组细胞平均吸光值)
×
100％；graphpad prism 8.0软件计算半数抑制浓度(50％inhibiting concentration，ic
50
)。
[0047]
1.3、实验结果
[0048]
通过mtt法检测从中药莲子心中提取出的天然化合物莲子心新碱在不同浓度下对不同白血病细胞的活力抑制作用。结果显示，0～32μm莲子心新碱作用白血病细胞6h或12h后，对细胞均有显著的活力抑制作用，呈时间和浓度依赖性。莲子心新碱在6h和12h对thp1的ic
50
分别为18.15μm和4.90μm(图1)；莲子心新碱在6h和12h对mv411的ic
50
分别为3.00μm和1.99μm(图2)；莲子心新碱在6h和12h对jurkat的ic
50
分别为3.32μm和2.17μm(图3)；莲子心新碱在6h和12h对molt4的ic
50
分别为18.15μm和4.89μm(图4)；莲子心新碱在6h和12h对hut102的ic
50
分别为8.19μm和2.91 μm(图5)；莲子心新碱在6h对k562的ic
50
为5.49μm(图6)；莲子心新碱在6h和12h对ocily3的ic
50
分别为6.88μm和1.98μm(图7)；莲子心新碱在6h和12h对r1.1的ic
50
分别为4.48μm和2.98μm(图8)；莲子心新碱在6h和12h对sudhl4的ic
50
分别为9.42μm和4.98μm(图9)；莲子心新碱在6h和12h对sudhl8的ic
50
分别为4.00μm和1.23μm(图10)。该结果表明莲子心新碱对人aml细胞、人cml细胞、人t细胞恶性肿瘤细胞和人dlbcl细胞具有显著的活力抑制作用。μm指的是μmol/l。
[0049]
实施例2
[0050]
莲子心新碱对人白血病细胞系凋亡诱导的作用
[0051]
2.1、实验材料
[0052]
2.1.1试剂与材料
[0053]
①
化合物
[0054]
同1.1.1。
[0055]
②
细胞系
[0056]
人aml细胞系包括thp1，mv411，u937和me1细胞，人cml细胞系包括k562细胞，人t细
胞恶性肿瘤细胞包括jurkat、hut102和molt4细胞，人dlbcl细胞包括sudhl4、sudhl8、r1.1和ocily3细胞，均购自上海中国科学院细胞所。
[0057]
③
细胞培养试剂
[0058]
同1.1.1。
[0059]
④
相关指标检测试剂盒
[0060]
annexinv/pi细胞凋亡检测试剂盒(诺唯赞生物科技，南京，中国)用于检测细胞凋亡。
[0061]
2.1.2实验仪器
[0062]
yj
‑
875型医用净化工作台(净化设备厂，苏州，中国)；3111型水套式co2培养箱(thermofisher scientific，waltham，ma，usa)；702型超低温冰箱(thermofisher scientific)；电子天平(赛多利斯仪器系统有限公司，北京，中国)；qiujing血细胞计数板(求精生化试剂仪器有限公司，上海，中国)；ld4
‑
2普通离心机(医用离心机厂，上海，中国)；5417r型台式冷冻高速离心机(eppendorf ag，hamburg，germany)；research型单道可调移液器(eppendorf ag)；流式细胞仪(becton
‑
dickinson and company，nj，usa)。
[0063]
2.2、实验方法
[0064]
①
细胞凋亡检测
[0065]
原理：依据annexin v与细胞磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，ps)的结合作为凋亡考查标准。细胞凋亡通常伴随着细胞膜的破坏。早期凋亡(early apoptois)发生时，ps由细胞膜脂质双分子层内侧外翻，从而结合annexin v
‑
fitc染料，通过流式细胞仪可检测到fl
‑
1增强信号；进入细胞晚期凋亡(late apoptosis)后，由于细胞膜通透性增强，碘化丙啶(propidium iodide，pi)
‑
percp染料与细胞核酸结合，从而可检测fl
‑
3增强信号。因此，利用annexin v/pi双染实验，统计凋亡细胞占比，能区分早凋/晚凋细胞。操作流程：将莲子心新碱处理后的细胞收集并离心，磷酸缓冲液(phosphate
‑
buffered saline，pbs)洗涤2次后，用40μl binding buffer重悬细胞；加入1.7μl annexin v和1.7μl pi染料室温避光下孵育10分钟(minutes，min)，补加250μl binding buffer重悬，即可用流式细胞仪进行检测。凋亡细胞为annexin v
‑
fitc阳性细胞。
[0066]
2.3、实验结果
[0067]
通过annexin v/pi细胞凋亡检测法检测莲子心新碱对人白血病细胞的凋亡诱导作用。结果显示，人aml细胞系u937、thp1、mv411和me1细胞在8μm莲子心新碱作用12h后，4种细胞的凋亡率分别为87.7％，71.2％，97.1％和70.2％(图11)；人cml细胞系k562细胞在8μm莲子心新碱作用4h后，细胞凋亡率为55.5％(图12)；人t细胞恶性肿瘤细胞系jurkat、hut102和molt4细胞在8μm莲子心新碱作用12h后，3种细胞的凋亡率分别为83.5％，43.2％和86.6％(图13)；人dlbcl细胞系sudhl8、sudhl4、r1.1和ocily3细胞在8μm莲子心新碱作用12h后，4种细胞的凋亡率分别为88.2％，70.8％，65.4％和93.9％(图14)。该结果说明莲子心新碱具有对人aml细胞、人cml细胞、人t细胞恶性肿瘤细胞和人dlbcl细胞的凋亡诱导作用，验证了莲子心新碱抗白血病的作用效果。