蘑菇醇作为三种镰刀菌毒素生物合成抑制剂的用途的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及蘑菇醇作为三种镰刀菌毒素生物合成抑制剂的用途。
2.研究背景
3.镰刀菌毒素是镰刀菌属真菌产生的多种有毒次生代谢产物，主要包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)、伏马毒素b1(fb1)、玉米赤霉烯酮(zen)等。don，又名呕吐毒素，主要由禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)和黄色镰刀菌(fusarium culmorum)产生，广泛存在于小麦，玉米等粮食作物中，具有很高的细胞毒性、免疫抑制毒性,会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。fb1是由串珠镰刀菌(fusarium moniliforme)在一定温度和湿度条件下产生的有毒次级代谢产物，主要污染玉米、大米、小麦等谷物及其制品。fb1具有较强的神经毒性、肺毒性、肝脏毒性、肾脏毒性和免疫毒性等，还可能诱发食道癌、肝癌、胃癌等疾病，严重威胁人畜健康，国际上把fb1作为2b级致癌物。zen又称为f
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2毒素，由禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、木贼镰刀菌(fusarium equiseti)、雪腐镰刀菌(fusarium nivale)等产生，主要存在于玉米、小麦、高粱、大米等谷物中。zen具有细胞毒性、生殖毒性和致畸性，可以对肝脏和肾脏造成损伤；同时zen可以破坏免疫系统，严重时可诱导产生肿瘤。
4.don、fb1和zen已成为中国粮食增产和质量安全的重要威胁，在粮食、饲料、食品中镰刀菌毒素污染较普遍，且三种镰刀菌在不同农产品中往往同时存在，对我国农业和人民造成了巨大的经济损失和健康威胁。鉴于镰刀菌毒素的强烈毒性和广泛分布性，国内外已经制定了不同农产品、食品和饲料中镰刀菌毒素的限量标准。
5.为更好的防控镰刀菌毒素污染，减少财产损失，保障人民健康和生命安全，开发能够高效抑制镰刀菌毒素产生、安全、无毒的抑制剂具有非常重要的经济价值和社会意义。
6.

技术实现要素：

7.本发明提供了蘑菇醇作为三种镰刀菌毒素生物合成抑制剂的用途；
8.具体的说，蘑菇醇使用时可配制成浓度为10mmol/l及以上浓度的水溶液；蘑菇醇水溶液的浓度越高，其对镰刀菌毒素的生物合成抑制效果就越好；优选的蘑菇醇水溶液的浓度为10
‑
500mmol/l；
9.进一步优选的，蘑菇醇水溶液用于农产品如小麦、玉米等作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇生成抑制剂时，优选的蘑菇醇水溶液浓度为200
‑
500mmol/l；
10.蘑菇醇作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇生成抑制剂时，可以将蘑菇醇水溶液直接喷洒到农产品表面、或者直接加入基质等。
11.本发明提供的蘑菇醇作为三种镰刀菌毒素生物合成抑制剂的用途，使用的蘑菇醇为食用香精，在我国来源广，成本低，对人体无害，具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香气。蘑菇醇可以有效抑制pda培养基以及玉米、小麦等农产品中三种镰刀菌毒素的生物合成，抑制效果好，安全无毒副作用。使用过程简单，普通人员简单培训即可使用，有益于大规模推广。
附图说明
12.图1不同浓度蘑菇醇对pda培养基中don、fb1、zen生物合成的抑制作用
13.图2不同浓度蘑菇醇对小麦中don、fb1、zen生物合成的抑制作用
14.图3不同浓度蘑菇醇对玉米中don、fb1、zen生物合出的抑制作用
具体实施方式
15.下列实施例中需要用到的实验材料、实验方法及其验证
16.(1)试剂
17.葡萄糖、琼脂(上海源叶生物科技有限公司)；乙腈、甲醇、乙酸铵(美国merck公司)；蘑菇醇(上海国药集团化学试剂有限公司)；don标准品、fb1标准品、zen标准品(纯度大于99％,美国romer公司)。
18.(2)仪器
19.超高效液相色谱仪(美国waters公司)；triple quadtm 5500三重四级杆质谱仪(美国ab sciex公司)；hsc
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24b氮吹仪(上海楚定分析仪器有限公司)；milli
‑
q超纯水仪(美国millipore公司)；al104分析天平(瑞士梅特勒
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托利多仪器有限公司)；sk8210lhc超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司)；bj
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800a食品粉碎机(杭州德清拜杰电器有限公司)；sx
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500高压灭菌锅(日本tomy公司)；mgc
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300h人工气候箱(上海一恒科学仪器有限公司)；gzx
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cf101
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bs电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)；heraeus multifuge x3高速离心机(美国thermo fisher scientific公司)
20.(3)菌株培养基
21.pda培养基：去皮马铃薯200g煮沸30min后取滤液，加入葡萄糖20g、琼脂16g，用蒸馏水定容至1000ml，115℃高压灭菌30分钟，降温到55℃左右倒平板，每平板20ml。
22.pdb液体培养基：去皮马铃薯200g煮沸30min后取滤液，加入葡萄糖20g，用蒸馏水定容至1000ml，115℃高压灭菌30分钟。
23.玉米培养基：称取50g优质玉米至250ml三角瓶，加入20ml蒸馏水混匀，用透气封口膜密封瓶口，浸泡过夜，高压灭菌(121℃，30min)，冷却后将玉米摇散待用。
24.小麦培养基：称取50g优质小麦至250ml三角瓶，加入20ml蒸馏水混匀，用透气封口膜密封瓶口，浸泡过夜，高压灭菌(121℃，30min)，冷却后将小麦摇散待用。
25.(4)产毒菌株活化
26.将禾谷镰刀菌菌株f4582(购至德国微生物菌种保藏中心dsmz)，串珠镰刀菌3.6924(购至中国普通微生物菌种保藏管理中心cgmcc)，禾谷镰刀菌f1096(购至德国微生物菌种保藏中心dsmz)接种于pda固体培养基，28℃黑暗培养7天后，接种至pdb液体培养基中，25℃下150r/min震荡继续培养5天。取孢子液，显微镜观察孢子浓度，用无菌水调整至105个/ml，用于后续接种。
27.(5)菌株接种
28.将100μl孢子液接种至pda培养基，黑暗中培养9天后观察到培养基菌丝生已长满整个培养皿。禾谷镰刀菌菌株f4582整体呈现出黄色，中间稍有些砖红色，中心的老菌丝有塌陷，边缘的菌丝紧贴在培养皿上；串珠镰刀菌3.6924整体呈现出透明状，中间稍有些白色；禾谷镰刀菌f1096整体呈现出白色，中心处菌丝生长茂盛。
29.将100μl培养好的孢子液接种至小麦和玉米培养中，接种第1周，每天振荡三角瓶1次，使孢子液与培养基充分接触。黑暗中培养28天后观察到三角瓶中长有黄色和白色的菌丝。
30.(6)样品前处理
31.don、zen：将pda、小麦和玉米培养基于50℃烘箱干燥，粉碎混匀后，准确称取2g粉
碎样品于50ml离心管，加入10ml乙腈/水(84/16，v/v)，旋涡震荡1min，浸泡5min后，超声提取1小时。4000r/min离心10min后，取5ml上清液，在40℃下氮气吹干，加入1ml的5mmol/l乙酸铵水溶液/甲醇(80:20，v:v)，涡旋30s，超声1min，涡旋30s，充分溶解后，适量稀释，过0.22μm滤膜。
32.fb1：将pda、小麦和玉米培养基于50℃烘箱干燥，粉碎混匀后，准确称取2g粉碎样品于50ml离心管，加入10ml乙腈/水(50/50，v/v)，旋涡震荡1min，浸泡5min后，超声提取1小时。4000r/min离心10min后，取5ml上清液，在40℃下氮气吹干，1ml的乙腈/水(50/50，v/v)溶解残渣，涡旋30s，超声1min，涡旋30s，充分溶解后，适量稀释，过0.22μm滤膜。
33.(7)超高效液相色谱
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串联质谱(uhplc
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ms/ms)检测条件
34.don检测：色谱柱：agilent poroshell 120ec
‑
c
18
色谱柱(100mm
×
3.0mm，2.7mm)；流动相：流动相a为5mmol/l乙酸铵溶液，流动相b为甲醇；梯度洗脱程序：0～0.5mim，10％a；4min，90％a；4.5min，90％a；4.7min，10％a；6min，10％a；流速0.4ml/min；进样量3μl；柱温40℃。
35.fb1、zen检测：色谱柱：agilent poroshell 120ec
‑
c
18
色谱柱(100mm
×
3.0mm，2.7mm)；流动相：fb1流动相a为0.1％的甲酸溶液；zen流动相a为5mmol/l乙酸铵溶液，流动相b为甲醇；梯度洗脱程序：0～0.5mim，10％a；3min，70％a；5min，90％a；6min，90％；6.1min，10％a；8min，10％a；流速0.4ml/min；进样量3μl；柱温40℃。
36.don、fb1、zen的具体质谱参数见表2。
37.表2 don、fb1、zen的质谱参数
[0038][0039]
(8)方法学验证
[0040]
通过考察线性、检出限(limit of detection，lod)和定量限(limit of quantitation，loq)、回收率和精密度来评价所建立pda、小麦和玉米培养基中don、fb1、zen分析方法的灵敏度、准确性和重复性。用空白基质溶液稀释标准工作液得到浓度为1、2、5、10、20、50、100和200μg/l的基质标准溶液，以毒素浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，建立don、fb1、zen的基质标准曲线并用于样品测定。以定性离子通道的3倍信噪比(signal
‑
to
‑
noise ratio，s/n)确定目标毒素的lod、定量离子通道的10倍信噪比确定目标毒素的loq。采用加标回收试验法考察回收率和精密度，选取空白pda、小麦和玉米培养基样品分别按照添加浓度5、50和100μg/kg加入适量的标准工作液，每个浓度选取5个平行样。回收率为测定值和理论值的百分比，日内精密度和日间精密度分别为同一天和连续5天测定结果的相对
标准偏差(relative standard deviation，rsd)。
[0041]
实验结果显示pda培养基、小麦和玉米中don、fb1、zen在各自范围内线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.990。pda中don的定量限为1μg/kg，检出限为0.4μg/kg；小麦中don的定量限为2μg/kg，检出限为1μg/kg；玉米中don的定量限为5μg/kg，检出限为2μg/kg。pda中don回收率范围为88.7％～102.9％(n＝5)，精密度(rsd％)范围为5.6％～11.5％(n＝5)；小麦中don的回收率范围为82.3％～98.3％(n＝5)，精密度(rsd％)范围为6.9％～11.0％(n＝5)；玉米中don的回收率范围为84.6％～101.4％(n＝5)，精密度(rsd％)范围为5.6％～11.5％(n＝5)。
[0042]
pda中fb1的定量限为1μg/kg，检出限为0.5μg/kg；小麦中fb1的定量限为0.5μg/kg，检出限为0.2μg/kg；玉米中fb1的定量限为5μg/kg，检出限为2μg/kg。加标回收试验结果表明，pda中fb1回收率范围为79.2％～97.8％(n＝5)，精密度(rsd％)范围为2.5％～13.6％(n＝5)；小麦中fb1的回收率范围为79.4％～110.5％(n＝5)，精密度(rsd％)范围为4.3％～11.8％(n＝5)；玉米中fb1的回收率范围为83.7％～99.2％(n＝5)，精密度(rsd％)范围为5.5％～11.1％(n＝5)。
[0043]
zen在pda、小麦和玉米中的定量限均为1μg/kg，检出限均为0.3μg/kg。pda中zen回收率范围为72.8％～89.8％(n＝5)，精密度(rsd％)范围为3.3％～11.3％(n＝5)；小麦中zen的回收率范围为93.6％～101.7％(n＝5)，精密度(rsd％)范围为1.5％～12.9％(n＝5)；玉米中zen的回收率范围为94.7％～113.4％(n＝5)，精密度(rsd％)范围为6.6％～9.4％(n＝5)。
[0044]
以上数据表明，采用的分析方法灵敏、准确、可靠，可实现pda、小麦和玉米籽粒中don、fb1、zen三种镰刀菌毒素的的准确定量。
[0045]
实施例1
[0046]
pda培养基中蘑菇醇对don、fb1、zen合成的抑制作用
[0047]
量取适量蘑菇醇溶于10ml无菌超纯水，过滤除菌后加入90ml灭菌后的pda培养基，使得最终添加浓度分别达到0、0.1、1、10、50和100mmol/l。混匀倒板后，接种100μl各菌种孢子液，于28℃恒温恒湿培养箱黑暗培养培养9天，采用uhplc
‑
ms/ms技术检测don、fb1、zen的产量。平行5份。
[0048]
结果表明(图1)，与对照组相比(蘑菇醇浓度0mmol/l)，当蘑菇醇的浓度达到0.1mmol/l以上时，对zen的生物合成有明显的抑制效果(p<0.05)，抑制率达到86.1％；当蘑菇醇的浓度不低于10mmol/l时，即可有效抑制don的生物合成(p<0.05)，产量下降89.4％，抑制效果随着蘑菇醇浓度的升高而增强；当蘑菇醇浓度达到50mmol/l时，fb1的生物合成量明显减少(p<0.05)，抑制率达83.5％；当蘑菇醇浓度达到100mmol/l时几乎完全抑制don、fb1、zen的产生。
[0049]
实施例2
[0050]
小麦中蘑菇醇对don、fb1、zen生物合成的抑制作用
[0051]
量取适量蘑菇醇溶于无菌超纯水，分别配制浓度分别为1mmol/l、10mmol/l、100mmol/l、200mmol/l和500mmol/l的蘑菇醇溶液，过滤除菌。准确称取50g小麦于250ml无菌锥形瓶中，120℃高压灭菌30分钟后分别加入20ml不同浓度的蘑菇醇溶液，对照组加入20ml无菌超纯水。用无菌透气封口膜密封锥形瓶，摇匀后加入100μl各菌种孢子液于28℃黑
暗培养28天，检测don、fb1、zen的产量。平行5份。
[0052]
结果显示(图2)，与对照组相比，当蘑菇醇的浓度为(200mmol/l)时即可显著抑制don的合成(p<0.01)，don的产量下降88.8％；当蘑菇醇的浓度达到500mmol/l可明显抑制fb1和zen的产生，抑制率达93.2％和99.7％。
[0053]
实施例3
[0054]
玉米中蘑菇醇对don、fb1、zen合成的抑制作用
[0055]
量取适量蘑菇醇溶于无菌超纯水，分别配制浓度分别为1mmol/l、10mmol/l、100mmol/l、200mmol/l和500mmol/l的蘑菇醇溶液，过滤除菌。准确称取50g玉米于250ml无菌锥形瓶中，120℃高压灭菌30分钟后分别加入不同浓度的20ml蘑菇醇溶液，对照组加入20ml无菌超纯水。用无菌透气封口膜密封锥形瓶，摇匀后加入100μl各菌种孢子液于28℃黑暗培养28天，检测don、fb1、zen的产量。平行5份。
[0056]
结果显示(图3)，与对照组相比，当蘑菇醇的浓度达到100mmol/l时即可显著抑制don的合成(p<0.01)，don的产量下降73.5％，抑制效果随着蘑菇醇浓度的升高而增强，当蘑菇醇浓度达到200mmol/l时，don的产量下降95.7％；当蘑菇醇浓度达到500mmol/l时，可完全抑制fb1、zen的产生，产量分别下降99.1％和99.5％。