一种用于治疗糖尿病视网膜病变的地塞米松原位液晶凝胶制剂、制备方法及应用与流程

1.本发明属于糖尿病视网膜病变治疗药物技术领域，具体是涉及一种用于治疗糖尿病视网膜病变的地塞米松原位液晶凝胶制剂、制备方法及应用。


背景技术：

2.随着全球糖尿病患病率的持续增长，糖尿病视网膜病变仍然是许多发达国家患者视力丧失的主要原因。糖尿病视网膜病变是由糖尿病引起的最常见和最严重的眼部疾病。有文献指出，大约三分之一的糖尿病患者有糖尿病视网膜病变的迹象，其中三分之一可能有威胁视力的视网膜病变，定义为严重的视网膜病变或黄斑水肿。糖尿病视网膜病变不仅会影响视力，还会增加血管并发症的风险。
3.糖尿病视网膜病变分为两个阶段，即早期非增殖性糖尿病视网膜病变阶段和晚期增殖性糖尿病视网膜病变阶段。非增殖性糖尿病视网膜病变阶段的特征是视网膜中各种炎症介质的产生增强，例如肿瘤坏死因子α、核因子κb和细胞间粘附分子1。增殖性糖尿病视网膜病变由非增殖性糖尿病视网膜病变发展而来，其特点是血管生成介质和血管内皮生长因子的分泌增强。炎症和血管生成介质的产生可引起视网膜神经胶质细胞的应激反应，导致胶质纤维酸性蛋白的产生增加，感光细胞功能受损或感光细胞死亡，最终失明。由于糖尿病视网膜病变的发病机制与炎症介质和新生血管介质有关。因此，具有抗炎或抗血管生成活性的药物已广泛用于缓解糖尿病视网膜病变及其相关并发症。
4.地塞米松是一种皮质类固醇，由于其抗炎、抗血管生成、抗凋亡和神经保护特性，已证明对非增殖性糖尿病视网膜病变和增殖性糖尿病视网膜病有效。是治疗葡萄膜炎等急慢性眼后段疾病的有效抗炎药。角膜是药物吸收的首要途径，但角膜上皮的亲脂性和紧密结合使其成为药物吸收的主要障碍，然而在临床上常用的磷酸钠滴眼液中，地塞米松以亲水离子化形式存在，不能有效渗透亲脂性角膜上皮。
5.临床上，玻璃体内注射地塞米松用于治疗糖尿病视网膜病变，但玻璃体内注射具有侵入性，可引起眼内出血、疼痛不适、患者依从性差等多种并发症。此外，频繁的玻璃体内注射可能会导致玻璃体出血和视网膜脱离。为了提高眼部的生物利用度，已经提出了几种眼科给药系统，如环糊精
‑
药物复合物、脂质体和纳米颗粒。然而，这些方法的半衰期很短，所有的药物都在几个小时内释放出来。因此，探索无创给药途径成为当务之急。
6.溶致液晶系统由于其无毒、黏膜黏附性好、生物相容性好等特点，受到越来越多科研人员的关注。溶致液晶的内部结构主要可分为层状(lα)、立方相(q
ii
)、六角相(h
ii
)。立方相(pn3m)可用作亲水性、亲脂性或两性药物的载体，亲水性药物位于脂质的极性头附近或在水通道中，而亲脂性药物将负载在脂质双层中，两亲性药物则在界面上。与立方相相反，六角相中的水通道是封闭的，六角相中药物的分布类似于立方相中的分布。此外，它们具有与活细胞膜相似的化学和结构特性，并且它们之间具有很高的亲和力。因此，该系统可以称为有能力和有前途的药物递送策略。
7.原位凝胶是一种用于给药的溶液，然后在眼中转化为凝胶。它结合了溶液和凝胶的优点，不仅给药方便，而且延长了在眼部的滞留时间，提高了眼部的生物利用度。更准确地说，原位凝胶是一种可以有效防止药物因鼻泪管引流而从目标部位被清除的制剂，从而提高生物利用度，减少给药频率，当然也提高了患者的依从性。


技术实现要素：

8.本发明要解决的技术问题为提供一种利用地塞米松原位液晶凝胶制剂作为治疗糖尿病视网膜病变的新的给药方式，延长角膜滞留时间，减少给药次数，使患者用药更为方便。同时本发明提供了该地塞米松原位液晶凝胶的制备方法。
9.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种用于治疗糖尿病视网膜病变的地塞米松原位液晶凝胶制剂，由60～70mg的脂质材料、0.01～3mg的地塞米松、25～35mg的共溶剂和0～5μl注射用水制成。
10.作为优选技术方案，地塞米松原位液晶凝胶制剂由65mg的脂质材料、1mg的地塞米松、30mg的共溶剂和5μl注射用水制成。
11.作为优选技术方案，所述脂质材料采用植烷三醇(phyt)、单油酸甘油酯(gmo)、单甘酯(mo)和山梨糖醇单油酸酯(smo)中的一种或多种。
12.作为优选技术方案，所述共溶剂采用peg400、吐温80、丙二醇、甘油中的一种或多种，以及眼睛生理上可耐受的任何其他的物质。
13.一种地塞米松原位液晶凝胶制剂的制备方法，步骤如下：
14.(1)精密称取脂质材料在相对应熔化温度下水浴加热作为油相；
15.(2)精密称取地塞米松、共溶剂、注射用水在水浴条件下加热至药物地塞米松溶解作为水相；
16.(3)将水相加入到油相中，加入后快速涡旋至无色透明，即得到地塞米松原位液晶凝胶制剂。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果表现在：
18.(1)本发明的地塞米松原位液晶凝胶制剂给药方便、具有良好的生物黏附性，延长角膜滞留时间，减少给药次数，减少药物副作用，提高患者依从性。
19.(2)液晶凝胶与生物膜结构相似，生物相容性好，能够增强角膜渗透，提高药物生物利用度。
20.(3)原位液晶凝胶制剂所采用的两亲性脂质材料和共溶剂安全、无毒、生物相容性好，故本制剂具有安全、无刺激等优点。
21.(4)本发明制作工艺简单，且长期稳定性高。
附图说明
22.图1是地塞米松原位液晶凝胶的偏光显微镜照片(图片放大100倍)，a为地塞米松原位液晶凝胶转相前，b为地塞米松原位液晶凝胶转相后。
23.图2是地塞米松原位液晶凝胶小角x射线散射曲线图。
24.图3是离体角膜渗透结果(n＝3)。
25.图4是地塞米松原位液晶凝胶的组织学照片(原始放大200倍)。图中，ep：上皮层；
st：基质层；en：内皮层；onl：外核层；inl：内核层；gcl：神经节细胞层。
26.图5是地塞米松原位液晶凝胶和滴眼液的眼部滞留时间结果对比照片。
27.图6是地塞米松原位液晶凝胶局部给药后的房水药动学曲线(n＝3)。
具体实施方式
28.以下结合附图和实施例对本发明作出进一步的详述。
29.实施例1
30.一种制备地塞米松原位液晶凝胶制剂的方法，包括以下步骤：
31.(1)精密称取65mg植烷三醇在60℃下水浴加热作为油相。
32.(2)精密称取1mg地塞米松、30mg peg400、5μl注射用水在水浴条件下加热至药物地塞米松溶解作为水相。
33.(3)将水相加入到油相中，加入后快速涡旋至无色透明，即得到地塞米松原位液晶凝胶制剂。液晶凝胶原位(相转变)前后分别呈液态、半固态凝胶。
34.实施例2
35.地塞米松原位液晶凝胶相转化性质
36.相转化的最小人工泪液体积(v
m
)和时间(t
g
)
37.取实施例1所制得的地塞米松原位液晶凝胶进相转化性质实验。使用管倒置法测定制剂的v
m
和t
g
。在离心管中准确称量200mg的地塞米松原位液晶凝胶，为模拟人体环境，将样品置于37℃水浴中，依次加入20μl人工泪液，快速涡旋，将样品倾斜90
°
观察样品是否凝胶化。当没有观察到流动时，证明样品已经完全胶凝化。当制剂完全胶凝时，记录实验结束时加入的人工泪液总量记为v
m
，记录凝胶形成时间为t
g
。
38.当前体暴露于人工泪液中时，由于存在水性环境，它们会发生相变，前体溶液逐渐变成凝胶状态。多次实验表明，在200mg制剂中加入75
±
5μl人工泪液后发生转相，转相时间约为1.4
±
0.3s。快速的溶液
‑
凝胶相变将减弱由血液循环系统中不良的高药物浓度引起副作用。
39.实施例3
40.地塞米松原位液晶凝胶的偏光显微镜观察
41.取实施例1所制得的地塞米松原位液晶凝胶进行偏光显微镜观察。为了考察凝胶的内部形态，将少量样品置于载玻片上并盖上盖玻片，然后在室温下进行偏光显微镜观察，结果如图1所示，地塞米松液晶凝胶原位(相转变)前、后均为暗视野。
42.实施例4
43.地塞米松原位液晶凝胶的小角x射线散射曲线绘制
44.取实施例1所制得的地塞米松原位液晶凝胶进行小角x射线散射试验，小角x射线散射试验可以进一步观察相转化后制剂的内部结构。使用x射线源在40kv和50ma下测试样品10分钟。将散射强度与布拉格峰的散射矢量(q)作图，根据样品的各散射峰对应的散射矢量比值确定结构。
45.制备的配方的散射模式可以在图2中看到。这些结果表明实施例1的布拉格峰的相对位置从左到右为√2:√3:√4，由此可以确定晶格类型为立方相液晶。
46.实施例5
47.地塞米松原位液晶凝胶的离体角膜渗透评估
48.取实施例1制得的地塞米松原位液晶凝胶进行离体角膜渗透研究。使用有效扩散面积为0.5024cm2改良的franz型扩散池进行角膜渗透实验。将制剂(50mg)放入供体室，地塞米松磷酸钠滴眼液作为对照组。受体室为5ml pbs缓冲液(ph 7.4，37℃)以保持漏槽条件。将角膜放在受体室上，角膜外表面朝上(凸面)，供体室放在角膜顶部，两个半室夹在一起。在特定时间(30、60、90、120、150、180、240、300和360分钟)间隔从受体室中取出400μl样品溶液，并更换为相同体积的pbs缓冲液。使用以下公式分析获得的数据：
[0049][0050]
其中，δq/δt代表受体室中地塞米松(q/μg)的含量与时间的曲线线性部分的斜率，c0表示供体室中的初始药物浓度(μg/ml)，a代表角膜的有效表面积(0.5024cm2)，60是从分钟到秒的单位转换。
[0051]
为了评价制剂对角膜的刺激性，在体外角膜渗透性试验后测量角膜水合水平(hl)。在体外渗透研究结束时，用生理盐水冲洗每个角膜以去除角膜表面的残留制剂，然后称重(wt)。在70
±
0.5℃干燥12h后，再次称重样品(wd)。使用以下公式计算hl％值：
[0052][0053]
表1离体角膜渗透参数和角膜水合值(n＝3)
[0054][0055]
*
p<0.05,与滴眼液相比有显著性差异；
[0056]
实施例1和地塞米松磷酸钠滴眼液的角膜外渗透实验结果如图3所示。显示实施例1在前150分钟内渗透速度比滴眼液更快更稳定，并在接下来的3.5小时内持续释放。与滴眼液组相比，原位液晶凝胶具有更好的角膜通透性。实施例1的p
app
是滴眼液组的5.45倍，说明原位液晶凝胶具有增强角膜通透性的作用。
[0057]
在体外角膜渗透试验后，评估了角膜水化水平。一般情况下，健康角膜的hl值为76～80％，角膜水化值超过83％表明角膜有一定程度的损伤。在本实施例中，实施例1的角膜的角膜水化水平分别为77.4
±
0.57％，而滴眼液为81.2
±
0.47％，说明整个实验过程中角膜没有受到明显的刺激和损伤。通过对比可以发现，实施例1角膜水化值优于地塞米松磷酸钠滴眼液。
[0058]
实施例6
[0059]
地塞米松原位液晶凝胶的组织学考察
[0060]
取实施例1所制得的地塞米松原位液晶凝胶进行组织学考察。本次实验共使用6只兔子(2.0
‑
3.0kg)，分为两组。将地塞米松原位液晶凝胶和地塞米松磷酸钠滴眼液每天滴入右眼下结膜囊3次，对侧眼滴入生理盐水(50μl)，作为阴性对照。实验一周后，对兔子实施安
乐死，取出眼球，然后将眼球放入4％多聚甲醛固定液中进行固定。随后，进行石蜡包埋切片并进行h&e染色，用光学显微镜观察角膜、虹膜和视网膜的变化并拍照。
[0061]
地塞米松原位液晶凝胶的组织学考察结果如图4所示，原位液晶凝胶和滴眼液组的角膜上皮细胞和基质层结构没有明显变化。同时对虹膜和视网膜无明显刺激。因此，认为原位液晶凝胶具有良好的生物相容性，可用于眼部药物。
[0062]
实施例7
[0063]
地塞米松原位液晶凝胶的刺激性评估
[0064]
取实施例1所制得的地塞米松原位液晶凝胶进行眼部刺激性考察。眼刺激性检查(draize试验)目的是确定制剂的安全性。共9只雌性新西兰白化兔(2.0
‑
3.0kg)被分成三组，每组三只兔子。右眼下结膜囊内滴入50mg地塞米松原位液晶凝胶和100μl滴眼液，左眼滴入生理盐水(0.9％nacl)作为阴性对照。在1、2、4、12、24、48和72小时用裂隙灯检查兔子是否有任何发红、充血和分泌物的迹象。长期刺激试验与单剂量眼刺激试验相同，但持续7天。
[0065]
在兔眼中应用地塞米松原位液晶凝胶后的draize测试结果显示该配方具有出色的眼部耐受性。虽然在原位液晶凝胶组中观察到结膜充血，但与滴眼液组没有显着差异。在单剂量或长期眼刺激试验中，所有制剂的总分在0到3之间(表2)。这些结果表明原位液晶凝胶的刺激性较小，地塞米松原位液晶凝胶可被认为是一种安全的眼科给药方式。
[0066]
表2改良draize测试结果(n＝3)
[0067][0068]
实施例8
[0069]
地塞米松原位液晶凝胶的角膜滞留时间考察
[0070]
取实施例1所制得的地塞米松原位液晶凝胶进行角膜滞留时间的考察。滴眼液的生物利用度低主要是由于正常的生理活动，如眨眼和泪液周转。因此，可以通过延长药物在眼表的停留时间来提高药物的生物利用度。通过将一定量的荧光素(1％,w/w)添加到制剂的水相中，形成负载荧光素的原位液晶凝胶。同时，使用载1wt％的荧光素溶液作为对照。最后，使用荧光灯在预定时间检测荧光素的强度。
[0071]
地塞米松原位液晶凝胶的角膜保留时间结果如图5所示，地塞米松原位液晶凝胶在兔眼的保留时间超过4个小时，远远长于滴眼液的眼部保留时间。
[0072]
实施例9
[0073]
地塞米松原位液晶凝胶的房水药动学研究
[0074]
取实施例1所制得地塞米松原位液晶凝胶进行房水药动学研究。六只健康的新西兰白兔(2.0
‑
3.0kg)被用作动物模型来评估药物在房水中的药代动力学。将家兔随机分为2组，每组3只。50mg的制剂和100μl滴眼液用于兔子眼睛的下结膜囊。为使药物充分接触角膜，给药后轻轻合上眼睑10秒。使用1ml注射器在预定时间点(0.17、0.33、0.50、0.75、1、2、4、6、8、10和12小时)从眼睛中收集100μl房水样本。
[0075]
将房水与300μl乙腈混合，涡旋1分钟去除蛋白质，然后高速离心10分钟(4000rpm/min)。使用hplc技术分析房水中dex浓度。所有药代动力学数据分析均使用das 2.0进行。
[0076]
表3局部给药后的房水药动学参数(n＝3)
[0077][0078]
*
p<0.05,与滴眼液相比有显著性差异，
**
p<0.01,与滴眼液相比有显著性差异
[0079]
地塞米松在兔房水中的浓度
‑
时间曲线如图6所示，药代动力学参数汇总在表3中。滴眼液在0.5小时内达到c
max
，4小时后药物浓度无明显变化。证明其生物利用度低，治疗效果有限。但制剂组在前4h为快速蓄积过程，c
max
为滴眼液的1.78倍。结果显示制剂组的平均保留时间(mrt)(4.435
±
0.24h)为滴眼液(2.568
±
0.33h)的1.72倍，证明液晶凝胶可以持续释放。地塞米松原位液晶凝胶的auc0→
12h
值是地塞米松磷酸钠滴眼液的5.26倍，这可能表明地塞米松原位液晶凝胶具有更高的生物利用度。
[0080]
实施例10
[0081]
地塞米松原位液晶凝胶制剂，制备组分由62mg的单油酸甘油酯、0.5mg的地塞米松、27mg的吐温80和3μl注射用水组成。制备步骤如下：
[0082]
(1)精密称取62mg单油酸甘油酯在37℃下水浴加热作为油相。
[0083]
(2)精密称取0.5mg地塞米松、27mg吐温80、3μl注射用水在水浴条件下加热至药物地塞米松溶解作为水相。
[0084]
(3)将水相加入到油相中，加入后快速涡旋至无色透明，即得到地塞米松原位液晶凝胶制剂。
[0085]
实施例11
[0086]
地塞米松原位液晶凝胶制剂，制备组分由68mg的单甘酯、1.5mg的地塞米松、35mg的甘油和5μl注射用水组成。制备步骤如下：
[0087]
(1)精密称取68mg单甘酯在58℃下水浴加热作为油相。
[0088]
(2)精密称取1.5mg地塞米松、35mg甘油、5μl注射用水在水浴条件下加热至药物地塞米松溶解作为水相。
[0089]
(3)将水相加入到油相中，加入后快速涡旋至无色透明，即得到地塞米松原位液晶凝胶制剂。
[0090]
综上所述，本发明采用能够自组装形成稳定溶致液晶的两亲性脂质材料，实现了地塞米松的高效眼部应用，具有给药方便，滴入眼部后迅速胶凝的特点，同时安全、无刺激，生物黏附性好，眼部滞留时间长，从而减少给药频率，提高药物的生物利用度，可增强地塞米松治疗糖尿病视网膜病变的疗效。
[0091]
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。