一种羊肚菌菌种保藏及活化方法与流程

1.本发明涉及菌种保藏技术领域，特别是指一种羊肚菌菌种保藏活化方法。


背景技术：

2.目前羊肚菌的栽培模式主要为土壤直接播种发菌，在适当的时间节点补充外源营养的做法，栽培方法简单易行，有的栽培者戏称“如种大白菜”一样简单。但发菌的关键是菌种，羊肚菌有别于其他食用菌，属于子囊菌门、盘菌纲，其特点是繁殖迅速，在正常温度条件下试管种4
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6天即可满管(香菇等需要10—15天才能满管)。但羊肚菌老化退化也快，在0
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4℃条件下最多可保存30天，在室温条件下只能保存8
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10天；且老化退化的菌种栽培很少出菇或不出菇。
3.据业内相关人士统计，2015/2016年度，全国栽培总量为25000多亩，只有40％左右盈利或保本，有60％为亏本，其主要原因就是菌种的问题。再者，其他食用菌如香菇等选育一个好品种，可连续使用5
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8年，如果保存方法得当，则使用年限更长，而羊肚菌则不然，一般都是当年分离选育，当年使用，如要做出菇试验，又会错过下一年度的播种时间，上一年保存的菌种根本不敢使用，并有很多人得到了深刻的教训。
4.目前羊肚菌菌种的保藏形式还是沿用其他食用菌菌种的保藏方法，主要有：斜面保藏法、蒸馏水保藏法、矿物油保藏法、滤纸保藏法、冷冻干燥法、液氮超低温保藏法等，但应用效果不是很理想；就现在国内羊肚菌的研究“大家”还一直强调必须当年分离当年应用，但是当年分离的菌种没有经过出菇试验，很难保证栽培的成功率，这就违背了正常食用菌的育种原理；因此羊肚菌菌种保藏是羊肚菌产业发展的瓶颈。


技术实现要素：

5.本发明提出了一种羊肚菌菌种保藏及活化方法，采用天然土壤添加部分辅助材料作为羊肚菌菌丝载体，利用冷冻模式令羊肚菌菌丝休眠，在解除休眠后保证其正常的活性和生物学特性，达到羊肚菌菌种可连续使用的目的。
6.本发明的技术方案是这样实现的：
7.一种羊肚菌菌种保藏及活化方法，包括以下步骤：
8.(1)制作菌种保藏培养基；
9.取适生土壤，伴入草木灰和粒径1mm大沙粒，加水调至含水量28％，灌装入试管中，装入量为试管长度的1/3，表面整平，但禁止压实；硅胶塞风口，打捆后牛皮纸封盖，进行高压灭菌；
10.(2)接种培养；
11.在无菌条件下，接入菌种于试管中后封闭试管，放入生化培养箱中进行培养，发菌条件为置于18
±
1℃进行培养，直至羊肚菌菌丝长满试管；其中，菌种接入时接于土壤培养基的表面；
12.(3)菌种预处理；
13.当羊肚菌菌丝基本长满试管时，放入0
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4℃的冰箱中进行预冷处理，处理时间为48小时；
14.(4)冷冻保藏；
15.预处理时间达到48小时后，将试管移至
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18～
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20℃的冷冻冰箱中进行冷冻保存；
16.(5)解冻活化
17.待需要时，将在冷冻冰箱中保存的试管移入0
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4℃的冰箱中进行解冻，解冻时间为48小时；解冻程序完成后，再将试管移入18
±
1℃的生化培养箱中进行活化处理，活化时间为48小时，然后将保藏种转入活化培养基上培养，长满的菌种即可使用。
18.优选的，所述步骤1中培养基按质量百分比：土壤80％、草木灰10％、大沙粒10％。
19.优选的，所述步骤2接入菌种为待保藏母种在长满试管48小时之内的健壮菌种。
20.本发明有益效果：
21.本发明提出的羊肚菌菌种保藏及活化方法，采用适生土壤作为羊肚菌菌种保藏培养基的主要原料，辅以草木灰、沙粒等进行菌丝的培养，通过冷冻预处理及冷冻的方法进行保藏，在需要时再进行菌种活化后，活化后的羊肚菌菌种可达到菌丝生长正常，出菇正常，产量亩产150kg以上，进而可有效推动羊肚菌产业的稳定、健康发展。
具体实施方式
22.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.本发明一种羊肚菌菌种保藏及活化方法，包括以下步骤：
24.(1)制作菌种保藏培养基；
25.取适生土壤，伴入草木灰和大沙粒，加水调至含水量28％，灌装入试管中，装入量为试管长度的1/3，表面整平，但禁止压实；硅胶塞风口，打捆后牛皮纸封盖，进行高压灭菌；
26.(2)接种培养；
27.在无菌条件下，接入菌种于试管当后封闭试管，放入生化培养箱中进行培养，发菌条件为置于18
±
1℃进行培养，直至羊肚菌菌丝长满试管；其中，菌种接入时接于土壤培养基的表面；
28.(3)菌种预处理；
29.当羊肚菌菌丝基本长满试管时，放入0
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4℃的冰箱中进行预冷处理，处理时间为48小时；
30.(4)冷冻保藏；
31.预处理时间达到48小时后，将试管移至
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18～
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20℃的冷冻冰箱中进行冷冻保存；
32.(5)解冻活化
33.待需要时，将在冷冻冰箱中保存的试管移入0
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4℃的冰箱中进行解冻，解冻时间为48小时；解冻程序完成后，再将试管移入18
±
1℃的生化培养箱中进行活化处理，活化时间为48小时后即可使用。
34.根据实验研究发现，羊肚菌的菌丝在土壤中能耐
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20℃的低温而不死亡，且在此温
度下其代谢水平降至最低。因此本发明优选冷冻保藏的温度为18
±
1℃，是根据野生羊肚菌菌丝的生长最低温度来设计的。
35.优选的，所述步骤1中培养基按质量百分比：土壤80％、草木灰10％、大沙粒10％。
36.优选的，所述步骤2接入菌种为待保藏母种在长满试管48小时之内的健壮菌种。
37.实施例对比实验
38.1.材料与方法
39.1.1材料供试菌株选择希才公司选育驯化的六妹系列品种h2。
40.1.2方法
41.1.2.1 pda加富培养基斜面保藏法
42.1.2.2 pda加富培养基蒸馏水保藏法
43.1.2.3分离继代没经过低温保存的菌种
44.1.2.4冷冻休眠保藏法：按质量百分比：80％适生土壤，伴入10％的草木灰，10％的直径1mm大沙粒，加水调至含水量28％，
45.1.3活化母种培养基配方：按质量百分比：土豆16％、葡萄糖1.5％、草木灰1％、腐殖土1％、琼脂1.5％、水79％。
46.原种培养基配方：按质量百分比：麦粒35％、稻壳40％、麦麸12％、田园土10％、石膏2％、石灰1％、含水量60％。
47.2.试验结果
48.2.1扩繁母种情况
[0049][0050]
通过试验表明，通过上表可以看出，菌种在活化母种培养基上的萌发时间以试验最快，只有48小时；分离继代次之，为72小时；斜面保存方法再次之，为96小时，蒸馏水保存最差，为120小时才萌发；最快和最慢相比较相差72小时。菌丝生长速度斜面保存、蒸馏水保存和分离继代基本一样，都为0.625mm，但试验方法为0.78mm，相差0.155mm。各种保存方法的羊肚菌菌丝长势均较强壮浓密，唯独蒸馏水保存菌种显得较为稀疏。在150mm长的培养基上的菌丝满管时间以试验方法最快，只有144小时；分离继代次之，为192小时；斜面保存再次之，为216小时，蒸馏水保存菌种最慢，为240小时才满管；最快和最慢相比较相差96小时。四种保存方法均有菌核出现，但有多少之分，试验和分离继代的菌种出现较多，而斜面和蒸馏水保存则较少。菌核形成时间试验最早，为192小时；分离继代次之，为210小时；斜面保存再次之，为164小时，蒸馏水保存最晚，为288小时；最早和最晚相差96小时，差异性显著。
[0051]
2.2扩繁原种、栽培种情况
[0052][0053]
通过上表可以看出，不同保存方法保存的菌种在培养基上的萌发时间以试验最快，只有2天；分离继代和斜面保存次之，为3天；蒸馏水保存方法保存的菌种最慢，为4天才萌发；最快和最慢相比较相差2天。供试各种保存方法保存的菌种的羊肚菌菌丝长势均较强壮，唯独蒸馏水保存菌种显得较为稀疏。各种保存方法保存的菌种的菌丝满袋时间以试验最快，只有19天；分离继代次之，为23天；斜面保存再次之，为25天；蒸馏水保存菌种最慢，为30天才满袋；最快和最慢相比较相差11天。各种保存方法保存的菌种均有菌核出现，但有多少之分，试验和分离继代菌种出现较多，而斜面保存和蒸馏水保存则较少。菌核形成时间以试验最早，为19天；分离继代次之，为23天；斜面保存再次之，为25天；蒸馏水保存最晚，为30天；最早和最晚相差11天，差异性显著。各种保存方法保存的菌种，在扩繁的过程中均没有出现污染现象。
[0054]
2.3栽培出菇试验
[0055]
选在同一羊肚菌生产棚室，在相同的土壤条件、气候条件、栽培方法等，对以上四种保藏方法所扩繁的菌种进行生产出菇对比试验，主要考核指标包括床面分生孢子出现时间、分生孢子满床时间、分生孢子的疏密、外源营养袋摆放后菌丝进入的时间、外源营养袋菌丝满袋时间、有无黄褐色的菌核形成、在适温条件下形成针状原基的时间、形成菇蕾到采收的时间及羊肚菌鲜品产量等指标。
[0056]
试验结果见下表：
[0057][0058]
根据以上数据综合分析认为，菌核形成时间早、菌核数量多、菌丝活力旺盛为羊肚菌菌株优良的重要因素，是生产产量和产品质量的保障。生产出菇试验证明，菌种保藏方法可直接影响到栽培的成功与失败，蒸馏水保存和斜面保藏的菌种几乎没出，就是失败，这两种常规保藏方法不可行。新分离继代菌种虽然产量还能说得过去，但当年分离当年使用，不仅操作繁琐且失误率较高，另外在我国北方地区使用此方法时间不够，因此此方法并不实用。故此试验的羊肚菌保藏方法有效的解决了羊肚菌保藏的困难，且可使羊肚菌鲜品产量达到每亩150kg以上。
[0059]
综上所述，本发明提出的羊肚菌菌种保藏及活化方法，利用冷冻模式令羊肚菌菌丝休眠，在解除休眠后保证其正常的活性和生物学特性，达到羊肚菌菌种可连续使用的目的。
[0060]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。