一种通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法与流程

1.本发明属于抗体检测技术领域，具体为一种通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法。


背景技术：

2.如果蛋白有纯化标签并且是过表达的话就比较容易判断，一般纯化过程中通过sds电泳不同组分确定目的蛋白。如果没有纯化标签，一般是通过sds电泳或者双向电泳和蛋白活性实验(如果蛋白有生物活性，比如酶)，或者通过western blot来检测目的蛋白。
3.但是常见的检测方法其分离率低、时间长，成本高不适于临床应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于：为了解决上述提出的问题，提供一种通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法。
5.本发明采用的技术方案如下：一种通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法，所述通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法包括以下步骤：
6.s1:准备50mmph6.0的活化buffer，醋酸或mesbuffer更合适；用活化buffer悬浮微球，使其浓度为1％w/v；
7.s2:每1ml微球悬液加入20mg的edc，室温孵育20分钟，然后再次加入20mg/ml的edc，继续室温孵育20分钟；
8.s3:离心或超滤，用等体积的包被缓冲液清洗两次微球，最后悬浮在包被缓冲液中；
9.s4:用包被缓冲液溶解抗体到1mg/ml，包被缓冲液ph7～9，浓度为50mm～100mm；
10.s5:将抗体快速加入的搅拌中的微球悬液中，持续搅拌，室温孵育2～5小时；
11.s6:每1ml反应溶液中加入2.5ul的乙醇胺，持续搅拌并室温孵育10分钟；
12.s7:离心或超滤，用储存缓冲液悬浮，重复两次，移除未结合的抗体和乙醇胺，得到荧光微球抗体；
13.s8:进行目的蛋白多抗的制备，先进行p1重组蛋白的提取与纯化，纯化的重组蛋白加等体积弗氏完全佐剂免疫偶联抗体，多点皮下注射免疫，以弗氏不完全佐剂加强免疫3次后颈动脉采血获得检测用的偶联抗体，以elisa法测定抗体效价；
14.s9:进行igg的提取纯化，对采集的免疫血清用硫酸铰沉淀法粗提免疫球蛋白，取免疫血清加入饱和(nh4)2so4使其成20％溶液，以除去纤维蛋白；吸取离心上清加入饱和(nh4)2so4溶液；使之成为50％溶液以除去白蛋白；
15.s10:之后进行抗体标记与纯化；在1.5ml的微量离心管中加入50μl的量子点，然后加入1oμledc和10μlsulfo—nhs溶液，加磷酸盐缓冲液补至800μl，不停地混合溶液，室温下反应20min；加入纯化的抗体200μl，37℃振荡反应2h；加入100μl甘氨酸，封闭量子点上未反应的羧基；将偶联反应所得到的产物4℃，12000r/min离心20min，所得沉淀即为纯化的偶联
有荧光微球的p1目的蛋白抗体；
16.s11:进行量子点偶联产物荧光效率测定：用荧光分光光度计测定量子点标记的抗体，通过标记物荧光强度的测定，判定抗体一量子点的偶联反应是否改变量子点的荧光效率；
17.s12:进行偶联产物的免疫反应性测定，取目的蛋白全菌抗原2μl；滴于硝酸纤维素膜上，4℃干燥后用bsa—pbs4℃封闭过夜；用pbs洗膜3次，干燥后，在含有包被目的蛋白抗原处分别加入量子点偶联
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p1重组蛋白抗体、量子点、p1重组蛋白抗体和pbs反应；37℃作用2h，反应后用pbs洗3次，在紫外灯下观察结果；
18.s13使用量子点偶联产物检测目的蛋白抗原，取对数生长期培养物，以12000r/min的速度离心30min，弃上清，沉淀加入0.01mol/l的pbs溶液，充分混匀，离心洗涤3次，收集沉淀反复冻融3次后，即为目的蛋白菌体抗原，加入0.01mol/l的pbs制备菌悬液，取5μl菌悬液滴加于玻片上，室温自然干燥，用
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20℃预冷的丙酮固定；将1：40稀释的偶联有p1重组蛋白多克隆抗体的量子点滴加入上述抗原片上，于37℃湿盒中作用45min，用pbs洗涤3次，自然干燥，滴加碱性缓冲甘油，加盖玻片封片，在荧光显微镜下观察；
19.s14:分别将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、甲型链球菌和肺炎链球菌抗原按步骤s11、s12、s13的操作，以pbs作为空白对照进行检测，最后进行试验结果的分析，从而结束整个实验过程
20.在一优选的实施方式中，所述步骤s3中，移除未结合的化合物或蛋白，如果颗粒直径大于0.2um，可以通过离心的方法，微球可以重新悬浮，然后搅拌，接着温和的超声分散。离心力不宜过大，这样会导致微球不易分散。也可以用超滤或透析来纯化。当用超滤时，滤膜孔径足够大，使得游离的蛋白能自由的通过滤膜。用于清洗微球的buffer和storage buffer一样。用于清洗的buffer的任何缓冲液成分及ph的改变，都会引起蛋白的脱落。
21.在一优选的实施方式中，所述步骤s4中，reaction buffer的组成根据蛋白种类的不同而改变，常用buffer有醋酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、mes缓冲液。蛋白在等电点附近更易于吸附到微球上，因为在等电点附近，蛋白表面会有更多的疏水位点暴露出来。在这种情况下，抗体也更紧密，因此需要更多的抗体用于标记到微球上。然而，最终reaction buffer的选择，需要考虑最终抗体微球复合物的生物活性，因此，几个不同浓度的抗体和不同ph的反应buffer进行优化选择。起始实验，反应buffer的离子强度在25～50mm。
22.在一优选的实施方式中，所述步骤s5中，蛋白溶液在快速的搅拌下，快速加入到微球悬液中。小体积的话，可以进行斡旋混合。当大体积时，在烧瓶或烧杯里搅拌剧烈些，蛋白溶液快速加入到漩涡中间。
23.在一优选的实施方式中，所述步骤s6中，加入乙醇胺，可以和加入蛋白反应后多余的羧基位基团反应。
24.在一优选的实施方式中，所述步骤s7中，移除未结合的化合物或蛋白，如果颗粒直径大于0.2um，可以通过离心的方法，微球可以重新悬浮，然后搅拌，接着温和的超声分散。离心力不宜过大，这样会导致微球不易分散。也可以用超滤或透析来纯化。当用超滤时，滤膜孔径足够大，使得游离的蛋白能自由的通过滤膜。用于清洗微球的buffer和storage buffer一样。用于清洗的buffer的任何缓冲液成分及ph的改变，都会引起蛋白的脱落。
25.在一优选的实施方式中，所述步骤s9中，除去白蛋白之后再加入饱和(nh4)2so4溶液。使其成33％溶液从而除去类球蛋白，沉淀溶于pbs中即为粗提mp多克隆抗体。取na0h处理后的deae—sephadexa一50装柱，用o.01mol/lpbs平衡至i，h7.4后加入硫酸铵粗提免疫球蛋白，然后用洗脱液进行洗脱并分管收集，用紫外分光光度计测纯化抗体的浓度。
26.在一优选的实施方式中，所述步骤s11中，试验所用激发光为488nm，扫描605nm的发射波谱。
27.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
28.1、本发明中，以量子点偶联产物荧光效率测定、偶联产物的免疫反应性测定和量子点偶联产物检测目的蛋白抗原的方式通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白，从而达到了更加快速准确的检测方式，从而提高了检测速率，为人们的研究带来了更多的便利。
具体实施方式
29.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.实施例：
31.一种通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法，所述通过将荧光微球偶联抗体检测目的蛋白的方法包括以下步骤：
32.s1:准备50mmph6.0的活化buffer，醋酸或mesbuffer更合适；用活化buffer悬浮微球，使其浓度为1％w/v；
33.s2:每1ml微球悬液加入20mg的edc，室温孵育20分钟，然后再次加入20mg/ml的edc，继续室温孵育20分钟；
34.s3:离心或超滤，用等体积的包被缓冲液清洗两次微球，最后悬浮在包被缓冲液中；步骤s3中，移除未结合的化合物或蛋白，如果颗粒直径大于0.2um，可以通过离心的方法，微球可以重新悬浮，然后搅拌，接着温和的超声分散。离心力不宜过大，这样会导致微球不易分散。也可以用超滤或透析来纯化。当用超滤时，滤膜孔径足够大，使得游离的蛋白能自由的通过滤膜。用于清洗微球的buffer和storage buffer一样。用于清洗的buffer的任何缓冲液成分及ph的改变，都会引起蛋白的脱落；
35.s4:用包被缓冲液溶解抗体到1mg/ml，包被缓冲液ph7，浓度为50mm；步骤s4中，reaction buffer的组成根据蛋白种类的不同而改变，常用buffer有醋酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、mes缓冲液。蛋白在等电点附近更易于吸附到微球上，因为在等电点附近，蛋白表面会有更多的疏水位点暴露出来。在这种情况下，抗体也更紧密，因此需要更多的抗体用于标记到微球上。然而，最终reaction buffer的选择，需要考虑最终抗体微球复合物的生物活性，因此，几个不同浓度的抗体和不同ph的反应buffer进行优化选择。起始实验，反应buffer的离子强度在25mm；
36.s5:将抗体快速加入的搅拌中的微球悬液中，持续搅拌，室温孵育2小时；步骤s5中，蛋白溶液在快速的搅拌下，快速加入到微球悬液中。小体积的话，可以进行斡旋混合。当大体积时，在烧瓶或烧杯里搅拌剧烈些，蛋白溶液快速加入到漩涡中间；
37.s6:每1ml反应溶液中加入2.5ul的乙醇胺，持续搅拌并室温孵育10分钟；步骤s6中，加入乙醇胺，可以和加入蛋白反应后多余的羧基位基团反应；
38.s7:离心或超滤，用储存缓冲液悬浮，重复两次，移除未结合的抗体和乙醇胺，得到荧光微球抗体；步骤s7中，移除未结合的化合物或蛋白，如果颗粒直径大于0.2um，可以通过离心的方法，微球可以重新悬浮，然后搅拌，接着温和的超声分散。离心力不宜过大，这样会导致微球不易分散。也可以用超滤或透析来纯化。当用超滤时，滤膜孔径足够大，使得游离的蛋白能自由的通过滤膜。用于清洗微球的buffer和storage buffer一样。用于清洗的buffer的任何缓冲液成分及ph的改变，都会引起蛋白的脱落；
39.s8:进行目的蛋白多抗的制备，先进行p1重组蛋白的提取与纯化，纯化的重组蛋白加等体积弗氏完全佐剂免疫偶联抗体，多点皮下注射免疫，以弗氏不完全佐剂加强免疫3次后颈动脉采血获得检测用的偶联抗体，以elisa法测定抗体效价；
40.s9:进行igg的提取纯化，对采集的免疫血清用硫酸铰沉淀法粗提免疫球蛋白，取免疫血清加入饱和(nh4)2so4使其成20％溶液，以除去纤维蛋白；吸取离心上清加入饱和(nh4)2so4溶液；使之成为50％溶液以除去白蛋白；步骤s9中，除去白蛋白之后再加入饱和(nh4)2so4溶液。使其成33％溶液从而除去类球蛋白，沉淀溶于pbs中即为粗提mp多克隆抗体。取na0h处理后的deae—sephadexa一50装柱，用o.01mol/lpbs平衡至i，h7.4后加入硫酸铵粗提免疫球蛋白，然后用洗脱液进行洗脱并分管收集，用紫外分光光度计测纯化抗体的浓度；
41.s10:之后进行抗体标记与纯化；在1.5ml的微量离心管中加入50μl的量子点，然后加入1oμledc和10μlsulfo—nhs溶液，加磷酸盐缓冲液补至800μl，不停地混合溶液，室温下反应20min；加入纯化的抗体200μl，37℃振荡反应2h；加入100μl甘氨酸，封闭量子点上未反应的羧基；将偶联反应所得到的产物4℃，12000r/min离心20min，所得沉淀即为纯化的偶联有荧光微球的p1目的蛋白抗体；
42.s11:进行量子点偶联产物荧光效率测定：用荧光分光光度计测定量子点标记的抗体，通过标记物荧光强度的测定，判定抗体一量子点的偶联反应是否改变量子点的荧光效率；步骤s11中，试验所用激发光为488nm，扫描605nm的发射波谱；
43.s12:进行偶联产物的免疫反应性测定，取目的蛋白全菌抗原2μl；滴于硝酸纤维素膜上，4℃干燥后用bsa—pbs4℃封闭过夜；用pbs洗膜3次，干燥后，在含有包被目的蛋白抗原处分别加入量子点偶联
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p1重组蛋白抗体、量子点、p1重组蛋白抗体和pbs反应；37℃作用2h，反应后用pbs洗3次，在紫外灯下观察结果；
44.s13使用量子点偶联产物检测目的蛋白抗原，取对数生长期培养物，以12000r/min的速度离心30min，弃上清，沉淀加入0.01mol/l的pbs溶液，充分混匀，离心洗涤3次，收集沉淀反复冻融3次后，即为目的蛋白菌体抗原，加入0.01mol/l的pbs制备菌悬液，取5μl菌悬液滴加于玻片上，室温自然干燥，用
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20℃预冷的丙酮固定；将1：40稀释的偶联有p1重组蛋白多克隆抗体的量子点滴加入上述抗原片上，于37℃湿盒中作用45min，用pbs洗涤3次，自然干燥，滴加碱性缓冲甘油，加盖玻片封片，在荧光显微镜下观察；
45.s14:分别将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、甲型链球菌和肺炎链球菌抗原按步骤s11、s12、s13的操作，以pbs作为空白对照进行检测，最后进行试验结果的分析，从而结束整个实验过程。
46.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
47.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。